Summary
El objetivo de este informe es describir los protocolos para derivar el epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando diferentes tamaños de cuerpos embrionarios.
Introduction
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son un tipo de células madre pluripotentes obtenidas por la reprogramación de células adultas con factores extrínsecos 1. En contraste, las células madre embrionarias (CES), otro tipo de células madre pluripotentes, se generan a partir de la masa celular interna del blastocisto 2-3. A pesar de sus diferentes orígenes, las células iPS y las CME son comparables en su ilimitada capacidad para replicarse in vitro y en su capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula 4-5. Estas características de las células iPS les hacen candidatos ideales para aplicaciones en medicina regenerativa personalizada. Los recientes esfuerzos de investigación se centran en el desarrollo de protocolos de diferenciación robustos para la producción de células adultas especializadas incluyendo epitelio pigmentario de la retina (EPR) 6-11.
Para posibles aplicaciones clínicas de las células iPS derivadas, una diferenciación dirigida para ese tipo específico de célula es esencial. Hay varios métodospublicado para la diferenciación dirigida de ambas CES e iPS células RPE en que varía mucho en su eficacia 6-7, 12-16. Todavía no sabemos muchos de los eventos moleculares que gobiernan el destino de las células / tejidos durante el desarrollo o diferenciación. En los últimos años, se han hecho esfuerzos para desarrollar el protocolo de diferenciación que puede imitar el desarrollo embriológico tanto como sea posible. Durante la fase de blastocisto, la población no comprometido de las células madre están juntos en un microambiente tres dimensiones. Así, varias estrategias se aplicaron para hacer las células ESC / iPS reunidos juntos y crecer en tres dimensiones. Estos agregados de células madre se denominan cuerpos embrionarios (EBS). Los estudios han demostrado que la EB diferenciación de células madre imitan etapa temprana del desarrollo del embrión y espontáneamente puede dar lugar a endodermo primitivo en su superficie exterior. Más tarde, como el desarrollo EB progresa, fenotipos de células diferenciadas de los tres linajes germinales aparecen 17-18. Therefore, protocolos de diferenciación basada EBS han atraído mucha atención para la diferenciación in vitro de células ESC / iPS y son un buen candidato para la generación EPR a partir de células madre pluripotentes 13.
EB se pueden hacer usando varios métodos a partir de células / iPS DESC. Inicialmente, los OC fueron hechas por el raspado de las colonias adheridas y mantenerlas en cultivo en suspensión no adherente. Sin embargo, este enfoque produce población heterogénea de EBS que provoca una baja reproducibilidad. Colgando de cultivo celular de caída y la formación de micro pozos EBS basada otras técnicas populares para la formación de EB que producen EBS homogéneos de tamaños definidos que son altamente reproducible. Además, la técnica de micropocillos puede producir gran número de agregados con menos esfuerzo.
La diferenciación de las células dentro de EBS es regulada por un múltiplex de señales morfogénicas del microambiente extracelular e intracelular. En contraste con la diferenciación en una lunformato olayer, EB proporcionar una plataforma para el complejo ensamblaje de las células y la señalización intercelular que ocurra 17. Curiosamente, se observó el número de células madre pluripotentes utilizados para hacer EBS individuales para influir en el destino de las células. Por ejemplo, en un estudio de la diferenciación hematopoyética de los CES humanos, se observó que las células 500 EB promovió la diferenciación hacia el linaje mieloide de las células mientras que 1.000 EB empujado hacia el linaje eritroide 20. En otro estudio, los OC pequeños favorecieron diferenciación endodermo mientras que EB mayores promovidos hacia la diferenciación neuro-ectodermo 11, 17.
Estos estudios anteriores sugieren fuertemente que el número de células ESC / iPS utilizados para hacer EBS individuales afectan EBS diferenciación basado en cualquier tipo de células. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay estudios actuales que han dilucidado el impacto del tamaño de EB en su propensión a diferenciarse hacia RPE. El objetivo de este estudio es caracterizar la influencia deTamaño de EB en las células (iPS) madre pluripotentes inducidas - epitelio pigmentario de la retina (iPS-RPE) diferenciación y para identificar el número de células óptimo para hacer los EBS para la diferenciación dirigida hacia linaje RPE.
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Protocol
1. Preparación de reactivos de cultivo y placas de cultivo
- Preparar medio de cultivo de células madre alimentador libre mediante la adición de 100 ml de suplemento de suero libre de 5x a 400 ml de medio basal de células madre. El medio es estable a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas y a -20 ° C durante 6 meses.
- Añadir 10 mM solución de Rho-asociado, espiral de la bobina que contiene la proteína quinasa (Rock) inhibidor (Y-27362) al cuerpo embrioide (EB) Medio de formación disponibles en el mercado.
- Preparar medio de diferenciación mediante la adición de 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, la sustitución de suero knockout 10% (KSR) y 10 mg / ml de gentamicina a medio Eagle modificado / mezcla de nutrientes de Dulbecco F-12 (DMEM / F12).
- Preparar medio IPS-RPE mediante la adición de suplemento 1x N1, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 250 mg / ml taurina, 13 ng sal sódica / ml triyodo-L-tironina, 20 ng / ml de hidrocortisona, 5 mg / ml de gentamicina, y 15% suero bovino fetal (FBS) <sup> 21 a medio esencial mínimo de Eagle (MEM). Ajustar el pH a 7,4.
- Preparar triyodo-L-tironina solución de sal de sodio de valores. Disolver 1 mg de sal de sodio triyodo-L-tironina en 1 N de hidróxido de sodio girando suavemente. Añadir 49 ml de MEM para hacer 50 ml de 20 g / ml de sal de sodio triyodo-L-tironina. Preparar alícuotas y congelar a -20 ° C hasta que se necesite. Utilice volumen apropiado para alcanzar la concentración deseada en medio de cultivo final.
- Preparar hidrocortisona solución madre. Solubilizar 1 mg de hidrocortisona en 1 ml de etanol al 100% por agitación suave. Añadir 19 ml de MEM para hacer 20 ml de 50 mg / ml de solución de hidrocortisona de valores. Alícuota y congelar a -20 ° C hasta que se necesite. Utilice volumen adecuado para conseguir la concentración deseada en el medio de cultivo final.
- Preparar una solución de trabajo de dispasa de 1 mg / ml en DMEM / F12.
- Preparación de las placas matriz recubierta
- Preparar matriz de proteína extraída de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucélulas de sarcoma de Se en DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Escudo cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de la solución de matriz. Se incuban las placas recubiertas a temperatura ambiente durante 1 hr.
- Después de la incubación de 1 hora, aspirar el exceso de DMEM / F12. Añadir 0,5 ml de medio de cultivo celular vástago alimentador libre para evitar el secado de los pozos. Las placas matriz recubierta están listos para su uso.
- Preparar placas de micropocillos, enjuagando cada pocillo con 2 ml de DMEM / F12. Eliminar DMEM / F12 y añadir 0,5 ml de medio de formación de EB suplementado con inhibidor de la roca a cada pocillo. Centrifugar la placa a 2.000 xg durante 5 min para eliminar las burbujas de aire.
- Preparar tampón de tinción FACS mediante la mezcla de 2% de FBS y 0,09% de azida de sodio en tampón fosfato salino (PBS). Ajuste el tampón a pH 7,4.
- Preparar la solución de neutralización de tripsina mediante la adición de 10% de FBS a DMEM / F12.
2. iPS Cultura
- Antes de la siembra de células iPS, cálido tallo medio de cultivo celular alimentador libre a 37 ° C, y tienen la matrix placas recubiertas listo.
- Descongelar rápidamente las células iPS IMR90-1 en un baño a 37 ° C. A continuación, retire la crio-vial del baño de agua y limpie el vial con etanol al 70%. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta 2 ml para minimizar la rotura de los agregados celulares.
- Añadir 5 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre caliente a las células gota a gota y mezclar suavemente. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender cuidadosamente los grupos de células en 2 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre y semillas de los grupos de células en los pocillos de la placa de matriz recubiertos. Colocar la placa en una incubadora a 37ºC con 5% de CO 2, 95% de humedad.
- Cambiar el medio de cultivo de células iPS diaria. Observe colonias indiferenciadas cinco a siete días después de la siembra. Compruebe si hay colonias indiferenciadas que están listos para el paso (colonias con un centro denso) bajo un microscopio de luz.
3. pases de células iPS
- Antes de comenzar a paso las células iPS, calentar la solución dispasa, DMEM / F12 y tallo medio de cultivo celular alimentador libre a 37 ° C en baño de agua.
- Antes de pases de células iPS, retire cualquier área de la diferenciación raspando la superficie y aspirar el medio. Enjuagar cuidadosamente las células iPS con 2 ml de DMEM / F12.
- Añadir 1 ml de 1 mg / ml de dispasa a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar el dispasa y enjuagar suavemente las colonias de células con 2 ml de DMEM / F12 dos veces. Después de enjuagar, añadir 2 ml de medio de cultivo de células madre alimentador libre a cada pocillo.
- Con una pipeta de 5 ml raspar suavemente las colonias de la placa para formar grupos de células. La transferencia de los grupos de células desprendidas a un tubo cónico de 15 ml. Añadir suficiente vástago de medio de cultivo celular libre de alimentador para sembrar el siguiente paso de las células.
4. Generación de EBS Usando microplacas
- Preparación de una suspensión de células individuales de células iPS
- Retire el medium de las células iPS y enjuagar las células iPS con 2 ml de DMEM / F12. Añadir 750 l de accutase a las células iPS en cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 para permitir que las células se desprenden de la placa (aproximadamente 5-10 min).
- Utilice una pipeta de disociar suavemente cualquier resto de las células y de separar las células que quedan en la superficie de la placa. Transferir las células a un tubo cónico de 50 ml. Enjuagar la placa con 5 ml de DMEM / F12 y combinar el enjuagado DMEM / F12 con las células en el tubo cónico. Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras para eliminar los posibles grupos de células residuales.
- Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar el accutase. Resuspender el sedimento celular en un medio de formación de EB de modo que la concentración de células es de aproximadamente 0,5-1,0 x 10 7 células / ml.
- Determinar el número de células viables contando las células con azul de tripano y un hemocitómetro.
- Adjusting densidad celular en micropocillos para formar EBS tamaño controlado
- Ajustar el número de células a cada pocillo de la microplaca para generar los tamaños EB deseados. Añadir las células a los pocillos de las placas preparadas en el paso 1.9, Distribuya uniformemente las células pipeteando suavemente las células en varias ocasiones.
Nota: El número de células requeridas por pocillo = el número deseado de células por EB x número de micropocillos por pocillo. - Ajuste el medio EB formación complementado con inhibidor de la roca en los pozos a un volumen final de 2,0 ml. Redistribuir las células pipeteando suavemente cada pocillo. Centrifugar las microplacas a 100 g durante 3 min. Colocar las placas en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 hr.
- Ajustar el número de células a cada pocillo de la microplaca para generar los tamaños EB deseados. Añadir las células a los pocillos de las placas preparadas en el paso 1.9, Distribuya uniformemente las células pipeteando suavemente las células en varias ocasiones.
- EB Cosecha de las placas de microtitulación
- Cosecha de EBs de micropocillos mediante pipeteo medio en el pozo arriba y abajo con una micropipeta 1 ml para eliminar la mayor parte de los EBS. Pasar la suspensión a través de una célula EB 40 micras invertidacolador en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml para eliminar las células individuales.
- Lave la microplaca 5 veces con 1 ml de DMEM / F12 para eliminar todos los EBS. Recoger lavados y pasar sobre el filtro celular invertida. Gire el lado derecho hacia filtro celular a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Recoge los EBS por lavado con medio EB formación. Contar EBS para determinar el rendimiento.
5. Revestimiento del EBS y Diferenciación Iniciación
- Placa las EBS en matriz de proteína recubierta placas de seis pocillos (como en el paso 1.8.1) a una densidad de <1.000 EB / pocillo en medio de la formación de EB más un inhibidor de la roca 10 mM. Incubar EBS a 37 ° C con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 hr.
- 24 horas después de la siembra EB, reemplazar con medio de diferenciación para iniciar la diferenciación. Cambiar la mitad del medio de diferenciación cada dos días hasta que se recogieron las células para su posterior análisis.
- Recoger muestras en días 6, 17, 29 y 60 para llevar a cabo RT-PCR, immunocytochemistry y FACS para validar la expresión de genes característicos del EPR y proteínas.
6. Extracción de ARN y PCR
- Extracto de ARN de las muestras de EB según las instrucciones proporcionadas en el kit disponible comercialmente. Determinar la concentración de ARN mediante el uso de un espectrofotómetro.
- Realizar la transcripción inversa en 100 ng de ARN total de acuerdo con RNA disponibles comercialmente a cDNA kit de transcripción inversa.
- Realizar PCR con 10 ng de cDNA usando los siguientes cebadores (Tabla 1) a una concentración de 10 mmol / 10 ng de cDNA. Ajuste la PCR como sigue: desnaturalizar el ADN a 95 ° C durante 5 min, amplificar con 35 ciclos a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min, seguido de un ciclo final a 72 ° C durante 10 min. Ejecute el producto de PCR en un gel de agarosa al 1%.
7. La inmunocitoquímica
- Lávese las EB con PBS dos veces a temperatura ambiente. Fijar los EBS a TA en el 4% paraformaldehyde durante 10 min. Enjuagar una vez con PBS a RT. Almacene las muestras en PBS a 4 ° C hasta su uso para la tinción.
- En el día de la tinción, el tratamiento de las células fijadas con fijación y permeabilización de reactivos. Incubar las muestras con solución de bloqueo (10% suero de cabra en solución de permeabilización) durante 1 hora a RT.
- Realizar inmunoquímica en 10% suero de cabra en solución de permeabilización utilizando los siguientes anticuerpos primarios en las diluciones indicadas: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1:30), y anti- ZO1 (1: 100). Incubar las muestras con anticuerpos O / N correspondiente a 4 ° C.
- Al día siguiente, eliminar el anticuerpo primario de las células y lavar las muestras tres veces con PBS. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado durante 1 hora a RT.
- Eliminar el anticuerpo secundario de las células y lavar las muestras tres veces en PBS. Monte la cubierta se desliza sobre portaobjetos de vidrio con DAPI que contiene medio de montaje y deje muestras para establecer O / N en una cámara oscura.Utilice un microscopio de fluorescencia para visualizar la tinción.
8. La tinción para el análisis de FACS
- Lavar los EBS cultivadas en PBS dos veces. Incubar EBS con 0,5 ml de tripsina al 0,25% durante 5-10 min para hacer una suspensión de células individuales. Neutralizar la tripsina con solución neutralizante de tripsina (1 ml / pocillo).
- Transferir la suspensión de células individuales a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 600 xg durante 10 min.
- Descartar el sobrenadante y añadir 10 ml de DMEM / F12 a las células en el tubo. Invierta suavemente para mezclar las células. Se centrifuga a 600 x g. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender las células en tampón de tinción FACS.
- Cuente el número total de células. Centrifugar a 600 xg durante 10 min. Después de la centrifugación el sobrenadante de descarte. Fijar las células inmediatamente por la adición de 0,5 ml de paraformaldehído al 4%. Mezclar bien por agitación suave. Se incuban las células a 4 ° C durante 20 min.
- Centrifugar a 600 xg durante 10 min y retirar elsobrenadante. Vortex suavemente para perturbar el sedimento celular. Permeabilizar las células mediante la adición de 1 ml de solución de permeabilización enfriada. Vortex suavemente para mezclar e incubar en hielo durante 30 min.
- Centrifugar a 600 xg durante 10 min y separar el sobrenadante. Añadir 3 ml de tampón de tinción FACS y resuspender. Repita este paso para una vez más. Resuspender las células en tampón de tinción FACS a una concentración final de 5 x 10 6 células / ml.
- Transferir 100 l de la suspensión de células (células de 0,5 x 10 6) a cada uno de los tubos de microcentrífuga y añadir el volumen recomendado de anticuerpo primario. Para Pax6, añadir 5 l de PE anti-Pax6 en 100 l de suspensión celular. Para MITF, añadir 5 l de anti-MITF en 100 l de suspensión celular.
- Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 60 min. Añadir 3 ml de tampón de tinción FACS. Mezclar y centrifugar a 600 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y repetir 8.16 por dos veces más.
- Para la tinción MITF, se incuban las células en Antibo secundariady, de cabra anti-ratón de Alexa Fluor 488 a una dilución de 1: 2000 durante 1 hora a 4 ° C. Para la tinción de Pax6, evitar este paso.
- Lavar las células con 5 ml de tampón de tinción FACS y se centrifuga a 600 xg durante 10 min. Repita el proceso para dos veces más.
- Resuspender las células en 500 l de tampón de tinción FACS y agitar suavemente para alterar el sedimento celular. Las muestras están listas para el análisis de citometría de flujo.
9. iPS-RPE Aislamiento y cultivo
- En el día 29, corte con cuidado alrededor de las colonias pigmentadas seleccionados de la placa de cultivo con una punta de pipeta de 200 l. Transferencia de las colonias flotantes a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las colonias a 600 xg durante 10 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las colonias de células en 10 ml de DMEM / F12 y centrifugar a 600 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante.
- Preparar una suspensión de células individuales mediante la incubación de las colonias con 2 ml de tripsina al 0,25% a 37 ° C durante 7-10 min. Vórtice suavemente la suspensión de células para disociar las colonias.
- Neutralizar la tripsina mediante la adición de 2 ml de medio iPS-RPE. Centrifugar a 600 xg durante 10 min y descartar el sobrenadante. Resuspender las células individuales en 2 ml de medio iPS-RPE. Transferir las células en una matriz de proteína placa de 6 pocillos recubiertos y el lugar en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 y 95% de humedad.
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Representative Results
En este experimento, las células iPS fueron cultivadas y diferenciarse en el linaje RPE de EBS. EBS de tamaños controlados se formaron utilizando placas de micropocillos. Como se ve en la figura 1 la formación de EB fue homogénea en las placas de micropocillos. Estos EB fueron recogidos y se sembraron en placas de 6 pocillos (Figura 2).
RPE puede ser identificado por su clásica hexagonal morfología, pigmentación, y la expresión de marcadores de RPE. Después de 12 semanas de cultivo, el 200 celdas EB había desarrollado astrocito y la morfología de los fibroblastos. No se observó pigmentación en estas células (Figura 3A). EBS más grandes desarrollaron una monocapa de la morfología clásica RPE y la pigmentación (Figura 3B y C) La inmunocitoquímica para detectar marcadores de RPE, MITF y ZO1 revelaron co-expresión de estas proteínas que habían sido derivadas a partir de 500-célula y célula-3000 EBS (Figura 4) .
Expressions de campo ojo y genes RPE se controlaron mediante PCR. Figura 5 muestra el perfil de expresión génica de neuroectodérmico, precursores de campo visual, y marcadores de RPE en diferentes tamaños de EBS. Es importante destacar que, el marcador RPE específica, RPE65 se detectó a partir de los días 17.
Para cuantificar el rendimiento de las células que se habían diferenciado en linaje RPE, se realizó un análisis FACS para detectar los marcadores neuroectodérmicos y precursores RPE, PAX6 y MITF respectivamente. La Figura 6A muestra PAX6 marcador neuroectodérmico en diferentes tamaños de EBS en diferentes puntos temporales. Aproximadamente el 50% de las células analizadas fueron positivas para Pax6 en el día 6 de la cultura en EBS 3000 en células. Además, el análisis FACS de marcador de RPE, MITF en tamaños variados EB reveló que 20% de las células expresó MITF por el día 60 de diferenciación.
Cultured RPE también se caracterizan por su capacidad para perder su pigmento y la morfología poligonal y obtener unafibroblastos fenotipo en los pases. Por lo tanto, para determinar si las iPS derivadas RPE poseen estas características, que mecánicamente aislado y se pasaron las células. La Figura 7A muestra las células recién pases han perdido pigmento y ganado morfología de fibroblastos. Además, estas células proliferaron y recuperaron la morfología poligonal clásica sobre confluencia (Figura 7B). Dentro de unas semanas, estas células recuperaron su pigmentación (Figura 7C).
| Gene | NICB referencia | Secuencia (5'-3 ') | Tamaño (pb) | |
| Pax6 | NM_001258465.1 | F | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | F | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | F | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | F | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH | NM_001256799.1 | F | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | ATCCCCACCCTGTTG CTGTA |
Tabla 1. secuencias de cebadores de PCR para los genes Pax6, RPE65, RX, MITF y GAPDH.
Figura 1. Formación de EBS con placas de micropocillos. Cada pocillo contiene (A) 100 células, (B) células 200, (C) células 500 y 3000 células (D). Las células se incubaron 24 horas a 37 ºC y 5% de CO 2 para la formación de EBS. (Aumento de 100X, barra de escala = 400 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. EBS cosechadas a partir de placas de micropocillos. (A) 200 células EB, (B) de células EB 500, (C) 3000 de células EB, y (D) 15.000 células EB. (Ampliación 200X, barra de escala = 200 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. iPS derivadas de RPE de diferentes tamaños de EBS. EBS se cultivaron durante 12 semanas. (A) de 200 celdas EB sólo había desarrollado astrocito y la morfología de fibroblastos sin pigmentación; mientras que el 80% - 90% de las células en las células EBS-500 (B y C) desarrolló una monocapa de células pigmentadas poligonales. (A & B: un aumento de 100X, barra de escala= 400 m; (C):. Ampliación 200X, barra de escala = 200 micras) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Co-expresión de MITF y ZO1. 500 y 3000 células EBS expresó MITF y ZO1 después de 17 días de diferenciación. (400 aumentos, barra de escala = 20 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura perfil de expresión génica de 5. diferentes tamaños de EBS en diferentes puntos de tiempo de la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. FACS análisis de tamaño variado EB para la diferenciación RPE. (A) FACS datos de PAX6 marcador neuroectodérmico en diferentes tamaños de EBS durante la diferenciación. (B) Análisis FACS de Mitf marcador RPE en variados tamaños EB en el día 60 de diferenciación. El nivel más alto de MITF alcanzó el 20% y fue constante entre el tamaño de EB 500, 3.000, y 15.000 células.
Figura 7. Continúa la cultura de aislado manualmente RPE. (A) RPE se subcultivó y adquirió morpholo fibroblastosgy después del paso. (B y C) Las células desarrollaron morfología poligonal y la pigmentación en el tiempo. (Aumento de 100X, barra de escala = 400 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para conseguir plenamente las promesas de las células madre pluripotentes para la terapia celular, es necesario regular su diferenciación de una manera consistente y reproducible. Este informe describe los protocolos para formar EBS tamaño controlado utilizando la tecnología de placas de pocillos, iniciar la diferenciación hacia RPE e identificar marcadores de proteínas y genes de RPE. Para sincronizar la diferenciación in vitro, tamaños homogéneos de EB fueron formados por un número conocido de células iPS centrifugados en microplacas de agregación forzada. La inmunocitoquímica y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) se utilizan para controlar las proteínas expresiones del EPR y los genes de explicar. Por último, la eficiencia de diferenciación en diferentes tamaños de EBS se analizó por análisis FACS. Estas técnicas pueden facilitar la diferenciación de las células iPS en RPE para futuras aplicaciones.
Hay varios puntos cruciales en este método que deben ejecutarse cuidadosamente al correoNsure el éxito de este protocolo y la obtención de datos precisos. El primer paso clave se produce durante el cultivo de células iPS. Las células iPS se deben mantener en un estado pluripotente para mantener su troncalidad. Las células deben tener el medio se cambian cada día a fin de mantener los niveles adecuados de bFGF y ser cuidadosamente inspeccionados diariamente para detectar signos de diferenciación. Células iPS no diferenciados crecen como colonias multicelulares compactos. Las células deben tener una alta relación entre núcleo y citoplasma y nucleolos prominentes. Las colonias iPS se caracterizan por una frontera distinta, con varias capas de células en el centro. Los signos de diferenciación incluyen la pérdida de las fronteras de colonias definidas, la morfología celular no uniforme, y la aparición de tipos de células obvias, tales como neuronas y fibroblastos. Las células individuales que se han diferenciado puede ser eliminado por dispasa y aclarado, sin embargo, las colonias con estas características deben ser retirados manualmente de la cultura 22. Preparación de una suspensión de células iPS for la formación de la EB es el siguiente paso crítico. Es importante para preparar una suspensión sin agregados de células con el fin de entregar con precisión el número deseado de células a la placa de micropocillos y preparar el tamaño deseado EB. Preparaciones de ARN para el análisis de PCR también son importantes. ARN de calidad inconsistente es una fuente significativa de la variabilidad en los datos de PCR. La extracción de RNA debe rendir mínimamente degradados ARN para obtener mejores resultados. La extracción de RNA exitoso producirá ARN total con mínima degradación y libre de RNasas contaminantes. Después de la determinación de la concentración de ARN mediante espectrofotometría a 260 nm, la pureza de la muestra debe ser determinado a 230 y 280 nm para detectar la contaminación con polisacáridos o proteínas. El 230: 260: 280 para el ARN relación debe ser de 1: 2: 1 para indicar ARN de alta calidad sin contaminación 23. Finalmente, es importante fijar adecuadamente las células para la tinción de FACS. Durante este paso de fijación, las células deben separarse para evitar la formación de grumos. Insufficresuspensión celular ient antes de permeabilización dará lugar a la formación de grumos de células y tinción inexacta.
Recomendamos que el protocolo tal como se describen, sin embargo algunas modificaciones se pueden hacer si es necesario. Durante la generación de EBS se describe en el paso 4, el número de células por EB puede variar entre 500 a 3000 para lograr un alto rendimiento de células diferenciadas en RPE. Si el número de células iPS es limitado, EBS de células 500 se producen RPE comparable al EBS 3000 en células. Un cuidado especial se debe tomar durante el proceso de extracción de ARN se describe en el Paso 6. Las muestras deben ser manejados por triplicado para asegurar que el ARN de alta calidad puede ser adquirida. Durante inmunocitoquímica como se describe en el Paso 7, las concentraciones de anticuerpos primaria y secundaria se pueden ajustar según sea necesario para mejorar la intensidad de la señal y reducir el fondo. Los controles positivos y negativos apropiados deben ser incluidos en el ensayo. Durante el paso 8, el análisis FACS, si los resultados esperados no son ACQpedirá otra después de la tinción, una pequeña muestra de las células teñidas se puede colocar en un portaobjetos y visto con un microscopio para visualizar la tinción. Los controles positivos y negativos apropiados deben ser incluidos en el ensayo. Si las células no se tiñeron como se esperaba, las concentraciones de anticuerpos se pueden aumentar o disminuir según sea necesario.
La técnica descrita en este informe se traducirá en un mayor rendimiento de RPE de diferenciación espontánea, sin el uso de productos químicos añadidos. Sin embargo, la principal limitación de este enfoque es que también habrá un gran número de células no RPE generados. Por lo tanto, el RPE deben ser cuidadosamente seleccionados y enriquecido como se describe en el paso 9 para asegurar una población homogénea.
La importancia de este enfoque es que un mayor rendimiento de RPE se puede derivar a partir de células iPS que las técnicas de diferenciación espontánea. El uso de moléculas pequeñas para derivar RPE de iPS también ha sido reportado para dar un alto rendimiento decélulas diferenciadas, sin embargo, que la técnica es mucho más complejo y requiere la sincronización y concentraciones de las pequeñas moléculas a ser optimizado para conseguir los resultados deseados 7,10. Además, las pequeñas moléculas utilizadas en esos métodos tienen efectos pleiotrópicos que pueden confundir los resultados.
El método descrito puede ser utilizado para hacer EBS de tamaños deseados con alta reproducibilidad. Esta técnica genera EBS de tamaños uniformes que se utilizaron para optimizar la diferenciación de las células iPS hacia el linaje RPE sin el uso de productos químicos adicionales. Las células iPS-RPE derivadas de EBS se pueden utilizar aún más en los estudios de trasplante para confirmar su integración en la retina en una organización funcional. Estas células también pueden proporcionar un buen modelo de investigación para estudiar la patogénesis de diversas enfermedades RPE in vitro. La utilidad de este enfoque se puede aplicar a la diferenciación dirigida en muchos otros tipos de células, dependiendoel tamaño de la EBS y el origen in vivo de la célula en el blastocisto. Las células del ectodermo dará lugar a neuronas, epidermis, el pelo y las células de la glándula mamaria; endodermo dará lugar a estómago, colon, pulmones, y las células intestinales; mesodermo dará lugar a músculo esquelético, corazón, riñón y células de tejido conectivo 3,11,19. Una vez que el tamaño correcto EB se ha determinado, las células diferenciadas sólo tienen que ser analizados por inmunocitoquímica o FACS para la correcta expresión de proteínas marcadoras.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
References
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