Summary
Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır.
Introduction
Uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri dış faktörlerin 1 yetişkin hücrelerinin yeniden programlanması türetilen pluripotent kök hücrenin bir türüdür. Bunun aksine, embriyonik kök hücrelerin (EKH), pluripotent kök hücrenin başka bir tip blastosist 2-3 iç hücre kitlesi elde edilmiştir. Farklı kökenlerden rağmen, iPS hücreleri ve EKH in vitro ve herhangi bir hücre tipine 4-5 içine ayırt etme kapasitesinde çoğaltmak için onların sınırsız kapasite karşılaştırılabilir. IPS hücrelerinin bu özellikleri onları kişiselleştirilmiş rejeneratif tıp uygulamaları için ideal bir aday olun. Son araştırma çabaları retina pigment epiteli (RPE), 6-11 dahil olmak üzere özel yetişkin hücreleri üretmek için sağlam farklılaşma protokolleri geliştirmeye odaklandık.
IPS türetilen hücrelerin potansiyel klinik uygulamaları için, belirli bir hücre tipi için yönlendirilmiş bir farklılaşma gereklidir. Çeşitli yöntemler vardıronların verimlilik 6-7, 12-16 büyük ölçüde değişir RPE içine hem EKH ve iPS hücrelerinin yönettiği farklılaşması için yayınladı. Biz hala geliştirme veya farklılaşması sırasında hücre / doku kaderi yöneten moleküler olayların pek bilmiyorum. Son yıllarda, çabalar mümkün olduğunca embriyonik gelişimini taklit edebilir farklılaşma protokol geliştirmek için girişimlerde bulunulmuştur. Blastosist aşamasında, kök hücrelerin kaydedilmemiş nüfusu üç boyutlu mikroçevresinin birlikte bulunmaktadır. Yani, çeşitli stratejiler araya ESC / iPS hücrelerini yapmak ve üç boyutlu onları büyümeye uygulanmıştır. Bu kök hücre agrega embriyoid organları (EBS) denir. Çalışmalar kök hücrelerin EB farklılaşma embriyo gelişiminin erken evre taklit ve kendiliğinden onun dış yüzeyinde ilkel endoderm neden olduğunu göstermiştir. EB gelişme ilerledikçe sonra, her üç germ soylarının farklılaştırılmış hücre fenotipleri 17-18 görünür. Therefore, EBS tabanlı farklılaşma protokolleri ESC / iPS hücrelerinin in vitro farklılaşması için dikkat çekti ve pluripotent kök hücrelerinden 13 den RPE nesil için iyi bir aday olduğunu var.
EBS ESC / iPS hücrelerinden çeşitli yöntemlerle yapılabilir. Başlangıçta, EBS yapışkan koloniler kazıma ve yapışmayan süspansiyon kültürü içinde muhafaza edilerek yapılmıştır. Ancak, bu yaklaşım, düşük tekrarlanabilirlik neden EBS heterojen nüfus verir. Asma damla hücre kültürü ve mikro temelli EBS formasyonu oldukça tekrarlanabilir tanımlanan boyutlarda homojen EBS verim EBS oluşumu için diğer popüler teknikler vardır. Ayrıca, mikro tekniği daha az çaba ile agreganın çok sayıda elde edebilirsiniz.
EBS içindeki hücrelerin farklılaşması dışı ve hücre içi mikroçevreden morfojenik ipuçları bir multiplex tarafından düzenlenir. Bir mon farklılaşma aksineolayer biçimi, EBS hücrelerin karmaşık montaj ve 17 oluşmasına arası sinyalizasyon için bir platform sağlar. İlginç bir şekilde, tek tek EBS yapmak için kullanılan pluripotent kök hücre sayısı hücrelerin kaderini etkileyen gözlenmiştir. 1000 hücre EB eritroid soy 20 doğru itilir ise, örneğin, insan EKH bir hematopoietik farklılaşma çalışmada 500 hücre EB myeloid doğru farklılaşmasını teşvik ettiği görülmüştür. Bir başka çalışmada, küçük EBS nöro-ektoderm farklılaşma 11, 17 doğru terfi büyük EBS ise endoderm farklılaşma tercih.
Bu geçmiş çalışmalar kuvvetle bireysel EBS yapmak için kullanılan ESC / iPS hücrelerinin sayısı herhangi bir hücre tiplerine farklılaşma esaslı EBS etkilediğini göstermektedir. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, RPE doğru ayırt etmek eğiliminde EBS büyüklüğü etkisini aydınlatılamamıştır var hiçbir geçerli çalışmalar vardır. Bu çalışmanın amacı etkisini karakterize etmekRetina pigment epiteli (RPE iPS-) farklılaşma ve RPE soy yönelik farklılaşması için EBS yapmak için en uygun hücre sayısını belirlemek için - uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri üzerine EB boyutu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kültür Reaktifler ve Kültür Plakaların hazırlanması 1.
- Kök hücre bazal ortamı, 400 ml 5x serumsuz ek 100 ml ilave etmek suretiyle besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı hazırlayın. Orta 2 haftaya kadar 4 ° C 'de 6 ay boyunca -20 ° C' de stabildir.
- Rho-bağlantılı sarmal bobin ihtiva eden bir protein kinaz (Rock) inhibitörü (Y-27362) için ticari olarak temin edilebilen embriyoit gövdesi (EB) oluşumu ortamı içinde 10 uM çözeltisi ekleyin.
- (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı / Besin Karışımı, F-12, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.1 mM esas olmayan amino asitleri, 2 mM L-glutamin,% 10 nakavt serum yerine (KSR) ve 10 ug / ml gentamisin ilave edilerek DMEM farklılaşma ortamı hazırlayın / F12).
- 1x N1 takviyesi, 0.1 mM esas olmayan amino asitleri, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml triiyodo-L-tironin sodyum tuzu, 20 ng / ml hidrokortizon, 5 ug / ml gentamisin ve% 15 eklenmesi ile iPS RPE orta hazırlayın fetal sığır serumu (FBS) <sup> Minimum Essential Orta Kartalı (MEM) 21. PH'ı 7.4'e ayarlayın.
- Triiyodo-L-tironin sodyum tuzu stok çözeltisi hazırlayın. Hafifçe dönen 1 N sodyum hidroksit içinde triiyodo-L-tironin sodyum tuzu, 1 mg eritin. MEM 49 mi triiyodo-L-tironin sodyum tuzu ve 50 ml 20 ug / ml yapmak için ekleyin. Alikotları hazırlayın ve gerektiği kadar -20 ° C'de donar. Son kültür ortamı içinde arzu edilen konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacim kullanın.
- Hidrokortizon stok çözeltisi hazırlayın. Hafif çalkalama ile% 100 etanol içinde 1 ml hidrokortizon, 1 mg çözünürleştirilir. MEM 19 mi, 20 ml hidrokortizon stok çözeltisi ug / ml 50 yapmak için ekleyin. -20 ° C'de kısım ve donma kadar gerekli. Son kültür ortamı içinde arzu edilen konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacim kullanın.
- DMEM / F12 içinde 1 mg / ml dispase bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Matris kaplı plakaların hazırlanması
- Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) çıkarılan protein matrisi mou hazırlayın0.08 mg / ml DMEM / F12 içinde se sarkoma hücreleri. Kat matris solüsyon içerisinde 1 ml, 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğa. 1 saat boyunca oda sıcaklığında kaplanmış inkübe edin.
- 1 saat inkübe edildikten sonra, fazla DMEM / F12 aspire. Kuyular kurumasını önlemek için besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı, 0.5 ml ilave edilir. matris kaplı plakalar kullanıma hazırdır.
- DMEM / F12 içinde 2 ml her bir durulanarak, mikro plakalar hazırlayın. DMEM / F12 çıkarın ve her bir Rock inhibitörü ile takviye edilmiş EB formasyonu sıvısının 0.5 ml ilave ediniz. 5 dk herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için 2.000 xg'de plaka santrifüjleyin.
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir sodyum azid% 2 FBS karıştırılarak FACS boyama tamponu hazırlayın ve% 0.09. PH 7.4 tampon ayarlayın.
- DMEM / F12,% 10 FBS eklenerek tripsin nötralize çözelti hazırlayın.
2. iPS Kültür
- IPS hücre tohumlama öncesinde, sıcak besleyici içermeyen kök hücre kültürü 37 ° C, orta, ve ma vartrix plakaları hazır kaplı.
- Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde IMR90-1 iPS hücrelerini eritin. Daha sonra su banyosundan cryo-flakon çıkarın ve% 70 etanol ile şişeyi silin. Hücre kümeleri kırılmasını en aza indirmek için 2 ml'lik bir pipet kullanarak 15 ml konik bir tüp hücre transfer edin.
- Damla damla hücrelere sıcak besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı 5 ml ekleyin ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj hücreler çıkartıldı ve süpernatan.
- Dikkatle besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamının 2 ml hücre kümeleri tekrar süspansiyon ve matris ile kaplanmış bir levhanın gözleri içine hücre kümeleri tohum. % 5 CO2,% 95 nem ile 37 ° C inkübatör içine plaka koyun.
- Günlük iPS hücre kültürü ortamı değiştirin. Tohumlama sonrası farklılaşmamış koloniler 5-7 gün gözlemleyin. Bir ışık mikroskobu altında geçit (yoğun merkezi koloniler) için hazır farklılaşmamış koloniler için kontrol edin.
IPS hücrelerinin 3. Pasajlanması
- Başlangıçta önce geçide iPS hücreleri, su banyosu içinde 37 ° C Dispase çözeltisi, DMEM / F12 ve besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı ısıtın.
- IPS hücrelerini pasaj önce, bölgeyi kazıma ve orta aspire farklılaşma herhangi alanları kaldırmak. Dikkatle 2 ml DMEM / F12 ile iPS hücrelerini durulayın.
- / Ml dispaz her bir kuyucuğa 1 mg 1 ml ilave edilir ve 7 dakika için 37 ° C'de inkübe edin. Dispaz aspire ve yavaşça DMEM / F12, iki kez 2 ml hücre kolonileri yıkayın. Durulamadan sonra, her bir kuyucuğa besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamının 2 ml ilave ediniz.
- 5 ml'lik bir pipet kullanarak hafifçe hücre kümeleri oluşturmak için plaka koloniler kazımak. 15 ml konik tüp müstakil hücre kümeleri aktarın. Hücrelerin sonraki geçişini tohum yeterli besleyici içermeyen kök hücre kültür ortamı ekleyin.
Microwell Plakaları kullanma EBS 4. Nesil
- IPS hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması
- Mediu'yu kaldıriPS hücrelerinden m DMEM / F12 içinde 2 ml iPS hücrelerini yıkayın. 6 gözlü bir plakanın her bir de iPS hücreleri Accutase 750 ul ekle. Hücreler plakasına (yaklaşık 5-10 dakika) ayrılmasını sağlamak için izin vermek için 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile inkübe hücreleri.
- Yavaşça kalan hücreleri ayırmak için bir pipet kullanın ve plaka yüzeyinde kalan hücreleri ayırmak için. 50 ml'lik bir konik tüp hücreleri aktarın. DMEM / F12, 5 ml plaka durulayın ve konik bir tüp içinde hücreler ile yıkandı, DMEM / F12 birleştirir. Olası kalıntı hücre kümeleri kaldırmak için bir 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirin.
- Accutase çıkarmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de hücreleri santrifüjleyin. Hücre yoğunluğu yaklaşık 0.5-1.0 x 10 7 hücre / ml olacak şekilde EB formasyonu ortamında hücre pelletini.
- Tripan mavi ve bir hemositometre ile hücre sayımı yolu ile yaşayan hücrelerin sayısını belirlemek.
- Adjustinmikro g hücre yoğunluğu boyutu kontrollü EBS oluşturmak üzere
- İstenen EB boyutları oluşturmak için bir mikro tablanın her bir çukuruna hücre sayısını ayarlar. Eşit hafifçe hücreler birkaç kez pipetleme hücreleri dağıtmak, adım 1.9 hazırlanan levhaların mikro hücreleri ekleyin.
NOT: kuyu başına mikro EB sayısı x başına hücre kuyu başına gereken hücrelerin sayısı = istenilen sayı. - 2.0 ml 'lik bir son hacme kuyu kaya inhibitörü ile takviye edilmiş EB formasyonu orta ayarlayın. Yavaşça her pipetleme iyi hücreleri yeniden dağıtın. 3 dakika boyunca 100 x g'de mikro plakaları santrifüjleyin. % 5 CO2 ve 24 saat için% 95 nem ile 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde plakaları yerleştirin.
- İstenen EB boyutları oluşturmak için bir mikro tablanın her bir çukuruna hücre sayısını ayarlar. Eşit hafifçe hücreler birkaç kez pipetleme hücreleri dağıtmak, adım 1.9 hazırlanan levhaların mikro hücreleri ekleyin.
- Mikro plakalardan Hasat EBS
- Iyi EBS çoğunun çıkması için 1 ml mikropipetöre ile yukarı ve aşağı orta pipetleme mikro Hasat EBS. Bir ters 40 mikron hücre yoluyla EB süspansiyon geçmek50 ml'lik konik bir tüp üzerine süzgeç tek hücreler ayıklandı.
- Tüm EBS kaldırmak için DMEM / F12 içinde 1 ml bir mikro oyuk plaka 5 kez yıkayın. Yıkar toplayın ve ters hücre süzgecinden geçmek. Yeni 50 ml konik tüp kadar hücre süzgecinden sağ tarafını çevirin. EB formasyonu ortam ile yıkanarak EBS toplayın. Verimi belirlemek için EBS sayın.
5. Kaplama EBS ve başlatılıyor Farklılaşma
- <1,000 EBS / yoğunluğunda iyi EB formasyonu ortamı artı 10 uM Kaya inhibitörü (adım 1.8.1 gibi), altı gözlü levha üzerinde kaplanmış protein matrisi üzerindeki EBS Plate. % 5 CO2 ve 24 saat için% 95 nem ile 37 ° C'de EBS inkübe edin.
- 24 saat EB sonra kaplama, farklılaşma başlatmak için farklılaşma ortamı ile değiştirin. Hücreler, daha fazla analiz için toplanır kadar her gün farklılaştırma ortamının yarısı değiştirin.
- RT-PCR yapmak için günde 6, 17, 29 ve 60 ° C'de örnekleri toplamak, immunocytochemistry ve FACS karakteristik RPE genlerin ve proteinlerin ifadesini doğrulamak için.
6. RNA ekstraksiyonu ve PCR
- Piyasada mevcut kit verilen talimatlara göre EB örneklerinden RNA ayıklayın. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonunu belirlemek.
- CDNA ters transkript kiti piyasada mevcut RNA göre toplam RNA 100 ng ters transkripsiyon gerçekleştirin.
- CDNA 10 umol / 10 ng bir konsantrasyonda cDNA 10 ng, aşağıdaki primerler kullanılarak (Tablo 1) ile PCR yapın. Aşağıdaki gibi PCR ayarlayın: 5 dakika boyunca 95 ° C 'de DNA'yı denatüre, 72 ° C'de bir son döngü, ardından 30 saniye, 1 dakika için 72 ° C için 15 saniye boyunca 95 ° C' de 35 döngü 60 ° C yükseltmek 10 dakika işleme sokuldu. Bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünü çalıştırın.
7. İmmünositokimya
- Oda sıcaklığında PBS ile iki kez EBS yıkayın. % 4 paraformald RT EBS saptamak10 dakika boyunca ehyde. Oda sıcaklığında bir kez PBS ile yıkayın. 4 ° C de PBS içinde mağazası örnekleri boyama için kullanılana kadar.
- Boyama gününde, tespit ve permeabilization reaktifler ile sabit hücreler tedavi. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (permeabilizasyon çözeltisi içinde% 10 keçi serumu) bloke etme çözeltisi ile inkübe edin.
- Belirtilen seyreltmelerde aşağıdaki birincil antikorlar kullanılarak permeabilizasyon çözeltisi içinde% 10 keçi serumu immunokimya yapın: Anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), ve anti- ZO1 (1: 100). 4 ° C 'de antikor O / N karşılık gelen örnekleri inkübe edin.
- Bir sonraki gün, hücreler birinci antikorları ayıklamak ve PBS ile numuneleri üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe edin.
- Hücrelerinden ikincil antikoru çıkarın ve PBS içinde numuneleri üç kez yıkayın. Kapak montaj ortamı içeren DAPI ile cam slaytlar fişleri monte ve örnekler karanlık odasında O / N ayarlamanıza olanak verir.Lekelenmeye görselleştirmek için bir floresan mikroskop kullanın.
FACS Analizi 8. Boyama
- PBS içinde iki kere kültür EBS yıkayın. Tek bir hücre süspansiyonu yapmak için 5-10 dakika boyunca% 0.25 tripsin, 0.5 ml EBS inkübe edin. Tripsin nötrleştirme çözeltisi ile tripsin (1 ml / çukur) nötralize.
- 10 dakika boyunca 600 x g'de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj ile tek bir hücre süspansiyonu aktarın.
- Süpernatantı atın ve tüp hücrelere DMEM / F12 10 ml ekleyin. Yavaşça hücreleri karıştırmak için ters. 600 x g'de santrifüj. Santrifüj işleminden sonra, süpernatan atılır ve FACS lekeleme tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Hücrelerin toplam sayısını sayın. 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüjleyin. Santrifüj atmak süpernatant sonra. Hemen% 4 paraformaldehid, 0.5 ml ekleyerek hücreleri saptamak. Nazik vorteks ile iyice karıştırın. 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe hücreleri.
- 10 dakika için 600 xg'de santrifüj ve kaldırmaksüpernatant. Vortex hafifçe hücre pelet bozacak. Soğutulmuş permeabilizasyon çözeltisi 1 ml ilave etmek suretiyle hücre geçirgenliği. Girdap, yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilmeye.
- 10 dakika için 600 xg'de Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. FACS tampon boyama ve tekrar süspansiyon 3 ml ekleyin. Bir kez daha bu adımı tekrarlayın. 5 x 10 6 hücre / ml'lik bir nihai konsantrasyonda, FACS lekeleme tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Her bir mikrofüj tüplerine hücre süspansiyonu (0.5 x 10 6 hücre), 100 ul aktarın ve birincil antikor tavsiye edilen hacim ekleyin. Pax6, hücre süspansiyonu 100 ul PE karşıtı Pax6 5 ul ilave edin. MITF, hücre süspansiyonu 100 ul anti-MITF 5 ul ilave edin.
- Karıştırın ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. FACS lekeleme tampon maddesi 3 ml ilave edilir. 10 dakika için 600 xg'de karıştırın ve santrifüj. Süpernatantı ve iki ek kez 8,16 tekrarlayın.
- MITF boyama için, ikincil Antibo hücreleri inkübedy, 1 bir seyreltme keçi anti-fare Alexa Fluor 488: 4 ° C 'de 1 saat süre ile 2000. Pax6 boyama için, bu adımı kaçının.
- 10 dakika boyunca 600 x g'de, FACS lekeleme tampon maddesi ve santrifüj 5 ml hücreleri yıkayın. Iki kez bu işlemi tekrarlayın.
- Hücre pelet bozmaya hafifçe FACS boyama tampon ve vorteks 500 ul hücrelerin tekrar. Numuneler akım sitometri analizi için hazırız.
9. IPS-RPE İzolasyon ve Kültür
- Günün 29 at, dikkatli bir 200 ul pipet kullanarak kültür plaka seçilen pigmentli koloniler etrafında kesti. 15 ml konik tüp yüzen koloniler aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj koloniler çıkartıldı ve süpernatan.
- 10 dakika boyunca 600 x g'de DMEM / F12 ve santrifüj 10 ml hücre kolonileri yeniden süspanse. Süpernatantı.
- 7-10 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin ve 2 ml koloniler inkübe edilerek, tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması. Yavaşça koloniler ayırmak için hücre süspansiyonu vorteks.
- IPS-RPE orta 2 ml ekleyerek tripsin nötralize eder. 10 dakika için 600 xg'de Santrifüj ve süpernatant atın. IPS-RPE orta 2 ml bir tekrar süspansiyon hücreleri. 37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem ile bir kuluçka makinesi içinde bir protein matrisi kaplanmış 6-yuvalı plaka ve yeri içine hücreleri aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneyde, iPS hücreleri kültüre ve EBS gelen RPE soy içine ayırt. Kontrol boyutlarda EBS mikro plakalar kullanılarak oluşturulmuştur. Şekil 1, EB oluşumu görüldüğü gibi, mikro plakalar içinde homojen olduğu görülmüştür. Bu EBS sonra, (Şekil 2), toplandı ve 6-delikli plakalar üzerine plakalandı.
RPE RPE işaretlerinin da klasik altıgen morfolojisi, pigmentasyon ve ifade ile tespit edilebilir. 12 haftalık kültür sonrası, 200 hücre EBS astrosit ve fibroblast morfolojisi geliştirmişti. Resim pigmentasyon bu hücrelerin (Şekil 3A) görülmüştür. Büyük EBS klasik RPE morfolojisi ve pigmentasyon bir tek tabaka geliştirilen (Şekil 3B ve C) İmmünositokimya RPE işaretlerini tespit etmek için, MITF ve ZO1 500 hücresi ve 3000 hücre EBS elde edilmiş, bu proteinin beraber ifade gözlenmedi (Şekil 4) .
EGöz alanında ve RPE genlerin Xpressions PCR ile takip edildi. 5 EBS farklı boyutlarda nöroektodermal, göz alanı ön ve RPE markerlerinin gen tanımlama profili göstermektedir. Önemlisi, özel RPE işaretleyici, RPE65 günde 17 başlayan tespit edildi.
RPE soy olarak farklılaşmış hücreler bir verim ölçmek için, FACS analizi nöroektodermal ve RPE ön işaretçileri, sırasıyla Pax6 ve MITF tespit etmek için gerçekleştirilir. Şekil 6A, farklı zaman noktalarında EBS farklı boyutlarda nöroektodermal işaretleyici Pax6 gösterir. Analiz hücrelerin yaklaşık% 50'si 3000 hücre EBS kültürün 6. günde Pax6 pozitifti. Ayrıca, çeşitli EB boyutlarına RPE işaretleyici, MITF FACS analizi hücrelerinin% 20 farklılaşma Günü 60 MITF ifade ettiğini ortaya koydu.
Kültür RPE ayrıca pigment ve çokgen bir morfolojiye kaybedecek ve elde etme kabiliyetleri ile karakterize edilirPasajlanması üzerine fibroblast fenotipi. Bu nedenle, iPS hücrelerini RPE biz mekanik izole, bu özelliklere sahip türetilmiştir ve pasajlanır olmadığını belirlemek için. Şekil 7A yeni pasajlanır hücreler pigment kaybetmiş ve fibroblast morfolojisi kazanmıştır gösterir. Buna ek olarak, bu hücrelerin çoğalması ve birleşmenin bağlı klasik çokgen morfoloji (Şekil 7B) çıktı. Birkaç hafta içinde, bu hücreler kendi pigmentasyon (Şekil 7C) kazanmış.
| Gen | NICB referans | Dizi (5'-3 '), | Boyut (bp) | |
| Pax6 | NM_001258465.1 | F | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | F | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | F | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | F | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH | NM_001256799.1 | F | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | TCCACCACCCTGTTG CTGTA |
Pax6, RPE65, RX, MITF ve GAPDH genler Tablo 1. PCR primer dizileri.
Mikro plakalı EBS Şekil 1. oluşumu. Her bir mikro (A), 100 hücreleri, (B), 200 hücreleri, (C), 500 hücreleri ve (D) 3,000 hücre içerir. Hücreler, EBS oluşumu için 37 ° C'de 24 saat karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edildi. (Büyütme 100X, ölçek çubuğu = 400 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mikro plakalarından hasat Şekil 2. EBS. (A), 200 hücre EB, (B), 500 hücre EB (C), 3000 hücre EB ve (D) 15,000 hücre EB. (Büyütme 200X, ölçek çubuğu = 200 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. iPS türetilmiş EBS. EBS farklı boyutlarda RPE 12 hafta kültürlendi. (A) 200-hücreli EBS sadece pigmentasyon olmadan astrocyte ve fibroblast morfolojisi geliştirmişti; 500 hücre EBS (B ve C) 'de hücrelerin% 90 çok köşeli pigmentli hücre bir tek tabaka geliştirilmiş -% 80 iken. (A & B: Büyütme 100X, ölçek çubuğu= 400 um; (C):. Büyütme 200X, ölçek çubuğu = 200 mikron) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
MITF ve ZO1. 500- 3000-hücrenin EBS Şekil 4. Eş-ifadesi farklılaşma 17 gün sonra MITF ve ZO1 dile getirdi. (Büyütme 400X, ölçek çubuğu = 20 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Farklılaşma, farklı zaman noktalarında EBS farklı boyutlarda Şekil 5. Gen sentezleme profili. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
RPE farklılaşması için çeşitli EB boyutu Şekil 6. FACS analizi. Farklılaşması esnasında EBS farklı boyutlarda nöroektodermal işaretleyici Pax6 (A) FACS verileri. (B), farklılaşma günde 60 çeşitli İT boyutlarına RPE işaretleyici MITF FACS analizi. MITF en üst düzeyde% 20 ulaştı ve EB 500 boyutu, 3,000 ve 15,000 hücreleri arasındaki sabit oldu.
Şekil 7.. El izole RPE kültürünü Devam (A) RPE sub-kültür ve fibroblast morfolojik edinilmişgeçişinden sonra gy. (B & C) Hücreler zamanla poligonal morfolojisi ve pigmentasyon gelişti. (Büyütme 100X, ölçek çubuğu = 400 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre tedavisi için pluripotent kök hücrelerin tam söz gerçekleştirilmesi için, tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kendi farklılaşma atılması için gereklidir. Bu rapor, mikro plaka teknolojisini kullanarak boyutu kontrollü EBS oluşturan RPE doğru farklılaşma başlatmak ve RPE protein ve gen göstergeleri tanımlamak için protokolleri açıklar. In vitro olarak farklılaşma senkronize etmek için, EBS homojen boyutları zorunlu agregasyonu mikro plakalara santrifüj iPS hücrelerinin bilinen numaraları ile oluşturulmuştur. İmmünositokimya ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile izah ifadeler RPE proteinler ve genler izlemek için kullanılır. Son olarak, EBS farklı boyutlarda farklılaşma verimliliği, FACS analizi ile analiz edilmiştir. Bu teknikler, gelecekteki uygulamalar için RPE içine iPS hücrelerinin farklılaşmasını kolaylaştırabilir.
Dikkatle e idam edilmelidir Bu yöntemde birkaç önemli nokta vardırDoğru veri bu protokol ve kazanma başarısını nsure. İlk önemli bir adım iPS hücre kültürü sırasında oluşur. iPS hücreleri, stemness muhafaza edilmesi için bir pluripotent bir halde muhafaza edilmelidir. Hücreler bFGF uygun düzeylerini korumak ve dikkatli farklılaşma belirtileri günlük muayene edilmelidir için günlük değişti orta olmalıdır. Farklılaşmamış iPS hücreleri kompakt çok hücreli koloniler olarak büyür. Hücreler sitoplazma oranı ve belirgin Nükleolu yüksek bir nükleer olmalıdır. iPS koloniler merkezinde çeşitli hücre tabakaları ile, ayrı bir çerçeve ile karakterize edilir. Farklılaşma işaretler tanımlanan koloni sınırlarının kaybı, homojen olmayan bir hücre morfolojisi ve bu nöronlar ve fibroblastlar gibi belirgin hücre tiplerinde görünümünü içerir. Dispase ve durulanması ile çıkarılabilir farklılaştığını tek hücreler, bununla birlikte, bu özelliklere sahip koloniler el kültür 22 uzaklaştırılmalıdır. Tek bir iPS hücresi süspansiyonu fo hazırlanmasır EBS oluşturan bir sonraki kritik adımdır. Bu doğru mikro plakasına hücrelerin istenilen sayıda sağlamak ve istenen boyut EB hazırlamak için hücre agregatları olmayan bir süspansiyon hazırlamak için önemlidir. PCR analizi RNA preparatları da önemlidir. Tutarsız RNA PCR kalitesi verilerinin değişkenlik önemli bir kaynağıdır. RNA ekstraksiyon minimal iyi sonuçlar için RNA bozulmuş boyun eğmek zorundadır. Başarılı RNA ekstraksiyon az bozulma ve herhangi bir kirletici RNases ücretsiz toplam RNA verecektir. 260 nm'de spektrofotometri ile RNA konsantrasyonu tespit edildikten sonra, numunenin saflığı polisakaritler ya da protein ile kirlenmesini tespit etmek için, 230 ve 280 nm 'de tespit edilir. 230: 260: kirlenme 23 ile yüksek kalitede RNA belirtmek için 1: 2: RNA için 280 oranı 1 olmalıdır. En son olarak, yeterli bir FACS boyaması için hücreleri düzeltmek için önemlidir. Bu sabitleme adımı sırasında, hücreler, kümeleşmesini önlemek için ayrılmalıdır. Insufficönce permeabilization takabilir hücre tabanda hücre topaklanma ve yanlış boyama yol açacaktır.
Biz gerekirse ancak bir kaç değişiklik yapılabilir, açıklandığı gibi protokol takip edilmesi önerilir. EBS üretimi Aşama 4'te tarif boyunca, EB başına hücre sayısı, RPE ayrışmıştır hücrelerin yüksek verim elde etmek için 3000 ile 500 arasında değişmektedir. IPS hücrelerinin sayısı sınırlı ise, 500 hücre EBS 3000 hücre EBS karşılaştırılabilir RPE üretecektir. İlave bakımı 6. numuneler, yüksek kaliteli bir RNA elde edilebilir olmasını sağlamak için üç kopya halinde çalıştırılmalıdır basamakta anlatılan RNA ekstraksiyon işlemi esnasında özen gösterilmesi gerekmektedir. Adım 7'de tarif edildiği gibi, bağışıklık kimyası sırasında birincil ve ikincil antikor konsantrasyonları sinyal yoğunluğunu artırmak ve arka planı azaltmak için gerekli olan ayarlanabilir. Uygun pozitif ve negatif kontroller de analize ilave edilmelidir. Adım 8 sırasında, FACS analizi, beklenen sonuçlar AKA değilseboyandıktan sonra edinilmiş, lekeli hücrelerin küçük bir örnek, bir slayt üzerine yerleştirilebilir ve lekelenmeye görselleştirmek için bir mikroskop ile inceledi. Uygun pozitif ve negatif kontroller de analize ilave edilmelidir. Beklendiği gibi hücreleri steyn edilmez ise, antikor konsantrasyonları arttırılabilir ya da gerektiği gibi gerilemiştir.
Bu raporda tarif edilen teknik kimyasal kullanılmadan, spontan farklılaşma daha RPE daha yüksek bir verimle sonuçlanır. Ancak, bu yaklaşımın ana sınırlama da üretilen olmayan RPE hücrelerinin çok sayıda olmasıdır. Bu nedenle, RPE dikkatle seçilmiş ve homojen bir popülasyonu sağlamak için Aşama 9'da tarif edildiği gibi zenginleştirilmiş olmalıdır.
Bu yaklaşımın önemi RPE daha yüksek bir verimle kendiliğinden farklılaşma tekniklerine göre iPS hücrelerinden elde edilebilir olmasıdır. iPS RPE türetmek için küçük moleküllerin kullanımı, aynı zamanda, yüksek verim elde bildirilmiştirfarklılaşmış hücreler, ancak, bu teknik, çok daha karmaşık ve zamanlama gerektirir ve küçük moleküllerin konsantrasyonları, arzu edilen sonuçları elde etmek için 7,10 optimize edilmesi. Buna ek olarak, bu yöntemlerde kullanılan küçük moleküller sonuçları etkilemesi pleiotropik etkileri vardır.
tarif edilen yöntem, yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği istenen boyutlarda EBS için kullanılabilir. Bu teknik, kimyasal katkı maddeleri kullanılmaksızın RPE hattına doğru iPS hücrelerinin farklılaşmasını optimize etmek için kullanılan düzgün boyutlarda EBS oluşturulur. EBS elde edilen iPS-RPE hücreleri daha sonra bir işlevsel kuruluşta retina içine entegrasyonu teyit etmek için nakli çalışmalarda kullanılabilir. Bu hücreler aynı zamanda in vitro çeşitli RPE hastalıkların patogenezi incelemek için iyi bir araştırma modeli sağlayabilir. Bu yaklaşımın faydası, diğer hücre tipleri yönlendirilir farklılaşma tatbik bağlı olabilirEBS boyutu ve blastosist hücrenin, in vivo kökeni. Ektoderm hücreleri nöronlar, epidermis, saç ve meme bezi hücrelerine yol açacaktır; endoderm mide, kolon, akciğer ve bağırsak hücrelerine yol açacaktır; mezoderm iskelet kası, kalp, böbrek ve bağ dokusu hücreleri 3,11,19 yol verecektir. Doğru EB büyüklüğü belirlendikten sonra, farklılaşmış hücreleri sadece mi markör proteinin doğru ifadesi için, bağışıklık kimyası ve FACS ile analiz edilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
- The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).
