Summary
Målet med denne rapporten er å beskrive protokoller å utlede retinal pigment epitel (RPE) fra indusert pluripotent stilk (iPS-celler) ved hjelp av forskjellige størrelser av embryoid organer.
Introduction
Induserte pluripotent stilk (IPS) celler er en type av pluripotent stamcelle avledet ved reprogrammering voksne celler med ytre faktorer 1. I motsetning til dette, embryonale stamceller (ESCS), en annen type av pluripotent stamcelle, blir generert fra den indre cellemasse av blastocysten 2-3. Til tross for deres forskjellige opphav, IPS-celler og ESCs er sammenlignbare i deres ubegrenset kapasitet til å replikere in vitro og i sin evne til å differensiere til en hvilken som helst celletype 4-5. Disse egenskapene til iPS-celler gjør dem ideelle kandidater for applikasjoner i personlig regenerativ medisin. Nyere forskning innsats er fokusert på å utvikle robuste differensiering protokoller for å produsere spesialiserte voksne celler inkludert retinal pigment epitel (RPE) 6-11.
For potensielle kliniske anvendelser av iPS avledet celler, er essensielt en rettet differensiering for den spesifikke celletype. Det finnes ulike fremgangsmåterpublisert for rettet differensiering av både ESCs og iPS-celler i RPE som varierer mye i deres effektivitet 6-7, 12-16. Vi vet fortsatt ikke mange av de molekylære hendelser som styrer celle / vev skjebne under utvikling eller differensiering. I de senere årene har det vært gjort for å utvikle differensiering protokoll som kan etterligne den embryologiske utviklingen så mye som mulig. Under blastocyst fase-iverk populasjon av stamceller er sammen i et tredimensjonalt mikromiljøet. Så ble forskjellige strategier anvendes for å gjøre de ESC / IPS-celler montert sammen og dyrke dem i tre dimensjoner. Disse stamcelle aggregater kalles embryoid organer (EBS). Studier har vist at EB differensiering av stamceller ligne tidlig stadium av embryo- utvikling og kan spontant gi opphav til primitive endoderm på sin ytre overflate. Senere, som EB utvikling utvikler seg, differensierte celle fenotyper av alle tre bakterie linjene vises 17-18. Therefore, har EBS basert differensiering protokoller tiltrakk seg mye oppmerksomhet for in vitro differensiering av ESC / iPS-celler og er en god kandidat for RPE generasjon fra pluripotente stamceller 13.
EBS kan gjøres ved hjelp av flere metoder fra ESC / iPS-celler. Utgangspunktet, EBS ble gjort ved å skrape av heft kolonier og opprettholde dem i ikke-tilhenger suspensjon kultur. Imidlertid gir denne tilnærmingen heterogen befolkning på EBS som forårsaker lav reproduserbarhet. Hengende dråpe cellekultur og mikro basert EBS formasjon er andre populære teknikker for EBS formasjon som gir homogene EBS av definerte størrelser som er reproduserbar. Videre kan mikro teknikken gir stort antall aggregater med mindre anstrengelse.
Differensiering av celler i EBS er regulert av en multipleks av morphogenic signaler fra den ekstracellulære og intracellulære mikromiljøet. I motsetning til differensiering i en Manolayer format, EBS gi en plattform for kompleks sammensetning av celler og intersignale å skje 17. Interessant nok var antallet pluripotente stamceller som brukes til å lage enkelt EBS observert å påvirke skjebnen til cellene. For eksempel, i et hematopoetisk differensiering undersøkelse av menneskelige ESCs, ble det observert at 500-celle EB fremmet differensiering mot myeloide cellelinjen, mens 1000-celle EB skjøvet mot erytroid herkomst 20. I en annen studie, mindre EBS favoriserte endoderm differensiering mens større EBS fremmet mot neuro-ektoderm differensiering 11, 17.
Disse siste studiene tyder på at antall ESC / iPS-celler som brukes til å lage individuelle EBS påvirke EBS basert differensiering til eventuelle celletyper. Men til vår kunnskap, finnes det ingen aktuelle studier som har belyst virkningen av EBS størrelse i sin tilbøyelighet til å skille mot RPE. Målet med denne studien er å karakterisere påvirkning avEB størrelse på indusert pluripotent stilk (iPS-celler) - retinal pigment epitel (iPS-RPE) differensiering og å identifisere den optimale celle nummer for å gjøre EBS for rettet differensiering mot RPE avstamning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av kultur reagenser og kultur Plater
- Forbered mater fritt stamcellekulturmediet ved tilsetning av 100 ml 5 x serumfritt supplement til 400 ml stamcellebasalmedium. Mediet er stabile ved 4 ° C i opp til 2 uker, og ved -20 ° C i 6 måneder.
- Tilsett 10 uM oppløsning av rho-assosiert, coiled-coil inneholdende protein kinase (Rock) inhibitor (Y-27362) med kommersielt tilgjengelig embryoid legeme (EB) dannelse medium.
- Forbered differensieringsmedium ved tilsetning av 0,1 mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 10% knockout serum erstatning (KSR) og 10 ug / ml gentamicin i Dulbeccos modifiserte Eagle medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12).
- Forbered IPS-RPE medium ved tilsetning 1x N1 supplement, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml trijod-L-thyronin natriumsalt, 20 ng / ml hydrokortison, 5 ug / ml gentamicin og 15% føtalt bovint serum (FBS) <sup> 21 til Minimum Essential Medium Eagle (MEM). Juster pH-verdien til 7,4.
- Forberede trijod-L-thyronine natriumsaltet stamløsning. Oppløs 1 mg av trijod-L-thyronin natriumsalt i 1 N natriumhydroksid ved forsiktig virvling. Legg 49 ml MEM å lage 50 ml 20 ug / ml av trijod-L-thyronin natriumsalt. Forbered porsjoner og fryse ved -20 ° C inntil nødvendig. Bruk passende volum for å oppnå ønsket konsentrasjon i sluttkulturmedium.
- Forbered hydrokortison stamløsning. Oppløseliggjøre 1 mg hydrokortison i 1 ml 100% etanol med forsiktig omrøring. Legg 19 ml MEM å lage 20 ml 50 ug / ml hydrokortison stamløsning. Delmengde og fryse ved -20 ° C inntil nødvendig. Bruk passende volum til å oppnå den ønskede konsentrasjon i den endelige kulturmedium.
- Forberede en fungerende løsning av dispase på 1 mg / ml i DMEM / F12.
- Utarbeidelse av matrix belagte plater
- Forberede proteinmatriks hentet fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouSE sarkomceller i DMEM / F12 til 0,08 mg / ml. Belegge hver brønn i en 6-brønns plate med 1 ml av matriseoppløsningen. Inkuber de belagte plater ved RT i 1 time.
- Etter 1 time inkubasjon, aspirer overflødig DMEM / F12. Tilsett 0,5 ml av materen fritt stammecellekulturmedium for å hindre uttørking av brønnene. Matrise belagte plater er klare for bruk.
- Forberede mikroplater, ved å skylle hver brønn med 2 ml DMEM / F12. Fjern DMEM / F12 og tilsett 0,5 ml av EB formasjons medium supplert med Rock inhibitor til hver brønn. Sentrifuger platen ved 2000 xg i 5 min for å fjerne eventuelle luftbobler.
- Forbered FACS farging buffer ved å blande 2% FBS, og 0,09% natrium-azid i fosfat-bufret saltvann (PBS). Juster buffer til pH 7,4.
- Forbered trypsin nøytraliserende løsning ved tilsetning av 10% FBS i DMEM / F12.
2. iPS Culture
- Før IPS celle såing, varm mater fritt stammecellekulturmedium til 37 ° C, og har den matrix belagte plater klar.
- Raskt tine IMR90-1 iPS-celler i en 37 ° C vannbad. Deretter fjerner cryo-hetteglass fra vannbadet og tørk hetteglasset med 70% etanol. Overfør cellene til en 15 ml konisk rør ved hjelp av en 2 ml pipette for å minimalisere brudd av celleklumper.
- Tilsett 5 ml varm matefritt stammecellekulturmedium til cellene dråpevis og forsiktig blanding. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur og fjern supernatanten.
- Nøye resuspendere celleklumper i 2 ml mater fritt stammecellekulturmedium og frø celleklumper i brønnene av matrise lakkert plate. Plassere platen i en 37 ° C inkubator med 5% CO2, 95% luftfuktighet.
- Endre iPS celledyrkingsmedium daglig. Observere udifferensierte kolonier fem til syv dager etter såing. Sjekk for udifferensierte kolonier som er klare for passage (kolonier med et tett sentrum) under et lysmikroskop.
3. aging av iPS-celler
- Før start til passasje de iPS-celler, varme dispase løsning, DMEM / F12 og mater fritt stamcelle kultur medium til 37 ° C i vannbad.
- Før passering iPS-celler, fjern eventuelle områder av differensiering ved å skrape området og aspirere mediet. Nøye skyll iPS-celler med 2 ml DMEM / F12.
- Tilsett 1 ml av 1 mg / ml dispase til hver brønn og inkuberes ved 37 ° C i 7 min. Aspirer dispase og forsiktig skylle cellekolonier med 2 ml DMEM / F12 to ganger. Etter skylling, tilsett 2 ml mater fritt stammecellekulturmedium til hver brønn.
- Ved hjelp av en 5 ml pipette forsiktig skrape kolonier av platen for å danne celleklumper. Overfør de frittliggende celleklumper til en 15 ml konisk tube. Legg tilstrekkelig mater-fri stamcelle kultur medium til frø neste passering av celler.
4. generasjon av EBS Bruke mikrobrønnplater
- Utarbeidelse av en enkelt celle suspensjon av iPS-celler
- Ta av medium fra iPS-celler og skyll iPS-celler med to ml DMEM / F12. Legg 750 ul accutase IPS-celler i hver brønn på 6-brønners plate. Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2 for å tillate cellene å løsne fra platen (ca. 5-10 min).
- Bruke en pipette til forsiktig dissosiere eventuelle gjenværende celler og for å løsne eventuelle gjenværende celler på plateoverflaten. Overfør cellene til en 50 ml konisk rør. Skyll plate med 5 ml DMEM / F12 og kombinere den skylles DMEM / F12 med cellene i det koniske rør. Passere cellesuspensjonen gjennom en 40 um cellefilter for å fjerne eventuelle gjenværende celleklumper.
- Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur for å fjerne accutase. Resuspender cellepelleten i EB formasjonsmediet, slik at cellekonsentrasjonen er omtrent 0,5 til 1,0 x 10 7 celler / ml.
- Bestemme antallet levedyktige celler ved å telle cellene med trypanblått, og en hemocytometer.
- Adjusting celletettheten i mikro å danne size-kontrollerte EBS
- Juster antall celler i hver brønn på mikrobrønnplate for å generere de ønskede EB størrelser. Legg cellene til mikrobrønnene av platene fremstilt i trinn 1.9, fordele cellene ved forsiktig pipettering av cellene flere ganger.
MERK: Antall celler per brønn kreves = ønsket antall celler pr EB x antall mikro pr brønn. - Juster EB formasjonen medium supplert med Rock inhibitor i brønnene til et sluttvolum på 2,0 ml. Omfordele cellene ved forsiktig pipettering hver brønn. Sentrifuger mikrobrønnplater ved 100 x g i 3 min. Plassere platene i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 95% fuktighet i 24 timer.
- Juster antall celler i hver brønn på mikrobrønnplate for å generere de ønskede EB størrelser. Legg cellene til mikrobrønnene av platene fremstilt i trinn 1.9, fordele cellene ved forsiktig pipettering av cellene flere ganger.
- Høsting EBS fra mikroplater
- Innhøsting EBS fra mikro ved pipettering medium i brønnen opp og ned med en 1 ml mikropipette for å fjerne det meste av EBS. Før EB suspensjon gjennom en omvendt 40 mikrometer cellesil på toppen av en 50 ml konisk rør for å fjerne enkle celler.
- Vask mikroplaten 5 ganger med 1 ml DMEM / F12 for å fjerne alle EBS. Samle vasker og gå over invertert celle sil. Snu celle sil høyre side opp til en ny 50 ml konisk tube. Samle EBS ved å vaske med EB formasjon medium. Telle EBS å bestemme yield.
5. Plating EBS og Initiere Differensiering
- Plate EBS på protein matrise lakkert seks brønners plater (som i trinn 1.8.1) med en tetthet på <1,000 EBS / brønn i EB formasjons medium pluss 10 uM Rock inhibitor. Inkuber EBS ved 37 ° C med 5% CO2 og 95% fuktighet i 24 timer.
- 24 timer etter at EB plating, erstatte med differensiering medium for å starte differensiering. Endre halvdel av differensiering medium hver annen dag inntil cellene oppsamlet for videre analyse.
- Samle inn prøver på dag 6, 17, 29 og 60 for å gjennomføre RT-PCR, immunocytochemistry og FACS for å bekrefte ekspresjon av karakteristiske RPE-gener og proteiner.
6. RNA Utvinning og PCR
- Utdrag RNA fra EB prøvene i henhold til instruksjonene i den kommersielt tilgjengelige kit. Bestem RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer.
- Utføre revers transkripsjon på 100 ng av total RNA ifølge kommersielt tilgjengelig RNA til cDNA revers transkripsjon kit.
- Utføre PCR med 10 ng av cDNA ved anvendelse av de følgende primere (tabell 1) ved en konsentrasjon på 10 pmol / 10 ng cDNA. Sett PCR som følger: denaturering DNA ved 95 ° C i 5 minutter, forsterke med 35 sykluser ved 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 30 sek, 72 ° C i 1 minutt, etterfulgt av en endelig syklus på 72 ° C i 10 min. Kjør PCR-produktet på en 1% agarosegel.
7. Immunocytochemistry
- Vask EBS med PBS to ganger på RT. Fest EBS ved RT i 4% paraformaldehyde i 10 min. Skyll en gang med PBS ved RT. Oppbevar prøver i PBS ved 4 ° C inntil anvendelse for farging.
- På farging dag, behandle de faste celler med fiksering og permeabilization reagenser. Inkuber prøvene med blokkeringsløsning (10% geiteserum i permeabilization oppløsning) i 1 time ved RT.
- Utføre immunokjemien i 10% geit serum i permeabilization løsning ved hjelp av følgende primære antistoffer ved de angitte fortynninger: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), og anti- ZO1 (1: 100). Inkuber prøver med tilsvarende antistoffer O / N ved 4 ° C.
- Neste dag fjernes det primære antistoff fra cellene og skyll prøvene tre ganger med PBS. Inkuber prøver med fluoroforen-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved RT.
- Fjern det sekundære antistoff fra cellene og skyll prøvene tre ganger i PBS. Monter dekkglass på objektglass med DAPI inneholder monteringsmedium og tillate prøver å sette O / N i et mørkt kammer.Bruke et fluorescensmikroskop for å visualisere farging.
8. Farging for FACS Analyse
- Vask de dyrkede EBS i PBS to ganger. Inkuber EBS med 0,5 ml av 0,25% trypsin i 5-10 minutter for å gjøre en enkel cellesuspensjon. Nøytralisere trypsin med trypsin nøytraliserende oppløsning (1 ml / brønn).
- Overfør enkelt cellesuspensjon til et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 600 xg i 10 min.
- Kast supernatanten og tilsett 10 ml DMEM / F12 til cellene i røret. Vend forsiktig å blande cellene. Sentrifuger ved 600 x g. Etter sentrifugering kasseres supernatanten og resuspender cellene i FACS farging buffer.
- Telle det totale antall celler. Sentrifuger ved 600 xg i 10 min. Etter sentrifuge kast supernatanten. Fikse cellene umiddelbart ved å legge 0,5 ml av 4% paraformaldehyde. Bland godt ved forsiktig risting. Inkuber cellene ved 4 ° C i 20 min.
- Sentrifuger ved 600 xg i 10 minutter og fjernsupernatant. Vortex forsiktig å forstyrre cellepelleten. Permeabilisere cellene ved å tilsette 1 ml av kjølt permeabilization løsning. Vortex forsiktig for å blande og inkuber på is i 30 min.
- Sentrifuger ved 600 xg i 10 minutter og fjerne supernatanten. Tilsett 3 ml FACS farging buffer og resuspender. Gjenta dette trinnet for en gang til. Resuspender cellene i FACS farging buffer til en sluttkonsentrasjon på 5 x 10 6 celler / ml.
- Overfør 100 ul av cellesuspensjonen (0,5 x 10 6 celler) til hver mikrofugerør og tilsett den anbefalte volum av primært antistoff. For Pax6, tilsett 5 mL av PE anti-Pax6 i 100 mL av cellesuspensjon. For MITF, tilsett 5 ul av anti-MITF i 100 ul av cellesuspensjonen.
- Bland og inkuber ved romtemperatur i 60 min. Tilsett 3 ml FACS farging buffer. Miks og sentrifuger ved 600 xg i 10 min. Fjern supernatanten og gjenta 8.16 for ytterligere to ganger.
- For MITF farging, inkuberes cellene i videregående Antibody, geit anti-mus Alexa Fluor 488 ved en fortynning på 1: 2000 i 1 time ved 4 ° C. For Pax6 farging, unngå dette trinnet.
- Vask cellene med 5 ml FACS farging buffer og sentrifuger ved 600 xg i 10 min. Gjenta prosessen for to ganger til.
- Resuspender cellene i 500 pl FACS farging buffer og vortex forsiktig å forstyrre cellepelleten. Prøvene er klare for flowcytometrisk analyse.
9. iPS-RPE Isolasjon og kultur
- På dag 29, må du kutte rundt de valgte pigmenterte kolonier fra kultur plate ved hjelp av en 200 mL pipette. Overfør de flytende kolonier til et 15 ml konisk rør. Sentrifuger kolonier ved 600 xg i 10 min ved romtemperatur og fjern supernatanten.
- Resuspendere cellekolonier i 10 ml DMEM / F12 og sentrifuger ved 600 xg i 10 min. Fjern supernatanten.
- Fremstille en enkel cellesuspensjon ved å inkubere kolonier med 2 ml av 0,25% trypsin ved 37 ° C i 7-10 min. Forsiktig vortex cellesuspensjon til distansere koloniene.
- Nøytralisere trypsin ved å legge 2 ml iPS-RPE medium. Sentrifuger ved 600 xg i 10 min, og supernatanten kastes. Resuspender enkeltceller i 2 ml iPS-RPE medium. Overfør cellene i et protein matrise lakkert 6-brønns plate og plasseres i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette eksperimentet, IPS-celler ble dyrket og differensiert i RPE-linjen fra EBS. EBS av kontrollerte størrelser ble dannet ved hjelp av mikroplater. Som vist i figur 1 EB formasjonen var homogen i mikrobrønnplater. Disse EBS ble deretter oppsamlet og utsådd på 6-brønners plater (figur 2).
RPE kan identifiseres ved deres klassiske heksagonal morfologi, pigmentering, og ekspresjon av RPE-markører. Etter 12 uker med kultur, hadde 200-celle EBS utviklet astrocyte og fibroblast morfologi. Ingen pigmentering ble observert i disse cellene (figur 3A). Større EBS utviklet et monolag av klassisk RPE morfologi og pigmentering (figur 3B og C) Immunocytochemistry å detektere RPE markører, MITF og ZO1 viste ko-ekspresjon av disse proteiner som hadde blitt avledet fra 500-celle og celle-3000 EBS (figur 4) .
EXpressions av øyet felt og RPE-genene ble overvåket ved hjelp av PCR. Figur 5 viser genekspresjon profil neuroectodermal, øye felt forløpere, og RPE markører i forskjellige størrelser av EBS. Viktigere, ble det bestemt RPE markør, RPE65 oppdaget begynner på dag 17.
Å kvantifisere utbyttet av celler som hadde differensiert inn RPE avstamning, ble FACS analyse utført for å oppdage neuroectodermal og RPE forløper markører, Pax6 og MITF hhv. Figur 6A viser neuroectodermal markør Pax6 i forskjellige størrelser av EBS på ulike tidspunkter. Omtrent 50% av de analyserte celler var positive for Pax6 på dag 6 av kultur i 3000-celle EBS. I tillegg, FACS-analyse av RPE-markør, MITF på varierte EB størrelser viste at 20% av cellene uttrykte MITF ved dag 60 av differensiering.
Cultured RPE er også preget av sin evne til å miste sin pigment og kantet morfologi og få enfibroblast fenotype på aging. Derfor, for å avgjøre om de iPS avledet RPE besitter disse egenskapene, vi mekanisk isolert og passaged cellene. Figur 7A viser nylig passaged celler har mistet pigment og fått fibroblast morfologi. I tillegg er disse cellene proliferated og gjenvant den klassiske kantet morfologi ved samløpet (Figur 7B). Innen et par uker, disse cellene gjenvant sin pigmentering (figur 7C).
| Gene | Nicb henvisning | Sekvens (5'-3 ') | Størrelse (bp) | |
| Pax6 | NM_001258465.1 | F | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | F | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | F | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | F | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH | NM_001256799.1 | F | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | TCCACCACCCTGTTG CTGTA |
Tabell 1. PCR primersekvenser for Pax6, RPE65, RX, MITF og GAPDH gener.
Figur 1. Dannelse av EBS med mikrobrønnplater. Hver mikro inneholder (A) 100-celler, (B) 200-celler (C) 500-celler, og (d) 3000 celler. Celler ble inkubert 24 timer ved 37 ºC og 5% CO 2 for dannelsen av EBS. (Forstørrelse 100X, skala bar = 400 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. EBS høstet fra mikrobrønnplater. (A) 200-celle EB, (B) 500-celle-EB, (C) 3000-celle-EB, og (D) 15000-celle EB. (Forstørrelse 200X, skala bar = 200 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. iPS-avledet RPE fra forskjellige størrelser av EBS. EBS ble dyrket i 12 uker. (A) 200-celle EBS hadde bare utviklet astrocyte og fibroblast morfologi uten pigmentering; mens 80% - 90% av cellene i en 500 celle EBS (B og C) et monolag av polygonale pigmenterte celler. (A & B: Forstørrelse 100X, skala bar= 400 mikrometer; (C). Forstørrelse 200X, skala bar = 200 mikrometer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Co-uttrykk for MITF og ZO1. 500- og 3000-celle EBS uttrykt MITF og ZO1 etter 17 dager med differensiering. (Forstørrelse 400X, skala bar = 20 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Gene uttrykk profilen til forskjellige størrelser av EBS på ulike tidspunkter for differensiering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. FACS analyse av variert EB størrelse for RPE differensiering. (A) FACS data fra neuroectodermal markør Pax6 i forskjellige størrelser av EBS under differensiering. (B) FACS analyse av RPE markør MITF på varierte EB størrelser i dag 60 av differensiering. Det høyeste nivået av MITF nådde 20% og var konstant mellom EB størrelse på 500, 3000 og 15 000 celler.
Figur 7. Fortsatt kultur manuelt isolert RPE. (A) RPE ble dyrket og kjøpte fibroblast morphology etter passering. (B & C) Celler utviklet kantet morfologi og pigmentering over tid. (Forstørrelse 100X, skala bar = 400 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å realisere den fulle løftet av pluripotente stamceller for celleterapi, er det nødvendig å regulere deres differensiering på en konsekvent og reproduserbar måte. Denne rapporten beskriver protokoller for å danne size-kontrollerte EBS bruker mikro plate-teknologi, starter differensiering mot RPE og identifisere protein og genmarkører av RPE. Å synkronisere in vitro differensiering, ble homogene størrelser av EBS dannet av kjente antall iPS-celler sentrifugert i mikroplater med tvungen aggregering. Immunocytokjemi og revers-transkripsjon polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) benyttes for å overvåke uttrykk RPE proteiner og gener av forklart. Til slutt, ble effektiviteten av differensiering i forskjellige størrelser av EBS analysert ved FACS-analyse. Disse teknikkene kan lette differensiering av iPS-celler til RPE for fremtidige søknader.
Det er flere viktige punkter i denne metoden som må være nøye utført i eONTROLLER suksessen til denne protokollen og oppnåelse av nøyaktige data. Den første viktig skritt oppstår under iPS cellekultur. iPS-celler må opprettholdes i en pluripotent tilstand for å opprettholde sin stemness. Cellene må ha mediet skiftet daglig for å opprettholde riktige nivåer av bFGF og nøye kontrollert daglig for tegn på differensiering. Udifferensierte iPS-celler vokse som kompakte flercellede kolonier. Cellene bør ha et høyt atom til cytoplasma-forhold og fremtredende nukleoli. IPS kolonier er kjennetegnet ved en tydelig kant, med flere lag av celler på midten. Tegn på differensiering inkluderer tap av koloni definerte grenser, ikke-uniform cellemorfologi, og utseendet av åpencelletyper, slik som nerveceller og fibroblaster. Enkle celler som har differensiert kan fjernes ved skylling og dispase imidlertid kolonier med disse karakteristika må fjernes manuelt fra kulturen 22. Fremstilling av en enkelt cellesuspensjon IPS for danner EBS er den neste kritiske trinn. Det er viktig å tilberede en suspensjon uten celleaggregater for å levere nøyaktig det ønskede antall celler i mikrobrønnplate og fremstille den ønskede størrelse EB. RNA forberedelsene til PCR-analyse er også viktig. Inkonsekvent RNA kvalitet er en betydelig kilde til variasjon i PCR data. RNA ekstraksjon bør gi minimalt degradert RNA for best resultat. Vellykket RNA ekstraksjon vil gi total RNA med minimal nedbrytning og fri for kontaminerende RNaser. Etter bestemmelse av RNA-konsentrasjonen ved hjelp av spektrofotometri ved 260 nm, må renheten av prøven bestemmes ved 230 og 280 nm for å detektere forurensning med polysakkarider eller proteiner. 230: 260: 280-forhold for RNA bør være 1: 2: 1 for å indikere høy kvalitet RNA uten kontaminering 23. Endelig er det viktig å tilstrekkelig fiksere cellene for FACS farging. I løpet av denne fikseringstrinn, må cellene bli separert for å forhindre klumpdannelse. Insuffictorer celle resuspensjon før permeabilization vil føre til celle klumper og unøyaktig farging.
Vi anbefaler at protokollen følges som beskrevet, men kan bli gjort noen endringer om nødvendig. Under dannelse av EBS er beskrevet i trinn 4, kan antallet celler pr EB varierer mellom 500 til 3000 for å oppnå et høyt utbytte av celler differensiert i RPE. Hvis antall iPS-celler er begrenset, vil 500-celle EBS produsere RPE sammenlignbare med 3000-celle EBS. Ekstra hensyn må tas i løpet av RNA utpakkingen beskrevet i trinn 6. Prøvene skal kjøres i tre eksemplarer for å sikre at høy kvalitet RNA kan bli kjøpt opp. I løpet av immunocytokjemi som beskrevet i trinn 7, kan de primære og sekundære antistoffkonsentrasjoner bli justert etter behov for å forbedre signalintensitet og redusere bakgrunnen. De passende positive og negative kontroller bør inkluderes i analysen. I trinn 8, FACS-analyse, dersom de forventede resultatene er ikke ACQuired etter farging, kan et lite utvalg av de fargede celler bli plassert på et lysbilde og sett på med et mikroskop for å visualisere flekker. De passende positive og negative kontroller bør inkluderes i analysen. Dersom cellene ikke er farget som forventet, kan antistoffkonsentrasjonen økes eller minskes etter behov.
Teknikken beskrevet i denne rapporten vil resultere i et høyere utbytte av RPE enn spontan differensiering, uten bruk av tilsatte kjemikalier. Imidlertid er den viktigste begrensning av denne metode at det også vil være et stort antall av ikke-RPE-celler generert. Derfor må RPE velges omhyggelig ut og anriket som beskrevet i trinn 9 for å sikre en homogen populasjon.
Betydningen av denne fremgangsmåte er at et høyere utbytte av RPE kan avledes fra iPS celler enn spontane differensierings teknikker. Bruken av små molekyler for å utlede fra RPE IPS er også blitt rapportert til å gi et høyt utbytte avdifferensierte celler, er imidlertid at teknikken er mye mer kompleks og krever timing og konsentrasjoner av de små molekyler til å være optimalisert for å oppnå de ønskede resultater 7,10. I tillegg er de små molekyler som brukes i disse fremgangsmåter har pleiotropiske virkninger som kan forvirre resultatene.
Den beskrevne fremgangsmåte kan brukes til å lage EBS av ønskede størrelser med høy reproduserbarhet. Denne teknikken generert EBS ensartede størrelser som ble brukt til å optimalisere differensieringen av iPS celler mot RPE-avstamning, uten bruk av ytterligere kjemikalier. IPS-RPE celler avledet fra EBS kan så videre brukt i transplantasjons studier for å bekrefte deres integrering i netthinnen i en funksjonell organisasjon. Disse cellene kan også gi en god forskningsmodell for å studere patogenesen av forskjellige sykdommer RPE in vitro. Anvendeligheten av denne metode kan anvendes for rettet differensiering til mange andre celletyper, avhengigstørrelsen på EBS og in vivo opprinnelsen av cellen i blastocyst. Cellene i ektoderm vil gi opphav til nerveceller, epidermis, hår og brystkjerteltumorer celler; endoderm vil gi opphav til mage, colon, lunger og tarmceller; mesoderm vil gi opphav til skjelettmuskulatur, hjerte, nyre, og bindevevsceller 3,11,19. Når den riktige EB størrelse er bestemt, de differensierte cellene trenger bare å bli analysert ved immunocytokjemi eller FACS for korrekt ekspresjon av markørproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
- The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).
