Summary
מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים לגזור את האפיתל רשתית פיגמנט (RPE) מתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) באמצעות גדלים שונים של גופי embryoid.
Introduction
גזע pluripotent תאים (iPS) מושרה הם סוג של תאי גזע pluripotent נגזר על ידי תכנות מחדש של תאים בוגרים עם גורמים חיצוניים 1. בניגוד לכך, תאי גזע עובריים (ESCs), סוג אחר של תאי גזע pluripotent, נוצרים ממסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט 2-3. למרות מקורותיהם השונים, תאי iPS וESCs הם דומים בקיבולת בלתי מוגבלת שלהם לשכפל במבחנה וביכולתם להתמיין לכל סוג תא 4-5. מאפיינים אלו של תאי iPS להפוך אותם למועמדים אידיאליים עבור יישומים ברפואת רגנרטיבית אישית. מאמצי המחקר אחרונים מתמקדים בפיתוח פרוטוקולי בידול חזקים להפקת תאים בוגרים מיוחדים כוללים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) 6-11.
עבור יישומים קליניים פוטנציאליים של תאי iPS נגזרים, בידול מכוון עבור אותו סוג תא מסוים הוא חיוני. ישנן שיטות שונותפורסם לבידול מכוון של שני תאי iPS ESCs ולרשתית שמשתנית מאוד ביעילות שלהם 6-7, 12-16. אנחנו עדיין לא יודעים שרבים מן האירועים המולקולריים הקובעים את גורל תא / רקמה במהלך פיתוח או בידול. בשנים האחרונות, נעשו מאמצים לפתח פרוטוקול הבידול שיכול לחקות ההתפתחות העוברית ככל האפשר. בשלב הבלסטוציסט, אוכלוסייה לא מחויבת של תאי גזע נמצא יחד במייקרו-סביבה תלת ממדים. אז, אסטרטגיות שונות יושמו על מנת להפוך את תאי ESC / iPS התאספו יחד ולגדל אותם בשלושה ממדים. אגרגטים של תאי גזע אלה נקראים גופי embryoid (EBS). מחקרים הראו כי ההבחנה EB של תאי גזע לחקות שלב המוקדם של התפתחות עובר ואופן ספונטני יכולה להצמיח האנדודרם פרימיטיווי על פני השטח החיצוניים שלה. מאוחר יותר, כפיתוח EB מתקדם, פנוטיפים תאים מובחנים של כל שלוש השושלות נבט מופיעים 17-18. הerefore, פרוטוקולי בידול המבוסס EBS משכו הרבה תשומת לב לבידול במבחנה של תאי ESC / iPS ומועמד טוב לדור הרשתית מתאי גזע pluripotent 13.
EBS יכול להתבצע באמצעות מספר שיטות מESC תאים / iPS. בתחילה, EBS נעשה על ידי גירוד את מושבות חסיד ושמירתם בתרבות השעיה שאינה חסיד. עם זאת, גישה זו מניבה אוכלוסייה הטרוגנית של EBS שגורם לשחזור נמוך. תרבות תליית ירידת תא וmicrowell היווצרות EBS מבוססת טכניקות פופולריות אחרות להיווצרות EBS שיניבו EBS הומוגנית בגדלים מוגדרים, כי הם מאוד לשחזור. יתר על כן, טכניקת microwell יכולה להניב מספר רב של אגרגטים בפחות מאמץ.
התמיינות של תאים בתוך EBS מוסדרת על ידי זמנית רמזי morphogenic ממייקרו-הסביבה התאית ו תאי. בניגוד לבידול ביום שניפורמט olayer, EBS לתת במה להרכבה מורכבת של תאים ואיתות בין תאית להתרחש 17. מעניין לציין, כי מספר תאי גזע pluripotent המשמשים לייצור EBS הבודד נצפה להשפיע על גורלם של תאים. לדוגמא, במחקר בידול hematopoietic של ESCs אדם, זה היה ציין כי 500 התאים EB קידמה בידול כלפי שושלת מיאלואידית ואילו 1,000 התאים EB דחפה כלפי שושלת erythroid 20. במחקר אחר, EBS הקטן העדיף בידול האנדודרם אילו EBS הגדול קידם לבידול נוירו-האאקטודרם 11, 17.
המחקרים האחרונים ממליצים כי מספר תאי ESC / iPS המשמשים לייצור EBS הפרט להשפיע על EBS בידול המבוסס על כל סוגי תאים. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אין מחקרים הנוכחיים שהובהרו ההשפעה של גודל EBS בנטייה שלה כדי לבדל את כיוון הרשתית. מטרתו של מחקר זה היא לאפיין את ההשפעה שלגודל EB על גזע pluripotent מושרה תאים (iPS) - אפיתל הפיגמנט ברשתית בידול (iPS-RPE) ולזהות את המספר הסלולרי האופטימלי על מנת להפוך את EBS לבידול מכוון לשושלת הרשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים תרבות וצלחות תרבות
- להכין מדיום תרבית תאי גזע מזין ללא-ידי הוספה של תוספת סרום ללא 5x 100 מיליליטר ל -400 מיליליטר של מדיום בסיס תאי גזע. המדיום הוא יציב בC ° 4 עד 2 שבועות וב -20 ° C למשך 6 חודשים.
- להוסיף 10 מיקרומטר פתרון של קשורים רו, חלבון kinase המכיל סליל מפותל מעכב (רוק) עד בינוני היווצרות (Y-27,362) זמינה מסחרי גוף embryoid (EB).
- להכין מדיום בידול על ידי הוספת 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, 0.1 חומצות אמינו החיוני מ"מ, L-גלוטמין 2 מ"מ, 10% החלפת סרום בנוקאאוט (KSR) ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין לתערובת השתנה Dulbecco נשר בינוני / התזונתית F-12 (DMEM / F12).
- הכן בינוני iPS-הרשתית על ידי הוספת תוספת 1x N1, 0.1 מ"מ חומצות אמינו החיוני, 250 מיקרוגרם / מיליליטר טאורין, 13 מלח נתרן / מיליליטר triiodo-L-thyronine ng, הידרוקורטיזון מיליליטר / 20 ng, 5 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין, ו- 15% בסרום שור עוברי (FBS) <sup> 21 לנשר מינימאלי חיוני בינוני (ממ). התאם את ה- pH 7.4.
- הכן פתרון מניות מלח נתרן triiodo-L-thyronine. לפזר 1 מ"ג של מלח נתרן triiodo-L-thyronine בסודיום הידרוקסיד 1 N ידי בעדינות מתערבל. להוסיף 49 מיליליטר של ממ לעשות 50 מיליליטר של 20 מיקרוגרם / מיליליטר של מלח נתרן triiodo-L-thyronine. הכן aliquots ולהקפיא ב -20 ° C עד צורך. השתמש בנפח מתאים להשגת ריכוז הרצוי במדיום התרבות הסופי.
- הכן פתרון מניות הידרוקורטיזון. Solubilize 1 מ"ג של הידרוקורטיזון ב 1 מיליליטר של אתנול 100% על ידי תסיסה עדינה. להוסיף 19 מיליליטר של ממ לעשות 20 מיליליטר של 50 מיקרוגרם / מיליליטר פתרון מניות הידרוקורטיזון. עד צורך Aliquot והקפאה ב -20 ° C. השתמש בנפח מתאים כדי להשיג את הריכוז הרצוי במדיום התרבות הסופי.
- הכן פתרון עבודה של dispase של 1 מ"ג / מיליליטר בDMEM / F12.
- הכנת צלחות מטריצה המצופה
- הכן מטריצת חלבון המופקת מEngelbreth-הולם-הנחיל (EHS) mouתאי se סרקומה בDMEM / F12 ל0.08 מ"ג / מיליליטר. מעיל היטב בכל צלחת 6-היטב עם 1 מיליליטר של פתרון המטריצה. דגירה הצלחות המצופים בRT עבור שעה 1.
- לאחר הדגירה 1 שעה, לשאוב DMEM / F12 העודף. הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית תאי גזע מזין ללא כדי למנוע התייבשות של הבארות. צלחות המטריצה מצופים מוכנות לשימוש.
- הכן צלחות microwell, על ידי שטיפה היטב כל אחד עם 2 מיליליטר של DMEM / F12. הסר DMEM / F12 ולהוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום היווצרות EB השלים עם מעכב רוק היטב כל אחד. צנטריפוגה הצלחת XG ב 2000 במשך 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
- הכן חיץ מכתים FACS ידי ערבוב 2% FBS, ושל 0.09% אזיד הנתרן בופר פוספט (PBS). התאם את החיץ pH 7.4.
- הכן פתרון נטרול טריפסין על ידי הוספת 10% FBS לDMEM / F12.
2. iPS תרבות
- לפני זריעת תאי iPS בינוני, חם מזין ללא גזע תרבית תאים עד 37 מעלות צלזיוס, ויש לי maTrix מצופה צלחות מוכנות.
- במהירות להפשיר את תאי iPS IMR90-1 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ואז להסיר את cryo-הבקבוקון מאמבט המים ולנגב את הבקבוקון עם אתנול 70%. להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מיליליטר בעזרת פיפטה 2 מיליליטר כדי למזער שבירת גושי תא.
- הוסף 5 מיליליטר של מדיום תרבות חם מזין ללא תאי גזע לתאים dropwise ולערבב בעדינות. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות על RT ולהסיר את supernatant.
- resuspend בזהירות את גושי התאים 2 מיליליטר של מדיום תרבות תאי גזע מזין ללא וזרע גושי תאים בבארות של צלחת מצופה מטריצה. מניחים את הצלחת לתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2, לחות 95%.
- לשנות את מדיום תרבית תאי iPS יומי. שים לב שלא עברו התמיינות מושבות 06:55 ימים לאחר זריעה. בדקו אם מושבות עברו התמיינות והם מוכנים למעבר (מושבות עם מרכז צפוף) תחת מיקרוסקופ אור.
3. Passaging של תאי iPS
- למעבר תאי iPS לפני תחילת, לחמם את פתרון dispase, DMEM / F12 ובינוני תרבות תאי גזע מזין ללא עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- לפני passaging תאי iPS, להסיר כל תחומי בידול על ידי גירוד באזור וaspirating הבינוני. לשטוף בזהירות את תאי iPS עם 2 מיליליטר DMEM / F12.
- הוסף 1 מיליליטר של 1 מ"ג ל/ מיליליטר dispase כל טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לשאוב dispase ולשטוף בעדינות מושבות תאים עם 2 מיליליטר של DMEM / F12 שתי פעמים. לאחר השטיפה, להוסיף 2 מיליליטר של מדיום תרבית תאי גזע מזין ללא היטב כל אחד.
- בעזרת פיפטה 5 מיליליטר בעדינות לגרד את המושבות של הצלחת ליצירת גושי תא. העבר את גושי תאים מנותקים צינור חרוטי 15 מיליליטר. הוסף בינוני מזין ללא מספיק גזע תרבית תאי זרע המעבר הבא של תאים.
4. דור של EBS שימוש צלחות microwell
- הכנת השעיה תא בודדת של תאי iPS
- הסר את mediuמ 'מתאי iPS ולשטוף את תאי iPS עם 2 מיליליטר של DMEM / F12. הוסף 750 μl של Accutase לתאי iPS בכל טוב של 6-גם הצלחת. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, כדי לאפשר לתאים להתנתק מהצלחת (כ 5-10 דקות).
- השתמש פיפטה לנתק עדינות כל תאים הנותרים וכדי לנתק את כל תאים שנותרו על פני השטח הצלחת. להעביר את תאי צינור חרוטי 50 מיליליטר. יש לשטוף את הצלחת עם 5 מיליליטר של DMEM / F12 ולשלב DMEM / F12 שטף עם התאים בצינור חרוטי. להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי להסיר כל גושי תאי שייר אפשריים.
- צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות על RT כדי להסיר את Accutase. Resuspend התא גלולה במדיום היווצרות EB כך שריכוז התא הוא כ 0.5-1.0 x 10 7 תאים / מיליליטר.
- לקבוע את מספר תאי קיימא על ידי ספירת התאים עם Trypan הכחול וhemocytometer.
- Adjustinצפיפות תאי g בmicrowells כדי ליצור EBS-מבוקר גודל
- התאם את מספר התאים היטב בכל צלחת microwell ליצור גדלי EB הרצויות. הוספת תאים לmicrowells של הצלחות מוכנות בשלב 1.9, שווה להפיץ את התאים על ידי pipetting בעדינות את התאים מספר פעמים.
הערה: מספר התאים הדרושים לכל טוב = רצוי מספר תאים לכל מספר x EB של microwells בכל טוב. - התאם בינוני היווצרות EB השלים עם מעכב רוק בבארות לנפח סופי של 2.0 מיליליטר. להפיץ מחדש את התאים על ידי pipetting בעדינות היטב כל אחד. צנטריפוגה צלחות microwell ב 100 XG במשך 3 דקות. מקם את הצלחות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO 2 ולחות% 95 למשך 24 שעות.
- התאם את מספר התאים היטב בכל צלחת microwell ליצור גדלי EB הרצויות. הוספת תאים לmicrowells של הצלחות מוכנות בשלב 1.9, שווה להפיץ את התאים על ידי pipetting בעדינות את התאים מספר פעמים.
- EBS קציר מצלחות microwell
- קציר EBS מmicrowells ידי pipetting בינוני בבאר למעלה ולמטה עם micropipettor 1 מיליליטר להסיר את רוב EBS. לעבור את ההשעיה EB דרך תא 40 מיקרומטר הפוךמסננת על גבי צינור חרוטי 50 מיליליטר כדי להסיר תאים בודדים.
- לשטוף את צלחת microwell 5 פעמים עם 1 מיליליטר של DMEM / F12 כדי להסיר את כל EBS. לאסוף שוטף ולעבור על מסננת התא ההפוכה. הפעל בצד ימני מסננת תא עד צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. לאסוף את EBS על ידי שטיפה עם מדיום היווצרות EB. רוזן EBS כדי לקבוע את התשואה.
5. ציפוי EBS ובידול ייזום
- פלייט EBS על מטריצת חלבון המצופה שש צלחות גם (כמו בשלב 1.8.1) בצפיפות של <1000 EBS / גם במדיום היווצרות EB תוספת מעכב רוק 10 מיקרומטר. דגירה EBS על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולחות% 95 למשך 24 שעות.
- 24 שעות לאחר ציפוי EB, להחליף עם מדיום בידול ליזום בידול. לשנות מחצית בינוני הבידול בכל יום אחר עד שהתאים נאספים לניתוח נוסף.
- לאסוף דגימות ביום 6, 17, 29 ו -60 כדי לנהל RT-PCR, IMMunocytochemistry וFACS כדי לאמת את הביטוי של גנים וחלבוני הרשתית אופייניים.
6. הפקת RNA וPCR
- לחלץ RNA מדגימות EB-פי הוראות המסופקות בערכה זמינה המסחרית. לקבוע את ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
- לבצע שעתוק לאחור על של רנ"א הכל 100 ng לפי RNA זמין מסחרי לערכת תמליל ההפוך cDNA.
- לבצע PCR עם 10 ng של cDNA באמצעות פריימרים הבאים (טבלת 1) בריכוז של 10 μmol / 10 ng של cDNA. הגדר את PCR כדלקמן: לפגל DNA על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להגביר עם 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, ואחריו מחזור סופי על 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הפעל את מוצר ה- PCR על 1% agarose ג'ל.
7. Immunocytochemistry
- שטוף את EBS עם PBS פעמיים ב RT. תקן את EBS בRT בparaformald 4%ehyde במשך 10 דקות. לשטוף פעם אחת עם PBS ב RT. חנות דגימות בPBS על 4 מעלות צלזיוס עד משמשות לצביעה.
- ביום הכתמה, טיפול בתאים הקבועים עם ריאגנטים קיבעון וpermeabilization. דגירה הדגימות עם פתרון חסימה (10% עזים בסרום בפתרון permeabilization) במשך שעה 1 ב RT.
- בצע immunochemistry בסרום עיזים 10% בפתרון permeabilization באמצעות הנוגדנים העיקריים הבאים בדילולים מצויינים: אנטי-Pax6 (1:10), אנטי-RX (1: 200), אנטי-MITF (1:30), ואנטי- ZO1 (1: 100). דגירה דגימות עם מקביל נוגדני O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
- למחרת, להסיר את הנוגדן הראשוני מהתאים ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS. דגירה דגימות עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות עבור שעה 1 ב RT.
- הסר את הנוגדנים משני מהתאים ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים PBS. הר תלושי לכסות על שקופיות זכוכית עם DAPI המכיל הרכבה בינונית ולאפשר דגימות להגדיר O / N בחדר חשוך.השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לדמיין את הכתמים.
8. מכתים לניתוח FACS
- שטוף את EBS בתרבית PBS שתי פעמים. דגירה EBS עם 0.5 מיליליטר של טריפסין 0.25% למשך 5-10 דקות כדי להפוך את השעיה תא בודדת. לנטרל את טריפסין עם פתרון נטרול טריפסין (1 מיליליטר / טוב).
- מעביר את ההשעיה התא בודדת לצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 600 XG במשך 10 דקות.
- בטל supernatant ולהוסיף 10 מיליליטר של DMEM / F12 לתאים בצינור. בעדינות להפוך לערבב תאים. צנטריפוגה ב 600 x גרם. לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend התאים במאגר מכתים FACS.
- לספור את המספר הכולל של תאים. צנטריפוגה ב 600 XG במשך 10 דקות. לאחר supernatant נזרק צנטריפוגה. תקן את התאים באופן מיידי על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של paraformaldehyde 4%. מערבבים היטב על ידי vortexing העדין. דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- צנטריפוגה ב 600 XG במשך 10 דקות ולהסיר אתsupernatant. מערבולת בעדינות כדי לשבש את התא גלולה. Permeabilize התאים על ידי הוספת 1 מיליליטר של תמיסת permeabilization מצוננת. המערבולת בעדינות לתערובת ולדגור על קרח למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ב 600 XG במשך 10 דקות ולהסיר את supernatant. הוסף 3 מיליליטר של חיץ מכתים FACS וגלול. חזור על שלב זה לעוד פעם אחת. Resuspend תאי חיץ מכתים FACS בריכוז סופי של 5 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- העברת ההשעיה התא (0.5 x 10 6 תאים) 100 μl לכל צינורות microfuge ולהוסיף הנפח המומלץ של נוגדן ראשוני. לPax6, להוסיף 5 μl של PE אנטי-Pax6 בהשעית תא 100 μl. לMITF, להוסיף 5 μl של אנטי-MITF בהשעית תא 100 μl.
- לערבב ולדגור על RT במשך 60 דקות. הוסף 3 מיליליטר של חיץ מכתים FACS. לערבב וצנטריפוגות ב 600 XG במשך 10 דקות. הסר את supernatant וחזור 8.16 לשתי פעמים נוספות.
- עבור מכתים MITF, דגירה התאים בantibo המשניתdy, עז אנטי העכבר Alexa פלואוריד 488 בדילול של 1: 2,000 לשעה 1 על 4 מעלות צלזיוס. עבור מכתים Pax6, להימנע בשלב זה.
- לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של חיץ מכתים FACS ו צנטריפוגות ב 600 XG במשך 10 דקות. חזור על התהליך עבור שתי פעמים נוספות.
- Resuspend התאים 500 μl של חיץ מכתים FACS ומערבולת בעדינות כדי לשבש את התא גלולה. דגימות מוכנות לניתוח הזרימה cytometric.
בידוד 9. iPS-הרשתית ותרבות
- ביום 29 ב, לחתוך בזהירות סביב מושבות פיגמנט שנבחרו מצלחת התרבות באמצעות קצה פיפטה 200 μl. העבר את המושבות צפות צינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה המושבות ב 600 XG במשך 10 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
- Resuspend מושבות התאים ב 10 מיליליטר של DMEM / F12 וצנטריפוגות ב 600 XG במשך 10 דקות. הסר את supernatant.
- הכן השעיה תא בודדת על ידי דוגרים המושבות עם 2 מיליליטר של טריפסין 0.25% על 37 מעלות צלזיוס למשך 7-10 דקות. בעדינות מערבולת ההשעיה התא לנתק את המושבות.
- לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של מדיום iPS-הרשתית. צנטריפוגה ב 600 XG במשך 10 דקות וזורקים supernatant. Resuspend התאים בודדים ב 2 מיליליטר של מדיום iPS-הרשתית. להעביר את התאים לתוך מטריצת חלבון 6-גם צלחת מצופה ומקום בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולחות של 95%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי זה, תאי iPS היו בתרבית ומובחנת לשושלת הרשתית מEBS. EBS בגדלים מבוקרים נוצר באמצעות צלחות microwell. כפי שניתן לראות באיור 1 EB ההיווצרות היה הומוגני בצלחות microwell. EBS אלה ולאחר מכן נאסף ומצופה על 6 צלחות היטב (איור 2).
ניתן לזהות על ידי מורפולוגיה הרשתית, פיגמנטציה, וביטוי המשושה הקלסי של סמני הרשתית. לאחר 12 שבועות של תרבות, 200 התאים EBS פיתח astrocyte ומורפולוגיה פיברובלסטים. אין פיגמנטציה נצפתה בתאים אלה (איור 3 א). EBS הגדול פיתח monolayer של מורפולוגיה הרשתית קלסית ופיגמנטציה (איור 3 ו- C) Immunocytochemistry כדי לזהות סמני הרשתית, MITF וZO1 חשפו שיתוף ביטוי של חלבונים אלה שכבר נגזרו 500 תאים ו3,000 התאים EBS (איור 4) .
EXpressions של שדה עין וגני הרשתית היה במעקב על ידי PCR. איור 5 מראה את פרופיל ביטוי גנים של neuroectodermal, מבשרי שדה עין, וסמני הרשתית בגדלים שונים של EBS. חשוב לציין, סמן הרשתית הספציפי, RPE65 זוהה מתחיל ביום 17.
לכמת את התשואה של תאים שמובחנים לשושלת הרשתית, ניתוח FACS בוצע כדי לזהות סמני neuroectodermal ומבשר הרשתית, Pax6 וMITF בהתאמה. איור 6 א תערוכות Pax6 סמן neuroectodermal בגדלים שונים של EBS בנקודות זמן שונים. כ -50% מהתאים ניתחו היו חיוביים לPax6 ביום 6 של התרבות בEBS 3000-התא. בנוסף, ניתוח FACS של סמן הרשתית, MITF בגדלים מגוונים EB גילה כי 20% מהתאים ביטאו MITF ידי יום 60 של בידול.
הרשתית תרבותית גם התאפיינה ביכולתם לאבד פיגמנט שלהם ומורפולוגיה מצולעים ולקבלפנוטיפ פיברובלסטים על passaging. לכן, כדי לקבוע אם iPS נגזר הרשתית בעלי מאפיינים אלה, אנו מכניים מבודדים וpassaged התאים. איור 7 א מציג את תאי passaged החדש איבדו פיגמנט וזכו מורפולוגיה פיברובלסטים. בנוסף, תאים אלה התרבו וחזרו מורפולוגיה מצולעים הקלסית על מפגש (איור 7). בתוך כמה שבועות, תאים אלה חזרו פיגמנטציה שלהם (איור 7 ג).
| גן | התייחסות NICB | רצף (5'-3 ") | גודל (נ"ב) | |
| Pax6 | NM_001258465.1 | F | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | F | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | F | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | F | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH | NM_001256799.1 | F | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | TCCACCACCCTGTTG CTGTA |
1. רצפי פריימר PCR שולחן לגנים Pax6, RPE65, RX, MITF וGAPDH.
איור 1. כינונה של EBS עם צלחות microwell. כל microwell מכיל () 100 תאים, (ב) 200 תאים, (ג) 500 תאים, ו( ד) 3,000 תאים. תאים הודגרו 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ליצירת EBS. (הגדלה של X100, בר = 400 מיקרומטר בקנה מידה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
EBS איור 2. שנקטפו מצלחות microwell. () 200 התאים EB, (ב) 500 התאים EB, (C) 3000-תא EB, ו( D) 15,000 התאים EB. (הגדלה 200X, בר = 200 מיקרומטר בקנה מידה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הרשתית מגדלים שונים של EBS. EBS 3. נגזר iPS-הדמות היה בתרבית למשך 12 שבועות. 200 התאים EBS () פיתחו astrocyte ומורפולוגיה פיברובלסטים ללא פיגמנטציה בלבד; ואילו 80% - 90% מהתאים בEBS 500 התאים (B ו- C) שפותחו על monolayer של תאי פיגמנט מצולעים. (A ו- B: הגדלה 100X, סרגל קנה מידה= 400 מיקרומטר; (C):. הגדלה 200X, בר = 200 מיקרומטר בקנה מידה) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. שיתוף ביטוי של MITF וZO1. 500 ו -3,000 תאים EBS הביע MITF וZO1 לאחר 17 ימים של בידול. (הגדלה 400X, בר = 20 מיקרומטר בקנה מידה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פרופיל איור 5. Gene ביטוי בגדלים שונים של EBS בנקודות זמן שונה של בידול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
6. ניתוח FACS איור של גודל EB מגוון לבידול הרשתית. () FACS נתונים של Pax6 סמן neuroectodermal בגדלים שונים של EBS במהלך התמיינות. ניתוח FACS של MiTF סמן הרשתית בגדלי EB מגוונים ביום 60 של בידול (B). הרמה הגבוהה ביותר של MITF הגיעה 20% והיה קבוע בין גודל EB של 500, 3,000, ו -15,000 תאים.
איור 7. המשך תרבות של הרשתית מבודדת באופן ידני. RPE () היה subcultured ורכש morpholo פיברובלסטיםGY לאחר מעבר. תאים (B & C) פיתחו מורפולוגיה מצולעים ופיגמנטציה לאורך זמן. (הגדלה של X100, בר = 400 מיקרומטר בקנה מידה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על מנת לממש את ההבטחה המלאה של תאי גזע pluripotent לטיפול בתאים, יש צורך להסדיר הבידול שלהם באופן עקבי לשחזור. דו"ח זה מתאר פרוטוקולים כדי ליצור EBS-נשלט באמצעות טכנולוגיית גודל צלחת microwell, ליזום בידול כלפי הרשתית ולזהות סמני חלבון וגן של הרשתית. כדי לסנכרן את הבידול במבחנה, בגדלים אחידים של EBS נוצרו על ידי מספרים ידועים של תאי iPS centrifuged בצלחות microwell על ידי צבירת כפייה. Immunocytochemistry ותגובה הפוך שעתוק השרשרת של פולימראז (RT-PCR) משמשים כדי לפקח על חלבוני הרשתית ביטויים וגנים של הסביר. לבסוף, את היעילות של בידול בגדלים שונים של EBS נותחה על ידי ניתוח FACS. טכניקות אלו יכולות להקל על ההתמיינות של תאי iPS לרשתית ליישומים עתידיים.
ישנן מספר נקודות קריטיות בשיטה זו שחייבת להתבצע בזהירות לדוארNsure ההצלחה של פרוטוקול והשגה זו של נתונים מדויקים. צעד מפתח הראשון מתרחש במהלך תרבית תאי iPS. תאי iPS חייבים להישמר במצב pluripotent לשמור stemness. התאים חייבים להיות בינוניים השתנה יומי על מנת לשמור על הרמות המתאימות של bFGF ולהיבדק בקפידה יומי לסימנים של בידול. תאי iPS מובחנים לגדול כמושבות רב-תאיות קומפקטיות. התאים צריכים להיות גרעיני גבוהה יחס ציטופלסמה וnucleoli הבולט. מושבות iPS מתאפיינות בגבול ברור, עם מספר שכבות של תאים במרכז. סימנים של בידול כוללים אובדן גבולות מושבה מוגדר, מורפולוגיה של תאים הלא-אחידה, ואת המראה של סוגי תאים ברורים, כגון תאי עצב וfibroblasts. תאים בודדים שהבדילו ניתן להסיר על ידי dispase ושטיפה, לעומת זאת, מושבות עם מאפיינים אלה חייבים להיות מוסרים באופן ידני מהתרבות 22. הכנת השעיה תא בודדת iPS for להרכיב את EBS הוא השלב הקריטי הבא. חשוב להכין את השעיה ללא אגרגטים תא כדי לספק באופן מדויק את המספר הרצוי של תאים לצלחת microwell ולהכין את הגודל הרצוי EB. הכנות לניתוח RNA PCR הן גם חשובות. איכות RNA עולה בקנה אחד היא מקור משמעותי של שונות בנתונים PCR. הפקת RNA אמורה להניב מושפלת מינימאלית RNA לתוצאות הטובות ביותר. הפקת RNA מוצלחת תניב RNA המוחלט עם מינימאלית השפלה ונקיה מכל זיהום RNases. לאחר קביעת ריכוז RNA על ידי spectrophotometry ב 260 ננומטר, טוהר המדגם צריך להיקבע ב230 ו -280 ננומטר כדי לזהות זיהום עם סוכרים או חלבון. 230: 260: 280 ליחס RNA צריך להיות 1: 2: 1 כדי לציין RNA באיכות גבוהה עם זיהום לא 23. לבסוף, חשוב לתקן כראוי התאים עבור מכתים FACS. במהלך שלב קיבעון זה, התאים חייבים להיות מופרדים כדי למנוע clumping. Insufficresuspension תא ient לפני permeabilization יוביל לclumping תא וצביעה לא מדויקת.
אנו ממליצים כי הפרוטוקול להיות אחרי כמתואר, עם זאת כמה שינויים יכולים להתבצע במידת צורך. בדור של EBS מתואר בשלב 4, מספר תאים לכל EB יכול לנוע בין 500 ל -3,000 כדי להשיג תשואה גבוהה של תאים מובחנים לרשתית. אם מספר תאי iPS מוגבל, EBS 500 התאים יפיק הרשתית דומה לEBS 3000-התא. טיפול נוסף יש לנקוט במהלך תהליך הפקת RNA המתואר בשלב 6. דוגמאות יש להפעיל בשלושה עותקים כדי להבטיח שRNA באיכות גבוהה ניתן לרכוש. במהלך immunocytochemistry כפי שמתואר בשלב 7, יכולים להיות מותאמים ריכוזי נוגדן הראשוני והמשני כנדרשים כדי לשפר את עוצמת אות ולהפחית את הרקע. הבקרות חיוביות ושליליות המתאימות צריכים להיות כלולות בassay. במהלך שלב 8, ניתוח FACS, אם התוצאות הצפויות אינם ACQuired לאחר צביעה, מדגם קטן של התאים המוכתמים יכול להיות ממוקם בשקופית ונצפה במיקרוסקופ כדי להמחיש מכתים. הבקרות חיוביות ושליליות המתאימות צריכים להיות כלולות בassay. אם התאים אינם מוכתמים כצפוי, ניתן להגדיל ריכוזי נוגדנים או ירדו בהתאם לצורך.
הטכניקה המתוארת בדוח זה תגרום לתשואה גבוהה יותר של הרשתית מהתמיינות ספונטנית, ללא השימוש בכימיקלים הוסיפו. עם זאת, המגבלה העיקרית של גישה זו היא שיש גם תהיה מספר גדול של תאים שאינם הרשתית שנוצרו. לכן, הרשתית יש לבחור בזהירות החוצה והעשירה כמתואר בשלב 9 כדי להבטיח אוכלוסייה הומוגנית.
המשמעות של גישה זו היא כי תשואה גבוהה יותר של הרשתית יכולה להיות שמקורם בתאי iPS מאשר טכניקות התמיינות ספונטניות. השימוש במולקולות קטנות כדי להפיק הרשתית מiPS דווח גם לתת תשואה גבוהה שלתאים מובחנים, עם זאת, טכניקה שהיא הרבה יותר מורכב ודורשת תזמון וריכוזים של המולקולות הקטנות להיות מותאמים כדי להשיג את התוצאות הרצויות 7,10. בנוסף, יש לי המולקולות הקטנות המשמשות בשיטות אלה השפעות pleiotropic שיכול לבלבל את התוצאות.
השיטה המתוארת יכולה לשמש להכנת EBS בגדלים רצויים עם שחזור גבוה. טכניקה זו נוצרה EBS בגדלים אחידים אשר שמשו כדי לייעל את ההתמיינות של תאי iPS לשושלת RPE ללא השימוש בכימיקלים נוספים. תאי iPS-הרשתית נובעים מEBS לאחר מכן ניתן להשתמש במחקרים נוספים כדי לאשר את השתלת השתלבותם ברשתית בארגון פונקציונלי. תאים אלה יכולים גם לספק מודל מחקר טוב ללמוד פתוגנזה של מחלות הרשתית שונות במבחנה. השירות של גישה זו יכול להיות מיושם על הבידול המכוון לסוגי תאים רבים אחרים, בהתאם לגודלו של EBS ומוצא in vivo של התא בהבלסטוציסט. תאים של האאקטודרם יהיה להצמיח תאי עצב, האפידרמיס, שיער ותאי בלוטת החלב; האנדודרם יהיה להצמיח קיבה, מעי גס, ריאות, ותאי מעיים; המזודרם יהיה להצמיח שרירים שלד, לב, כליות, ותאי רקמת חיבור 3,11,19. ברגע שגודל EB הנכון נקבע, התאים המובחנים רק צריכים להיות מנותחים על ידי immunocytochemistry או FACS לביטוי הנכון של חלבוני סמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
- The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).
