Summary
O objetivo deste relato é descrever os protocolos para derivar o epitélio retinal pigmento (RPE) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células usando diferentes tamanhos de corpos embrióides.
Introduction
As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são um tipo de célula-tronco pluripotentes derivadas através da reprogramação de células adultas com fatores extrínsecos 1. Em contraste, as células estaminais embrionárias (CES), um outro tipo de célula de tronco pluripotente, são gerados a partir da massa celular interna do blastocisto 2-3. Apesar de suas origens diferentes, as células iPS e CES são comparáveis em sua capacidade ilimitada para replicar in vitro e na sua capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula 4-5. Estas características de células iPS torná-los os candidatos ideais para aplicações em medicina regenerativa personalizado. Os recentes esforços de pesquisa estão focados no desenvolvimento de protocolos de diferenciação robustos para a produção de células adultas especializadas, incluindo epitélio pigmentar da retina (RPE) 6-11.
Para potenciais aplicações clínicas de células iPS derivadas, uma diferenciação direcionado para esse tipo específico de célula é essencial. Existem vários métodospublicado pela diferenciação dirigida de ambas as células iPS CES e em RPE que varia muito em sua eficiência 6-7, 12-16. Nós ainda não sabemos muitos dos eventos moleculares que governam o destino de células / tecidos durante o desenvolvimento ou diferenciação. Nos últimos anos, foram feitos esforços para desenvolver o protocolo de diferenciação que pode imitar o desenvolvimento embrionário, tanto quanto possível. Durante a fase de blastocisto, a população não confirmadas de células-tronco estão juntos em um microambiente tridimensional. Assim, várias estratégias foram aplicados para tornar as células CES / iPS reunidos e crescê-las em três dimensões. Estes agregados de células-tronco são chamados de corpos embrióides (EBS). Estudos têm mostrado que a EB diferenciação de células estaminais imitar fase precoce do desenvolvimento do embrião e pode dar origem espontaneamente a endoderme primitiva na sua superfície exterior. Mais tarde, como EB desenvolvimento progride, os fenótipos de células diferenciadas de todas as três linhagens germinais aparecer 17-18. Therefore, o EBS protocolos de diferenciação com base têm atraído muita atenção para a diferenciação in vitro de células ESC / IPS e é um bom candidato para a geração EPR a partir de células-tronco pluripotentes 13.
EB pode ser feita usando vários métodos de células ESC / IPS. Inicialmente, foram feitas EBs raspando as colónias aderentes e mantê-las em cultura em suspensão não-aderente. No entanto, esta abordagem produz população heterogénea de EBs que provoca baixa reprodutibilidade. Suspensão de cultura de células de queda e micropoco formação EBs baseado outras técnicas populares para formação EBs que produzem EBs homogêneos de tamanhos definidos que são altamente reprodutível. Além disso, a técnica de micropoços podem produzir grande número de agregados com menos esforço.
Diferenciação de células dentro EBS é regulada por um multiplex de pistas morfogénicos do microambiente extracelular e intracelular. Em contraste com a diferenciação em um monformato olayer, o EBS fornecer uma plataforma para montagem complexa de células e sinalização intercelular para ocorrer 17. Curiosamente, foi observado o número de células estaminais pluripotentes usados para fazer EBs individuais para influenciar o destino das células. Por exemplo, em um estudo diferenciação hematopoiética da CES humanos, observou-se que 500 células EB promoveu a diferenciação no sentido de linhagem mielóide enquanto que 1.000 células EB empurrado na direcção da linhagem eritróide 20. Em outro estudo, a EBS menores favoreceu diferenciação endoderme Considerando EB maiores promovidas no sentido de neuro-ectoderma diferenciação 11, 17.
Estes estudos anteriores sugerem fortemente que o número de células ESC / IPS usados para fazer EBs individuais afetam as EBs diferenciação com base para quaisquer tipos de células. No entanto, a nosso conhecimento, não há estudos atuais que elucidaram o impacto do tamanho EBs em sua propensão de se diferenciar em direção RPE. O objetivo deste estudo é caracterizar a influência deTamanho EB em induzida células-tronco pluripotentes (IPS) - epitélio pigmentar da retina (iPS-RPE) diferenciação e para identificar o número célula ideal para fazer as EBs para a diferenciação dirigida para RPE linhagem.
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Protocol
1. Preparação de Culturas Reagentes e placas de cultura
- Prepare meio de cultura livre de células-tronco-alimentador por adição de 100 ml de suplemento de 5x isento de soro a 400 ml de meio basal de células estaminais. O meio é estável a 4 ° C durante até 2 semanas e a -20 ° C durante 6 meses.
- Adicionar 10 mM solução de associado-ró, coiled-coil contendo proteína quinase (Rock) inibidor para comercialmente disponível corpo embryoid (EB) médio de formação (Y-27362).
- Prepare meio de diferenciação pela adição de 0,1 mM de β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 10% de substituição de soro nocaute (KSR) e 10 ug / ml de gentamicina a Modified Eagle Médium / Nutrient Mixture Dulbecco F-12 (DMEM / F12).
- Prepare meio iPS-RPE por adição de suplemento 1x N1, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 250 ug / ml de taurina, sal de sódio de 13 ng / ml triiodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, de 5 ug / ml de gentamicina e 15% de soro bovino fetal (FBS) <sup> 21 de Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEM). Ajustar o pH para 7,4.
- Preparar a solução estoque de sal de sódio triiodo-L-thyronine. Dissolve-se 1 mg de sal de sódio triiodo-L-tironina em 1 N de hidróxido de sódio por agitação suave. Adicionar 49 ml de MEM para fazer 50 ml de 20 ug / ml de sal de sódio triiodo-L-tironina. Preparar alíquotas e congelar a -20 ° C até ser necessário. Use volume adequado para atingir a concentração desejada em meio de cultura final.
- Preparar a solução de estoque de hidrocortisona. Solubiliza-se 1 mg de hidrocortisona em 1 ml de etanol a 100% por agitação suave. Adicionar 19 ml de MEM para fazer 20 ml de 50 ug / ml de solução de estoque de hidrocortisona. Alíquotas e congelamento a -20 ° C até ser necessário. Use volume apropriado para atingir a concentração desejada no meio de cultura final.
- Preparar uma solução de trabalho de dispase a 1 mg / ml em DMEM / F12.
- Preparação das placas de matriz revestido
- Prepare matriz proteína extraída da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucélulas de sarcoma si em DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Bata de cada poço de uma placa de 6 poços com 1 ml da solução de matriz. Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante 1 h.
- Após a incubação de 1 hora, aspirar o excesso de DMEM / F12. Adicionar 0,5 ml de meio de cultura de células estaminais livre de alimentador para evitar a secagem dos poços. As placas de matriz revestida está pronto para uso.
- Para preparar as placas de micropoços, por lavagem de cada poço com 2 ml de DMEM / F12. Remover DMEM / F12 e adicionar 0,5 ml de meio de formação de EB suplementado com inibidor da rocha a cada poço. Centrifugar a placa a 2000 xg durante 5 minutos para remover quaisquer bolhas de ar.
- Preparar tampão de coloração de FACS através da mistura de 2% de FBS e 0,09% de azida de sódio em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Ajustar o tampão de pH 7,4.
- Preparar a solução de neutralização de tripsina por adição de 10% FBS para DMEM / F12.
2. iPS Cultura
- Antes da semeadura de células iPS, warm-tronco meio de cultura de células sem alimentador de até 37 ° C, e têm a matrix placas revestidas pronto.
- Rapidamente descongelar as células iPS IMR90-1 em um banho de água a 37 ° C. Em seguida, retire o crio-frasco do banho de água e limpe o frasco com etanol 70%. Transferem-se as células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 2 ml para minimizar a quebra de aglomerados de células.
- Adicionar 5 ml de meio de cultura de células-tronco quente livre de alimentador para as células, gota a gota e misture delicadamente. Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
- Ressuspender cuidadosamente os aglomerados de células em 2 ml de meio de cultura de células-tronco sem alimentador e semear os aglomerados de células nos poços de placa revestida com matriz. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO2, 95% de humidade.
- Alterar o meio de cultura de células iPS diária. Observe colônias indiferenciadas cinco a sete dias após a semeadura. Verifique a existência de colônias indiferenciadas que estão prontos para passagem (colônias com um centro denso) sob um microscópio de luz.
3. Passaging de iPS Cells
- A passagem das células iPS antes de começar, aqueça a solução dispase, DMEM / F12 e haste meio de cultura de células sem alimentador de 37 ° C em banho-maria.
- Antes passaging células iPS, remova todas as áreas de diferenciação por raspagem da área e aspirar o meio. Lavar cuidadosamente as células iPS com 2 ml de DMEM / F12.
- Adicionar 1 ml de 1 mg / ml de dispase a cada poço e incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar o dispase e lavar cuidadosamente as colônias de células com 2 ml de DMEM / F12 duas vezes. Depois de enxaguar, adicionar 2 ml de meio de cultura livre de células-tronco-alimentador para cada poço.
- Usando uma pipeta de 5 ml raspe as colônias da placa para formar aglomerados de células. Transfira os aglomerados de células isoladas para um tubo cônico de 15 ml. Adicionar haste meio de cultura de células sem alimentador suficiente para semear a próxima passagem de células.
4. Geração da EBS Usando Microplacas
- Preparação de uma suspensão de células isoladas de células iPS
- Remover o medium a partir de células iPS e lave as células iPS com 2 ml de DMEM / F12. Adicionar 750 ul de Accutase para células iPS em cada poço da placa de 6 poços. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO2 para permitir que as células a separar da placa (cerca de 5-10 minutos).
- Usar uma pipeta para dissociar suavemente as células restantes e a separar quaisquer células restantes na superfície da placa. Transferem-se as células para um tubo cónico de 50 ml. Lavar a placa com 5 ml de DMEM / F12 e combinar o enxaguado DMEM / F12 com as células no tubo cónico. Passar a suspensão de células através de um coador de células de 40 mm para remover quaisquer possíveis aglomerados de células residuais.
- Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente para remover a Accutase. Ressuspender o sedimento de células em meio de formação de EB modo que a concentração de células é de cerca de 0,5-1,0 x 10 7 células / ml.
- Determinar o número de células viáveis por contagem das células com azul de tripano e um hemocitómetro.
- Adjusting densidade celular em micropoços para formar EBs controlada de tamanho
- Ajustar o número de células para cada poço da placa de micropoços para gerar os desejados tamanhos EB. Adicionar células aos micropoços das placas preparadas no passo 1.9, distribuir uniformemente as células por suavemente pipetando as células várias vezes.
NOTA: Número de células por poço requeridas = o número desejado de células por EB x número de micropoços por poço. - Ajustar a forma formação EB suplementado com inibidor de rocha nos poços para um volume final de 2,0 ml. Redistribuir as células com cuidado pipetando cada poço. Centrifugar as placas de micropoços a 100 xg durante 3 min. Colocar as placas em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 24 horas.
- Ajustar o número de células para cada poço da placa de micropoços para gerar os desejados tamanhos EB. Adicionar células aos micropoços das placas preparadas no passo 1.9, distribuir uniformemente as células por suavemente pipetando as células várias vezes.
- EBs colheita das placas de micropoços
- Colheita de EBs micropoços por meio de pipetagem no poço cima e para baixo com uma micropipeta 1 ml para remover a maior parte dos CEs. Passar a suspensão através de uma célula EB 40 um invertidafiltro no topo de um tubo cónico de 50 ml para remover as células individuais.
- Lava-se a placa de micropoços 5 vezes com 1 ml de DMEM / F12 para remover todos os CEs. Recolha lavagens e passar por cima do filtro de células invertido. Vire filtro de células do lado direito para cima para um novo tubo de 50 ml. Recolha as EBs por lavagem com meio formação EB. Contagem EBS para determinar o rendimento.
5. chapeamento EBs e Iniciando Diferenciação
- Placa os CEs em matriz de proteína revestidas placas de seis poços (como no passo 1.8.1), a uma densidade de <1000 EB / poço em meio de formação de EB mais 10 uM de inibidor da rocha. Incubar as CEs a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade durante 24 horas.
- 24 horas após a EB chapeamento, substitua-o por meio de diferenciação para iniciar a diferenciação. Mudar metade do meio de diferenciação em dias alternados até as células são recolhidas para análise posterior.
- Recolher amostras no dia 6, 17, 29 e 60 para realizar RT-PCR, immunocytochemistry e FACS para validar a expressão de genes e proteínas do EPR característicos.
6. Extração de RNA e PCR
- Extrai-se ARN a partir de amostras EB acordo com as instruções fornecidas no kit disponível comercialmente. Determinar a concentração de RNA usando um espectrofotómetro.
- Realizar a transcrição reversa em 100 ng de ARN total de acordo com o ARN em ADNc comercialmente disponível kit de transcrição reversa.
- Executar PCR com 10 ng de ADNc, utilizando os seguintes iniciadores (Tabela 1), a uma concentração de 10 pmol / 10 ng de cDNA. Definir a PCR como se segue: desnaturar o ADN, a 95 ° C durante 5 min, com 35 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min, seguido de um ciclo final de 72 ° C durante 10 min. Executar o produto de PCR num gel de agarose 1%.
7. Immunocytochemistry
- Lavar as CEs com PBS duas vezes à temperatura ambiente. Fixar as EBs na RT em 4% paraformaldehyde durante 10 min. Lavar uma vez com PBS à temperatura ambiente. Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C até ser utilizado para a coloração.
- No dia da coloração, tratar as células fixas com fixação e permeabilização reagentes. Incubar as amostras com a solução (10% de soro de cabra em solução de permeabilização) durante 1 h à TA bloqueio.
- Realizar imunoquímica em 10% de soro de cabra em solução de permeabilização utilizando os seguintes anticorpos primários nas diluições indicadas: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), e anti- ZO1 (1: 100). Incubar as amostras com anticorpos O / N correspondente a 4 ° C.
- No dia seguinte, remover o anticorpo primário a partir das células e lavar as amostras três vezes com PBS. Incubar as amostras com anticorpos secundários fluoróforos, durante 1 h à TA.
- Remover o anticorpo secundário a partir das células e lavar as amostras três vezes em PBS. Montar a tampa desliza sobre lâminas de vidro com meio de montagem contendo DAPI e permitir que as amostras para definir O / N em câmara escura.Usar um microscópio de fluorescência para visualizar a coloração.
8. Coloração para análise FACS
- Lavar as CEs cultivadas em PBS duas vezes. Incubar as CEs com 0,5 ml de 0,25% de tripsina, durante 5-10 minutos para se obter uma suspensão de célula única. Neutraliza-se a tripsina com uma solução de tripsina neutralizante (1 ml / poço).
- Transferir a suspensão de células individuais para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 600 xg durante 10 min.
- Descartar o sobrenadante e adicionar 10 ml de DMEM / F12 para as células no tubo. Inverter cuidadosamente para misturar as células. Centrifuga-se a 600 x g. Após centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de coloração de FACS.
- Contar o número total de células. Centrifugar a 600 xg por 10 min. Após centrifugação descarte sobrenadante. Fixar as células imediatamente por adição de 0,5 ml de paraformaldeído a 4%. Misture bem em vórtice suave. Incubar as células a 4 ° C durante 20 min.
- Centrifugar a 600 xg durante 10 min e remover osobrenadante. Vortex suavemente para perturbar o sedimento celular. Permeabilizar as células por adição de 1 ml de solução de permeabilização refrigeradas. Vortex suavemente para misturar e incubar em gelo durante 30 min.
- Centrifugar a 600 xg durante 10 min e remover o sobrenadante. Adicionar 3 ml de tampão de coloração de FACS e ressuspender. Repita este passo para mais uma vez. Ressuspender as células em tampão de coloração de FACS a uma concentração final de 5 x 10 6 células / ml.
- Transferir 100 ul da suspensão de células (0,5 x 10 6 células) para cada um de microcentrífuga tubos e adicionar o volume recomendado de anticorpo primário. Para Pax6, adicionam-se 5 ul de PE anti-Pax6 em 100 ul de suspensão de células. Para MITF, adicionam-se 5 ul de anti-MITF em 100 ul de suspensão de células.
- Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 60 min. Adicionar 3 ml de tampão de coloração de FACS. Misturar e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e repetir 8,16 por duas vezes adicionais.
- Para a coloração de MITF, incubar as células na Antibo secundáriody, de cabra anti-rato Alexa Fluor 488, a uma diluição de 1: 2000 durante 1 hora a 4 ° C. Para a coloração Pax6, evitar este passo.
- Lavam-se as células com 5 ml de tampão de coloração de FACS e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Repetir o processo por mais duas vezes.
- Ressuspender as células em 500 ul de tampão de coloração de FACS e vórtice suavemente para perturbar o sedimento celular. As amostras estão prontos para análise de citometria de fluxo.
9. iPS-RPE Isolamento e Cultura
- No dia 29, cuidadosamente cortadas à volta das colónias pigmentadas seleccionados a partir da placa de cultura utilizando uma pipeta de ponta de 200 ul. Transfira as colônias flutuantes para um tubo cônico de 15 ml. Centrifuga-se as colónias a 600 xg durante 10 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante.
- Ressuspender as colónias de células em 10 ml de DMEM / F12 e centrifugar a 600 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante.
- Prepara-se uma suspensão de células individuais por incubação das colónias com 2 ml de tripsina a 0,25% a 37 ° C durante 7-10 min. Gentilmente vortex a suspensão de células de dissociar as colônias.
- Neutralizar a tripsina, adicionando 2 ml de meio iPS-RPE. Centrifugar a 600 xg durante 10 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células individuais em 2 ml de meio iPS-RPE. Transferem-se as células em uma matriz proteica revestido placa de 6 poços e lugar numa incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade.
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Representative Results
Neste experimento, as células iPS foram cultivadas e diferenciadas na linhagem RPE da EBS. EB de tamanhos controladas foram formados utilizando placas de micropoços. Como visto na Figura 1 formação EB foi homogénea nas placas de microcavidades. Estes EB foram então recolhidas e colocadas em placas de 6 poços (Figura 2).
EPR podem ser identificados pela sua morfologia hexagonal clássica, pigmentação, e a expressão de marcadores EPR. Após 12 semanas de cultura, o 200-célula EBs tinha desenvolvido astrócitos e morfologia de fibroblastos. Sem pigmentação foi observada nestas células (Figura 3A). EB maiores desenvolveu uma monocamada de morfologia e pigmentação EPR clássico (Figura 3B e C) A imunocitoquimica para detecção de marcadores EPR, MITF e ZO1 revelada a co-expressão destas proteínas que tinham sido derivadas de células 500 e 3000 de células EB (Figura 4) .
EXpressi- de campo ocular e genes RPE foram monitorados por PCR. A Figura 5 mostra o perfil de expressão do gene de neuroectodérmico, precursores de campo olho, e marcadores EPR em diferentes tamanhos de CEs. É importante ressaltar que o marcador RPE específico, RPE65 foi detectado começando no dia 17.
Para se quantificar a produção de células que se diferenciaram em EPR linhagem, análise FACS foi realizada para detectar os neuroectodérmicos e RPE precursoras marcadores, PAX6 e MITF respectivamente. A Figura 6A mostra marcador neuroectodérmico PAX6 em diferentes tamanhos de EBs em diferentes pontos de tempo. Aproximadamente 50% das células analisadas foram positivas para Pax6 no dia 6 de cultura nos EB-3000 células. Além disso, a análise de FACS de marcador EPR, MITF em tamanhos variados EB revelou que 20% das células expressaram MITF por Dia 60 de diferenciação.
RPE cultivadas também são caracterizados pela sua capacidade de perder o seu pigmento e morfologia poligonal e obter umApós passagem fenótipo de fibroblastos. Por conseguinte, para determinar se as iPS derivado EPR possuem estas características, que mecanicamente isolado e passadas as células. A Figura 7A mostra as células do recém-subculturas perderam pigmento e adquirida morfologia de fibroblasto. Além disso, estas células proliferaram e recuperou a morfologia poligonal clássica na confluência (Figura 7B). Dentro de algumas semanas, essas células recuperaram a pigmentação (Figura 7C).
| Gene | NICB referência | Sequência (5'-3 ') | Tamanho (pb) | |
| Pax6 | NM_001258465.1 | F | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | F | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | F | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | F | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH | NM_001256799.1 | F | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | TCCACCACCCTGTTG CTGTA |
Tabela 1. Sequências de iniciadores de PCR para os genes Pax6, RPE65, RX, MITF e GAPDH.
Figura 1. Formação de EB com placas de microcavidades. Cada microplaca contém (A), células 100 (células B), 200 (C) de 500 células, e (D) 3000 células. As células foram incubadas 24 hr a 37 ° C e 5% de CO 2 para a formação de CEs. (Ampliação 100X, escala bar = 400 mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. EBs colhidas a partir de placas de microcavidades. (A) 200-célula EB, (B) 500-célula EB, (C) 3000 EB-célula, e (D) a 15.000 células EB. (Ampliação 200X, escala bar = 200 mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. iPS derivadas de RPE de diferentes tamanhos de CEs. EB foram cultivadas durante 12 semanas. (A) 200-célula EBs só tinha desenvolvido astrócitos e morfologia de fibroblastos sem pigmentação; enquanto que 80% - 90% das células nas células EB 500 (B e C) desenvolveram uma monocamada de células pigmentadas poligonais. (A & B: Ampliação 100X, barra de escala= 400 mm; (C):. Ampliação 200X, escala bar = 200 mm) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Co-expressão de MITF e ZO1. 500- 3000 e de células EB expresso MITF ZO1 e após 17 dias de diferenciação. (Aumento de 400X, barra de escala = 20 mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Perfil de expressão génica de diferentes tamanhos de EBs em diferentes pontos no tempo de diferenciação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Análise FACS de tamanho variado EB para a diferenciação de RPE. (A) os dados de FACS de marcador neuroectodérmico PAX6 em diferentes tamanhos de EBs durante a diferenciação. (B) Análise FACS de marcador RPE MITF em tamanhos variados EB no dia 60 de diferenciação. O nível mais elevado de MITF atingiu 20% e foi constante entre o tamanho do EB 500, 3.000, e 15.000 células.
Figura 7. Continua cultura de isolado manualmente RPE. (A) RPE foi subcultivada e adquirida de fibroblastos morpholoGy após passagem. (B & C) Células desenvolvido morfologia poligonal e pigmentação ao longo do tempo. (Ampliação 100X, escala bar = 400 mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para realizar o pleno potencial das células-tronco pluripotentes para terapia celular, é necessário regulamentar a sua diferenciação de uma forma consistente e reproduzível. Este relatório descreve os protocolos para formar EBs controlada porte usando tecnologia de microplaca, iniciar a diferenciação em direção RPE e identificar marcadores de proteínas e genes de RPE. Para sincronizar a diferenciação in vitro, tamanhos homogêneos da EBS foram formados por um número conhecido de células iPS centrifugado em placas de micropoços de agregação forçada. A imunocitoquímica e transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) são utilizados para controlar as proteínas do EPR e expressões de genes explicadas. Por fim, a eficiência da diferenciação em diferentes tamanhos de EBs foi analisado por análise FACS. Estas técnicas podem facilitar a diferenciação das células iPS em EPR para aplicações futuras.
Há vários pontos cruciais neste método que deve ser cuidadosamente executado para eNSure o sucesso deste protocolo e obtenção de dados precisos. O primeiro passo fundamental ocorre durante a cultura de células iPS. células iPS deve ser mantida em um estado pluripotente para manter sua stemness. As células têm de ter a forma alterada diariamente a fim de manter níveis adequados de bFGF e ser cuidadosamente inspeccionadas diariamente para sinais de diferenciação. Células iPS indiferenciadas crescer como colônias multicelulares compactos. As células devem ter uma elevada proporção nuclear para o citoplasma e nucléolos proeminentes. As colónias iPS são caracterizados por uma fronteira distinta, com várias camadas de células no centro. Os sinais de diferenciação incluem perda de colónias fronteiras definidas, a morfologia das células não-uniforme, e o aparecimento de tipos de células óbvias, tais como os neurónios e fibroblastos. As células individuais que se diferenciaram pode ser removido por dispase e enxaguamento, no entanto, as colónias com estas características devem ser removidos manualmente a partir da cultura 22. Preparação de uma suspensão única célula iPS for formando a EBS é o próximo passo crítico. É importante para preparar uma suspensão de células sem agregados, a fim de administrar com precisão o número de células desejado para a microplaca e preparar o tamanho desejado EB. Preparações de RNA para análise de PCR também são importantes. ARN qualidade inconsistente é uma fonte significativa de variabilidade nos dados de PCR. Extração de RNA deve render minimamente degradado RNA para obter melhores resultados. Extração de RNA de sucesso vai render RNA total com a degradação e livre de quaisquer contaminantes RNases mínima. Após determinação da concentração de ARN por espectrofotometria a 260 nm, a pureza da amostra deve ser determinado a 230 e 280 nm para detectar contaminação com polissacáridos ou proteínas. O 230: 260: 280 para a proporção ARN deve ser de 1: 2: 1 para indicar RNA de alta qualidade sem contaminação 23. Finalmente, é importante corrigir adequadamente as células de coloração de FACS. Durante esta etapa de fixação, as células têm de ser separados para evitar aglomeração. Insufficressuspensão celular tário antes da permeabilização vai levar a aglutinação celular e coloração impreciso.
Recomendamos que o protocolo seja seguido como descrito, no entanto algumas modificações podem ser feitas, se necessário. Durante a geração de EBs descrito no Passo 4, o número de células por EB pode variar entre 500 a 3000 para atingir um elevado rendimento de células diferenciadas no RPE. Se o número de células iPS é limitado, EB 500 de células irá produzir EPR comparável aos EB-3000 células. Cuidados extras devem ser tomados durante o processo de extração de RNA descrito no Passo 6. As amostras devem ser executados em triplicado para garantir que RNA de alta qualidade pode ser adquirido. Durante a imunocitoquímica, tal como descrito no Passo 7, as concentrações de anticorpos primários e secundários podem ser ajustadas conforme necessário para melhorar a intensidade do sinal e reduzir o fundo. Os controlos positivos e negativos adequados ser incluídos no ensaio. Durante o Passo 8, análise de FACS, se os resultados esperados são não ACQuired após coloração, uma pequena amostra de células coradas pode ser colocado sobre uma lâmina e visualizados com um microscópio de visualizar coloração. Os controlos positivos e negativos adequados ser incluídos no ensaio. Se as células não são coradas como esperado, as concentrações de anticorpos pode ser aumentada ou diminuída, conforme necessário.
A técnica descrita neste relatório vai resultar em uma maior produção de EPR de diferenciação espontânea, sem a utilização de produtos químicos adicionados. No entanto, a principal limitação desta abordagem é que haverá também um grande número de células não-RPE gerados. Portanto, o EPR deve ser cuidadosamente seleccionada e enriquecida para fora, tal como descrito no Passo 9, para assegurar uma população homogénea.
O significado desta abordagem é de que um maior rendimento de EPR pode ser derivada a partir de células iPS do que técnicas de diferenciação espontânea. Também tem sido relatada a utilização de pequenas moléculas para derivar a partir do EPR iPS para dar um rendimento elevado decélulas diferenciadas, no entanto, que a técnica é muito mais complexo e requer a temporização e as concentrações de pequenas moléculas para ser optimizada para alcançar os resultados desejados a 7,10. Além disso, as pequenas moléculas utilizadas nesses métodos têm efeitos pleiotrópicos, pode confundir os resultados.
O método descrito pode ser usado para fazer as EBs de tamanhos desejados, com elevada reprodutibilidade. Esta técnica gerado EBs de tamanhos uniformes, que foram utilizados para optimizar a diferenciação de células iPS em relação à linhagem EPR sem a utilização de produtos químicos adicionais. As células iPS-epiteliais pigmentares derivadas de EBs pode, então, ser mais utilizada em estudos de transplante para confirmar a sua integração na retina em uma organização funcional. Estas células também pode fornecer um modelo de pesquisa boa para estudar a patogênese de diversas doenças RPE in vitro. A utilidade desta abordagem pode ser aplicada para a diferenciação dirigida para muitos outros tipos de células, dependendoo tamanho da EB e a origem in vivo da célula do blastocisto. As células do ectoderma dará origem a neurônios, epiderme, cabelos e células da glândula mamária; endoderme irá dar origem a estômago, cólon, pulmões, e as células intestinais; mesoderme irá dar origem ao músculo esquelético, o coração, o rim, e células do tecido conjuntivo 3,11,19. Uma vez que o tamanho correcto EB foi determinada, as células diferenciadas só necessitam de ser analisados por imunocitoquímica ou FACS para a expressão correcta de proteínas marcadoras.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
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