Summary
Formålet med denne rapport er at beskrive de protokoller til at udlede det retinale pigment epitel (RPE) fra inducerede pluripotente stamceller (IPS) celler ved hjælp af forskellige størrelser af embryoide organer.
Introduction
Induceret pluripotente stamceller (IPS) celler er en type af pluripotente stamcelle afledt ved omprogrammering voksne celler med ydre faktorer 1. I modsætning embryonale stamceller (ESC), en anden type af pluripotente stamcelle, er genereret ud fra den indre cellemasse af blastocysten 2-3. Trods deres forskellige oprindelser IPS-celler og økonomiske og sociale råd er sammenlignelige i deres ubegrænset kapacitet til at replikere in vitro og i deres evne til at differentiere til en hvilken som helst celletype 4-5. Disse karakteristika iPS celler gør dem ideelle kandidater til applikationer i personlig regenerativ medicin. Nyere forskning er fokuseret på at udvikle robuste differentiering protokoller til at lave specialiserede voksne celler, herunder retinal pigment epitel (RPE) 6-11.
For potentielle kliniske anvendelser af iPS afledte celler, en rettet differentiering for den specifikke celletype er afgørende. Der er forskellige metoderoffentliggjort rettet differentiering af både økonomiske og sociale råd iPS celler i RPE, der varierer meget i deres effektivitet 6-7, 12-16. Vi ved stadig ikke mange af de molekylære begivenheder, der styrer celler / væv skæbne under udvikling eller differentiering. I de senere år er der gjort en indsats for at udvikle den differentiering protokol, der kan efterligne den embryologiske udvikling så meget som muligt. I blastocyst-fase uncommitted population af stamceller er sammen i et tredimensionelt mikromiljø. Så blev forskellige strategier for at gøre ESC / iPS celler samles sammen og dyrke dem i tre dimensioner. Disse stamceller aggregater kaldes embryoide organer (EbS). Undersøgelser har vist, at EB differentiering af stamceller efterligne tidligt udviklingstrin embryo og kan spontant medføre primitive endoderm på dens ydre overflade. Senere, da EB udvikling skrider frem, differentierede cellefænotyper alle tre kim slægter vises 17-18. Therefore har EBS differentiering protokoller tiltrukket en masse opmærksomhed til in vitro differentiering af ESC / iPS-celler og er en god kandidat til RPE generation fra pluripotente stamceller 13.
EB'er kan gøres ved hjælp af flere metoder fra ESC / iPS-celler. Oprindeligt blev EB'er fremstillet ved afskrabning adhærerende kolonier og fastholde dem i ikke-klæbende suspensionskultur. Men denne fremgangsmåde giver heterogen population af EB'er, der forårsager lav reproducerbarhed. Hængende drop cellekultur og mikrobrond baseret EB'er dannelse er andre populære teknikker til EB'er dannelse, der giver homogene EB'er af definerede størrelser, der er meget reproducerbare. Endvidere kan mikrobrønd teknik gav stort antal aggregater med mindre indsats.
Differentiering af celler inden EB'er reguleres af en multiplex af morfogene signaler fra det ekstracellulære og intracellulære mikromiljø. I modsætning til differentiering i en monolayer format, EB'er skabe en platform for kompleks samling af celler og intercellulære signalering at forekomme 17. Interessant nok blev antallet af pluripotente stamceller, der anvendes til at foretage individuelle EB'er observeret at påvirke skæbne af celler. For eksempel i en hæmatopoietisk differentiering undersøgelse af humane ESC, blev det observeret, at 500-celle EB fremmet differentiering i retning myeloid afstamning henviser 1.000 celle EB skubbes mod erythroid afstamning 20. I en anden undersøgelse mindre EB'er stillede endoderm differentiering mens større EB'er fremmes i retning neuro-ectoderm differentiering 11, 17.
Disse tidligere undersøgelser tyder stærkt på, at antallet af ESC / iPS celler, der anvendes til at foretage individuelle EB'er påvirker EBS differentiering eventuelle celletyper. Men så vidt vi ved, er der ingen aktuelle undersøgelser, der har belyst effekten af EB'er størrelse i sin tilbøjelighed til at differentiere i retning RPE. Målet med denne undersøgelse er at karakterisere indflydelseEB størrelse på induceret pluripotente stamceller (IPS) celler - retinal pigment epitel (IPS-RPE) differentiering og til at identificere den optimale celleantal at gøre EBS for rettet differentiering mod RPE afstamning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af kultur Reagenser og dyrkningsplader
- Forbered fødefri stamcelle dyrkningsmediet ved tilsætning af 100 ml af 5x serumfrit supplement til 400 ml stamceller basal medium. Mediet er stabilt ved 4 ° C i op til 2 uger og ved -20 ° C i 6 måneder.
- Tilsæt 10 uM opløsning af rho-associeret, coiled-coil indeholdende proteinkinase (Rock) inhibitor (Y-27362) til kommercielt tilgængeligt embryoid legeme (EB) dannelse medium.
- Forbered differentiering medium ved tilsætning af 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 10% udskiftning knockout serum (KSR) og 10 ug / ml gentamicin til Dulbeccos Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12).
- Forbered iPS-RPE medium ved tilsætning af 1x N1 supplement, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml triiod-L-thyronin natriumsalt, 20 ng / ml hydrocortison, 5 ug / ml gentamicin og 15% føtalt bovint serum (FBS) <sup> 21 til Minimum Essential Medium Eagle (MEM). PH justeres til 7,4.
- Forbered triiod-L-thyronin natriumsalt stamopløsning. Opløs 1 mg triiod-L-thyronin natriumsalt i 1 N natriumhydroxid ved forsigtigt hvirvlende. Tilføj 49 ml MEM at 50 ml 20 ug / ml triiod-L-thyronin natriumsaltet. Forberedes delprøver og nedfryses ved -20 ° C indtil brug. Brug passende volumen til at opnå ønskede koncentration i den endelige dyrkningsmedium.
- Forbered hydrocortison stamopløsning. Solubilisere 1 mg hydrocortison i 1 ml 100% ethanol ved forsigtig rystning. Tilføj 19 ml MEM at 20 ml 50 ug / ml hydrocortison stamopløsning. Alikvot og fryses ved -20 ° C indtil brug. Brug passende mængde for at opnå den ønskede koncentration i den endelige dyrkningsmedium.
- Forbered en arbejdsgruppe opløsning af dispase på 1 mg / ml i DMEM / F12.
- Fremstilling af matrix belagte plader
- Forbered proteinmatrix udvundet Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouSE sarcomaceller i DMEM / F12 til 0,08 mg / ml. Coat hver brønd i en plade med 6 brønde med 1 ml af matricen opløsning. Inkubér coatede plader ved stuetemperatur i 1 time.
- Efter 1 times inkubation, aspireres overskydende DMEM / F12. Tilsæt 0,5 ml fødefri stamcelle dyrkningsmedium for at forhindre udtørring af brøndene. De matrix belagte plader er klar til brug.
- Forbered mikrobrøndsplader ved skylning hver brønd med 2 ml DMEM / F12. Fjern DMEM / F12 og tilsæt 0,5 ml EB formation medium suppleret med Rock-inhibitor til hver brønd. Centrifugeres pladen ved 2000 xg i 5 min for at fjerne eventuelle luftbobler.
- Forbered FACS-farvning buffer ved at blande 2% FBS og 0,09% natriumazid i phosphatbufret saltvand (PBS). Juster buffer til pH 7,4.
- Forbered trypsin neutraliserende opløsning ved tilsætning af 10% FBS til DMEM / F12.
2. iPS Kultur
- Før iPS cellepodning, varm fødefri stamcelle dyrkningsmedium til 37 ° C, og har matrix belagte plader klar.
- Hurtigt tø IMR90-1 iPS celler i et 37 ° C vandbad. Fjern derefter kryo-hætteglas fra vandbadet og tør hætteglas med 70% ethanol. Overførsel af cellerne til et 15 ml konisk rør ved anvendelse af en 2 ml pipette for at minimere afbrydelse af celleklumper.
- Der tilsættes 5 ml varm fødefri stamcelle dyrkningsmedium til cellerne dråbevis, og bland forsigtigt. Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og fjerne supernatanten.
- Resuspendere forsigtigt celleklumper i 2 ml fødefri stamcelle dyrkningsmedium og pode celleklumper i brøndene af matrix-coatede plade. Pladen anbringes i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2, 95% fugtighed.
- Skift IPS cellekulturmedium dagligt. Overhold udifferentierede kolonier fem til syv dage efter podning. Check for udifferentierede kolonier, der er klar til passage (kolonier med en tæt center) under et lysmikroskop.
3. Passage IPS Cells
- Forud for begyndelsen til passage IPS-celler, varme dispase løsning, DMEM / F12 og feeder-fri stamcelle dyrkningsmedium til 37 ° C i vandbad.
- Før passage iPS celler, fjerne eventuelle områder af differentiering ved at skrabe området og opsugning mediet. Skyl forsigtigt IPS-celler med 2 ml DMEM / F12.
- Der tilsættes 1 ml 1 mg / ml dispase til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 7 min. Aspirer dispase og skylles forsigtigt cellekolonier med 2 ml DMEM / F12 to gange. Efter skylning, tilsættes 2 ml fødefri stamcelle dyrkningsmedium til hver brønd.
- Anvendelse af en 5 ml pipette forsigtigt at skrabe kolonier af pladen til dannelse af celleklumper. Overfør fritliggende celleklumper til et 15 ml konisk rør. Tilsæt tilstrækkeligt fødefri stamcelle dyrkningsmedium til frø næste passage af celler.
4. Generation af EB'er Brug mikrobrøndsplader
- Udarbejdelse af en enkelt celle suspension af iPS-celler
- Fjern medium fra IPS-celler og skyl IPS-celler med 2 ml DMEM / F12. Tilføj 750 pi Accutase IPS celler på hver brønd i 6-brønds plade. Inkuberes cellerne ved 37 ° C og 5% CO 2 for at tillade cellerne at løsne sig fra pladen (ca. 5-10 minutter).
- Brug en pipette til forsigtigt dissociere eventuelle tilbageværende celler og til at løsne eventuelle resterende celler på pladens overflade. Overfør cellerne til et 50 ml konisk rør. Skyl plade med 5 ml DMEM / F12 og kombinere skyllet DMEM / F12 med cellerne i den koniske rør. Pass cellesuspensionen gennem en 40 um cellefilter at fjerne eventuelle resterende celleklumper.
- Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at fjerne Accutase. Resuspender cellepelleten i EB formation medium, således at cellekoncentrationen er ca. 0,5-1,0 x 10 7 celler / ml.
- Bestem antallet af levedygtige celler ved at tælle cellerne med trypanblåt og et hæmocytometer.
- Adjusting celledensitet i mikrobrønde til dannelse størrelse kontrollerede EB'er
- Justere antallet af celler til hver brønd af mikrobrønd pladen til at generere de ønskede EB størrelser. Tilføj celler til mikrobrøndene af pladerne fremstillet i trin 1.9, fordeler cellerne ved forsigtigt at pipettere cellerne flere gange.
BEMÆRK: Antallet af celler, der kræves per brønd = ønskede antal celler pr EB x antal mikrobrønde per brønd. - Juster EB formation medium suppleret med Rock inhibitor i brøndene til en endelig volumen på 2,0 ml. Omfordel cellerne ved forsigtigt at pipettere hver brønd. Centrifuger mikrobrøndsplader ved 100 xg i 3 min. Placer pladerne i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2 og 95% fugtighed i 24 timer.
- Justere antallet af celler til hver brønd af mikrobrønd pladen til at generere de ønskede EB størrelser. Tilføj celler til mikrobrøndene af pladerne fremstillet i trin 1.9, fordeler cellerne ved forsigtigt at pipettere cellerne flere gange.
- Høst EB'er fra mikrobrøndsplader
- Harvest EB'er fra mikrobrønde ved pipettering medium i brønden op og ned med en 1 ml mikropipette at fjerne det meste af EBS. Før EB suspensionen gennem et omvendt 40 um cellesi på toppen af en 50 ml konisk rør for at fjerne enkelte celler.
- Vask mikrobrøndsplade 5 gange med 1 ml DMEM / F12 for at fjerne alle EBS. Saml vasker og passere over den omvendte cellefilter. Vend cellefilter højre side opad til et nyt 50 ml konisk rør. Saml EBS ved vask med EB dannelse medium. Tæl EB'er at bestemme udbyttet.
5. Plating EB'er og igangsættende Differentiering
- Plate EBS på protein matrix overtrukket seks brønde (som i trin 1.8.1) ved en densitet på <1.000 EB'er / brønd i EB formation medium plus 10 uM Rock inhibitor. Inkuber EBS ved 37 ° C med 5% CO2 og 95% fugtighed i 24 timer.
- 24 timer efter EB plating, udskiftes med differentiering medium at indlede differentiering. Skift halvdelen af differentiering medium hver anden dag, indtil cellerne opsamles for yderligere analyse.
- Indsamle prøver på dag 6, 17, 29 og 60 til at udføre RT-PCR, immunocytochemistry og FACS at validere ekspression af karakteristiske RPE gener og proteiner.
6. RNA-ekstraktion og PCR
- Uddrag RNA fra EB prøver efter instruktionerne i kommercielt tilgængelige kit. Bestem RNA-koncentrationen ved anvendelse af et spektrofotometer.
- Udfør revers transkription på 100 ng af total RNA ifølge kommercielt tilgængelige RNA til cDNA revers transkript kit.
- Udfør PCR med 10 ng af cDNA under anvendelse af de følgende primere (tabel 1) ved en koncentration på 10 pmol / 10 ng cDNA. Indstil PCR som følger: denaturere DNA ved 95 ° C i 5 minutter, forstærke med 35 cykler ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek, 72 ° C i 1 min, efterfulgt af en endelig cyklus ved 72 ° C i 10 min. Kør PCR-produktet på en 1% agarosegel.
7. Immuncytokemi
- Vask EBS med PBS to gange ved stuetemperatur. Fix EBS ved stuetemperatur i 4% paraformaldehyde i 10 min. Skyl en gang med PBS ved stuetemperatur. Opbevar prøver i PBS ved 4 ° C indtil anvendt til farvning.
- På farvning dag, behandle de faste celler med fiksering og permeabilisering reagenser. Inkuber prøverne med blokerende opløsning (10% gedeserum i permeabilisering opløsning) i 1 time ved stuetemperatur.
- Udfør immunkemi i 10% gedeserum i permeabilisering opløsning under anvendelse af følgende primære antistoffer ved de angivne koncentrationer: anti-Pax6 (1:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), og anti- ZO1 (1: 100). Inkuber prøver med tilsvarende antistoffer O / N ved 4 ° C.
- Næste dag, fjerne det primære antistof fra cellerne og skylles prøverne tre gange med PBS. Inkuber prøver med fluoroforen-konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern det sekundære antistof fra cellerne og skylles prøverne tre gange i PBS. Monter dækglas på objektglas med DAPI indeholdende mounting medium og tillade prøver at indstille O / N i et mørkt kammer.Brug et fluorescensmikroskop at visualisere farvning.
8. farvning for FACS-analyse
- Vask de dyrkede EB'er i PBS to gange. Inkubér EBS med 0,5 ml 0,25% trypsin i 5-10 min at foretage en enkelt cellesuspension. Neutraliseres trypsin med trypsin neutraliserende opløsning (1 ml / brønd).
- Overfør enkelt cellesuspension til et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 600 xg i 10 min.
- Supernatanten fjernes, og tilsættes 10 ml DMEM / F12 til cellerne i røret. Vend forsigtigt at blande cellerne. Der centrifugeres ved 600 x g. Efter centrifugering Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i FACS farvning buffer.
- Tæl det samlede antal celler. Centrifuger ved 600 x g i 10 min. Efter centrifugering skille supernatant. Fix cellerne umiddelbart ved tilsætning af 0,5 ml 4% paraformaldehyd. Bland godt ved forsigtig vortex. Inkuberes cellerne ved 4 ° C i 20 min.
- Centrifuger ved 600 xg i 10 minutter og fjernsupernatant. Vortex forsigtigt at forstyrre cellepelleten. Permeabilisere cellerne ved at tilsætte 1 ml afkølet permeabilisering opløsning. Vortex forsigtigt blandes og inkuberes på is i 30 minutter.
- Centrifuger ved 600 x g i 10 min, og supernatanten fjernes. Tilsæt 3 ml FACS-farvning buffer og resuspender. Gentag dette trin for en mere tid. Resuspender cellerne i FACS-farvning puffer ved en slutkoncentration på 5 x 10 6 celler / ml.
- Overfør 100 pi af cellesuspensionen (0,5 x 10 6 celler) til hver mikrocentrifugerør og tilføje anbefalede volumen af primært antistof. For Pax6, tilsættes 5 pi PE anti-Pax6 i 100 pi cellesuspension. For MITF tilsættes 5 pi anti-MITF i 100 pi cellesuspension.
- Bland og inkuber ved stuetemperatur i 60 min. Tilsæt 3 ml FACS-farvning buffer. Blandes og centrifugeres ved 600 xg i 10 min. Fjern supernatanten og gentag 8.16 to yderligere gange.
- For MITF farvning, inkuberes cellerne i sekundær Antibody, gede-anti-muse Alexa Fluor 488 ved en fortynding på 1: 2.000 i 1 time ved 4 ° C. For Pax6 farvning, undgå dette trin.
- Vask cellerne med 5 ml FACS-farvning buffer og centrifugeres ved 600 xg i 10 min. Gentag fremgangsmåden til to gange mere.
- Resuspender cellerne i 500 pi FACS-farvning buffer og vortex forsigtigt at forstyrre cellepelleten. Prøver er klar til flowcytometrisk analyse.
9. iPS-RPE Isolering og Kultur
- På dag 29, omhyggeligt skåret omkring de udvalgte pigmenterede kolonier fra kulturen pladen ved hjælp af en 200 pi pipettespids. Overfør flydende kolonier til et 15 ml konisk rør. Centrifuger kolonier ved 600 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og fjerne supernatanten.
- Resuspender cellekolonier i 10 ml DMEM / F12 og centrifugeres ved 600 xg i 10 min. Fjern supernatanten.
- Der fremstilles en enkelt cellesuspension ved at inkubere kolonier med 2 ml 0,25% trypsin ved 37 ° C i 7-10 min. Forsigtigt vortexes cellesuspensionen at dissociere kolonierne.
- Neutraliseres trypsin ved at tilsætte 2 ml iPS-RPE medium. Centrifuger ved 600 xg i 10 min og kassér supernatanten. Resuspender de enkelte celler i 2 ml iPS-RPE medium. Overfør celler i et protein matrix overtrukket plade med 6 brønde og anbringes i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette eksperiment iPS-celler blev dyrket og differentieret til RPE afstamning fra EB'er. EB'er af kontrollerede størrelser blev dannet under anvendelse mikrobrøndsplader. Som det ses i figur 1 EB formation var homogen i mikrobrøndsplader. Disse EB'er blev derefter opsamlet og udpladet på plader med 6 brønde (figur 2).
RPE kan identificeres ved deres klassiske sekskantet morfologi, pigmentering, og udtryk for RPE markører. Efter 12 ugers dyrkning havde 200-celle EB'er udviklet astrocyt og fibroblast morfologi. Nr pigmentering blev observeret i disse celler (figur 3A). Større EB'er udviklet et monolag af klassisk RPE morfologi og pigmentering (figur 3B og C) Immuncytokemi at detektere RPE markører MITF og ZO1 viste co-ekspression af disse proteiner, der var blevet afledt fra 500-celle og 3000-celle EBS (figur 4) .
EXpressions af øjet område og RPE-gener blev overvåget ved PCR. Figur 5 viser genekspressionsprofilen af neuroektodermal, eye field forstadier, og RPE markører i forskellige størrelser i EBS. Vigtigt er det, blev den specifikke RPE markering, RPE65 påvist begyndende på dag 17.
For at kvantificere udbyttet af celler, der var differentieret i RPE afstamning blev FACS-analyse udført for at detektere neuroektodermale og RPE precursor markører, Pax6 og MITF henholdsvis. Figur 6A viser neuroektodermale markør Pax6 i forskellige størrelser i EBS på forskellige tidspunkter. Ca. 50% af de analyserede celler var positive for Pax6 på dag 6 i kultur i de 3.000-celle EB'er. Derudover FACS-analyse af RPE markering, MITF om forskellige EB størrelser viste, at 20% af cellerne udtrykte MITF ved dag 60 af differentiering.
Cultured RPE er også karakteriseret ved deres evne til at miste deres pigment og polygonale morfologi og opnå enfibroblast fænotype ved passage. Derfor, for at afgøre, om IPS afledt RPE besidder disse egenskaber, vi mekanisk isoleret og passeret cellerne. Figur 7A viser de nyligt passerede celler har mistet pigment og opnået fibroblast morfologi. Derudover florerede disse celler og genvandt det klassiske polygonale morfologi ved konfluens (Figur 7B). Inden for et par uger, genvandt disse celler deres pigmentering (Figur 7C).
| Gene | NICB henvisning | Sequence (5'-3 ') | Størrelse (bp) | |
| Pax6 | NM_001258465.1 | F | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | F | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | F | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | F | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH | NM_001256799.1 | F | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | TCCACCACCCTGTTG CTGTA |
Tabel 1. PCR primersekvenser for Pax6, RPE65, RX, MITF og GAPDH-gener.
Figur 1. Dannelse af EB'er med mikrobrøndsplader. Hver mikrobrønd indeholder (A) 100 celler, (B) 200 celler, (C) 500 celler, og (D) 3.000 celler. Cellerne blev inkuberet 24 timer ved 37 ºC og 5% CO2 i dannelsen af EB'er. (Forstørrelse 100X, skala bar = 400 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. EB'er høstet fra mikrobrøndsplader. (A) 200-celle EB, (B) 500-celle EB, (C) 3.000-celle EB, og (D) 15.000 celle EB. (Forstørrelse 200X, skala bar = 200 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. iPS-afledte RPE fra forskellige størrelser af EB'er. EB'er blev dyrket i 12 uger. (A) 200-celle EB'er kun havde udviklet astrocyt og fibroblast morfologi uden pigmentering; mens 80% - 90% af cellerne i 500-celle EBS (B og C) udviklede et monolag af polygonale pigmenterede celler. (A & B: Forstørrelse 100X, skala bar= 400 um; (C):. Forstørrelse 200X, skala bar = 200 um) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Co-ekspression af MITF og ZO1. 500- og 3000-celle EB'er udtrykte MITF og ZO1 efter 17 dages differentiering. (Forstørrelse 400X, skala bar = 20 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Genekspressionsprofil af forskellige størrelser af EB'er på forskellige tidspunkter af differentiering. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. FACS-analyse af varierede EB størrelse for RPE differentiering. (A) FACS data af neuroektodermale markør Pax6 i forskellige størrelser i EBS under differentiering. (B) FACS-analyse af RPE markør MITF på varierede EB størrelser på dag 60 af differentiering. Det højeste niveau af MITF nåede 20% og var konstant mellem EB størrelse på 500, 3.000 og 15.000 celler.
Figur 7. Fortsat kultur manuelt isoleret RPE. (A) RPE blev subdyrket og erhvervet fibroblast morphology efter passage. (B & C) Celler udviklet polygonal morfologi og pigmentering over tid. (Forstørrelse 100X, skala bar = 400 um). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at realisere det fulde løfte om pluripotente stamceller til celleterapi, er det nødvendigt at regulere deres differentiering på en konsekvent og reproducerbar måde. Denne rapport beskriver protokoller til at danne størrelse-kontrollerede EB'er der anvender mikrobrøndsplade teknologi, indlede differentiering mod RPE og identificere protein- og gen-markører for RPE. For at synkronisere den in vitro differentiering blev homogene størrelser EB'er dannet af kendte antal iPS celler centrifugeret i mikrobrøndsplader ved tvungen sammenlægning. Immuncytokemi og revers-transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) anvendes til at overvåge udtrykkene RPE proteiner og gener af forklaret. Endelig blev effektiviteten af differentiering i forskellige størrelser af EB'er analyseret ved FACS-analyse. Disse teknikker kan lette differentieringen af iPS celler i RPE for fremtidige ansøgninger.
Der er flere vigtige punkter i denne metode, skal omhyggeligt udført til ensure succesen af denne protokol og opnåelse af nøjagtige data. Det første afgørende skridt forekommer under IPS cellekultur. iPS-celler skal holdes i en pluripotent tilstand for at bevare deres stemness. Cellerne skal have mediet ændret dagligt for at opretholde passende niveauer af bFGF og nøje inspiceres dagligt for tegn på differentiering. Udifferentierede iPS celler vokser som kompakte flercellede kolonier. Cellerne bør have en høj nuklear til cytoplasma ratio og fremtrædende nucleoli. IPS kolonier er kendetegnet ved en tydelig grænse med flere lag af celler i centrum. Tegn på differentiering omfatte tab af definerede koloni grænser uensartet cellemorfologi, og fremkomsten af indlysende celletyper, såsom neuroner og fibroblaster. Enkelte celler, der har differentierede kan fjernes ved dispase og skylning, imidlertid kolonier med disse karakteristika skal fjernes manuelt fra kulturen 22. Udarbejdelse af en enkelt iPS cellesuspension FOr danner EBS er det næste afgørende skridt. Det er vigtigt at fremstille en suspension uden celleaggregater for nøjagtigt at levere det ønskede antal celler til mikrobrønden plade og forberede den ønskede størrelse EB. RNA forberedelserne til PCR-analyse er også vigtige. Uensartet RNA kvalitet er en væsentlig kilde til variation i PCR-data. RNA-ekstraktion bør give minimalt nedbrudt RNA for de bedste resultater. Vellykket RNA-ekstraktion vil give total RNA med minimal nedbrydning og fri for kontaminerende RNaser. Efter bestemmelse af RNA-koncentrationen ved spektrofotometri ved 260 nm, bør renheden af prøven bestemmes ved 230 og 280 nm for at påvise forurening med polysaccharider eller protein. 230: 260: 280 ratio for RNA bør være 1: 2: 1 for at angive kvaliteten RNA høj med nogen forurening 23. Endelig er det vigtigt at tilstrækkeligt fikseres cellerne for FACS-farvning. Under denne fiksering trin skal cellerne adskilles for at forhindre sammenklumpning. Insufficient celle resuspension før permeabilisering vil føre til celle sammenklumpning og unøjagtige farvning.
Vi anbefaler, at protokollen skal følges som beskrevet, men et par ændringer kan foretages, hvis det er nødvendigt. Under genereringen af EB'er beskrevet i trin 4, kan antallet af celler pr EB ligge mellem 500 til 3.000 for at opnå et højt udbytte af celler differentieret i RPE. Hvis antallet af iPS-celler er begrænset, vil 500-celle EB'er producere RPE sammenlignes med de 3.000-celle EB'er. Der skal træffes ekstra pleje under RNA-ekstraktion, der er beskrevet i trin 6. Prøver skal køres i tre eksemplarer til at sikre, at kvaliteten RNA høj kan erhverves. Under immuncytokemi som beskrevet i trin 7, kan de primære og sekundære antistofkoncentrationer justeres efter behov for at forbedre signal intensitet og reducere baggrunden. De passende positive og negative kontroller bør indgå i analysen. Under trin 8, FACS-analyse, hvis de forventede resultater ikke ACQgendannes for efter farvning, kan et lille udsnit af de farvede celler placeres på et objektglas og ses med et mikroskop for at visualisere farvning. De passende positive og negative kontroller bør indgå i analysen. Hvis cellerne ikke farves som forventet, kan antistofkoncentrationer øges eller mindskes efter behov.
Teknikken beskrevet i denne rapport vil resultere i et højere udbytte af RPE end spontan differentiering, uden brug af tilsatte kemikalier. Den væsentligste begrænsning ved denne fremgangsmåde er imidlertid, at der også vil være et stort antal ikke-RPE-celler genereret. Derfor skal RPE omhyggeligt udvalgt og beriget som beskrevet i trin 9 for at sikre en homogen population.
Betydningen af denne fremgangsmåde er, at et højere udbytte af RPE kan udledes iPS celler end spontane differentiering teknikker. Anvendelsen af små molekyler til at udlede RPE Ips er også blevet rapporteret at give et højt udbytte afdifferentierede celler, men denne teknik er meget mere kompleks og kræver timing og koncentration af de små molekyler, der skal optimeres for at opnå de ønskede resultater 7,10. Desuden, de små molekyler, der anvendes i disse metoder har pleiotrope virkninger, der kan forvirre resultaterne.
Den beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til at fremstille EB'er af ønskede størrelser med høj reproducerbarhed. Denne teknik genereret EB'er af ensartede størrelser, som blev brugt til at optimere differentieringen af iPS-celler mod RPE afstamning uden brug af ekstra kemikalier. IPS-RPE celler afledt af EB'er kan derefter yderligere anvendes ved transplantation undersøgelser for at bekræfte deres integration i nethinden i en funktionel organisation. Disse celler kan også give en god forskning model til at studere patogenesen af forskellige RPE sygdomme in vitro. Anvendeligheden af denne fremgangsmåde kan anvendes til den styrede differentiering i mange andre celletyper, afhængigtstørrelsen af EBS og in vivo oprindelse cellen i blastocyst. Celler af ectoderm vil give anledning til neuroner, hud, hår og brystkirteladenomer celler; endoderm vil give anledning til mave, tyktarm, lunger og intestinale celler; mesoderm vil give anledning til skeletmuskulatur, hjerte, nyre og bindevævsceller 3,11,19. Når den korrekte EB størrelse er blevet bestemt, behøver kun de differentierede celler, der skal analyseres ved immuncytokemi eller FACS for den korrekte ekspression af markørproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
- The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).
