Abstract
B lymfocyten immunoglobuline zware keten (IgH) klasse switch recombinatie (CSR) is een werkwijze waarbij aanvankelijk uitgedrukt IgM schakelaars andere IgH isotypen, zoals IgA, IgE en IgG. Meting van IgH CSR in vitro is een belangrijke werkwijze voor de studie van een aantal biologische processen gaande van DNA recombinatie en herstel aspecten van moleculaire en cellulaire immunologie. In vitro CSR bepaling omvat de flowcytometrische meetoppervlak Ig expressie op geactiveerde B-cellen. Hoewel meting van IgA en IgG subklassen is eenvoudig, meting van IgE deze werkwijze problematisch vanwege oplosbaar IgE binding aan FceRII / CD23 op het oppervlak van geactiveerde B-cellen. Hier beschrijven wij een unieke procedure voor nauwkeurige meting van IgE-producerende muizen B-cellen die CSR hebben ondergaan in kweek. De methode is gebaseerd op trypsine gemedieerde klieving van IgE-CD23 complexen aan celoppervlakken, waardoor detectie van IgE-producerende B afkomstcellen door cytoplasmic kleuring. Deze procedure biedt een handige oplossing voor flowcytometrische analyse van MVO aan IgE.
Introduction
Tijdens de zware keten van immunoglobuline (IgH-) klasse switch recombinatie (MVO) in muizen en mensen, de IgH- μ constant gebied exons (Cp) worden geschrapt en vervangen door een van de verschillende sets van downstream constant gebied exons (C H s) (bijv Cv, Ce en Ca), resulterend in een omschakeling van de productie van IgM tot de productie van andere Ig klassen (bijvoorbeeld IgG, IgE of IgA). MVO plaatsvindt binnen schakelaar (S) regio's, die 1-10 kb sequenties 5 'om elke set van C H s 1 zijn. De Activation-Induced cytidinedeaminase (AID) enzym initieert MVO via cytidine deaminering activiteit.
IgE is een belangrijke mediator van allergische aandoeningen 2 en een beter begrip van hoe IgE wordt geproduceerd en gereguleerd kan deuren openen naar nieuwe therapeutische benaderingen van atopische aandoeningen. Bij muizen en mensen, IgE is het meest strak gereguleerd Ig isotype. IgE wordt normaal gedetecteerd in gehalten duizenden times minder dan andere IgH isotypen 3, maar kan sterk worden verhoogd bij ziektetoestanden 4. Echter, CSR IgE is onvolledig begrepen. In vitro activatie van B-cellen met IL-4 in combinatie met ofwel anti-CD40 of LPS induceert CSR zowel IgG1 en IgE 5. Geactiveerde B-cellen brengen de lage affiniteit IgE-receptor FceRII / CD23 2,6, die bindt oplosbaar IgE uitgescheiden in de cultuur na MVO. Dus bij de analyse met flowcytometrie, B cellen met receptor gebonden IgE vlek dezelfde cellen endogeen tot expressie IgE 7b. Hoewel bekend is dat de muis B-cellen brengen lage affiniteit IgG FcγRIIB1 receptor (CD32) 8, in onze ervaring blijkt niet te interfereren met de meting van klasse omschakeling naar IgG1. Echter, bij het meten van IgE omschakelen bij B-celactivering in kweek, niet-specifieke oppervlakte-IgE kan de analyse belemmeren. Gemeenschappelijke kleuringen, niet-IgE tot expressie brengende cellen te kleuren positief voor IgE.
Hier geschetst is een strategie die is gebruikt voor CSR assays true-IgE tot expressie B-cellen voeren en sporen van muizen 9-11. Behandeling van geactiveerde B-cellen met trypsine, een gemeenschappelijk laboratorium reagens om eiwitten te verteren, verwijdert zowel cytophylic en membraangebonden oppervlak IgE. Na permeabilisatie en kleuring voor cytoplasmatische IgE onthult dus de ware IgE-producerende cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle experimenten hier beschreven waren in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen en door Animal Research Children's Hospital (BOOG), Boston, Mass goedgekeurd.
1. Bereiding van reagentia
- 1000x IL-4 Stock: Verdun IL-4 cytokine tot 20 ug / ml in H2O en 0,1% runderserumalbumine (BSA). Verdeel in 200 ul aliquots van 1,5 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -20 ° C.
- 1000x anti-CD40: verkrijgen van de fabrikant bij 1,0 mg / ml, bewaar bij 4 ° C.
- B-cel stimulatie media: Aan 425 ml van RPMI-1640 medium, voeg 75 ml vers ontdooide foetaal kalfsserum (FCS), 10 ml 1,0 M HEPES-buffer, 5 ml L-glutamine stock, 5 ml penicilline: streptomycine stock, 5 ml Minimum Essential Medium Niet-essentiële aminozuren (MEM-NEAA), en 3,5 pl 2-mercaptoethanol. Blijf media bij 4 ° C gedurende maximaal een week. Voeg IL-4 (20 ng / ml) en anti-CD40 (1,0 ug / ml) onmiddellijk voor gebruikalleen de hoeveelheid dragers die.
- 2% FCS-FACS buffer: Voeg 10 ml FCS tot 490 ml 1x PBS. Bewaren bij 4 ° C.
- 2x trypsine-EDTA-oplossing Verdun 5 ml van 10x trypsine-EDTA voorraadoplossing (5,0 g trypsine, 2,0 g EDTA per liter) in 20 ml 1X PBS. WINKEL trypsine-EDTA in 2x werken porties bij 4 ° C. Laat opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- Foetaal kalf serum: Bewaar ontdooide FCS bij 4 ° C voor maximaal twee weken. Plaats op ijs 15 min voordat de cytoplasmakleuring procedure.
- Neutraal gebufferde formaline: Bereid een 10% formaline-oplossing (3,7% paraformaldehyde). Formaline is giftig en dus omgaan onder een laboratorium zuurkast tijdens het dragen van de juiste PBM. WINKEL formaline bij kamertemperatuur in een chemisch opslagkast.
- Methanol: Store absolute methanol (100%) bij -20 ° C tot de cellen zijn klaar om te worden gepermeabiliseerde. Merk op dat methanol is brandbaar en moet worden bewaard in een geschikte vriezer.
2.Zuivering en activering van B-cellen
- Vanuit vers geoogste muis milt, bereiden een celsuspensie door het orgaan druk voorzichtig door een 70 um cel zeef met de plunjer van een injectiespuit 3 ml. In een 15 ml conische centrifugebuis verzamelen cellen in 10 ml 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Decanteer het supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml rode bloedcel lysisbuffer gedurende 5 min. Neutraliseer met 13.5 ml 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
- (Optioneel) magnetisch gescheiden van de B-cellen met anti-CD45R (B220) -gemerkt korrels, na het MACS zuiveringsprotocol volgens de instructies van de fabrikant.
- Stimuleer gezuiverde B-cellen bij 1,0 x 10 6 cellen / ml in B-cel stimulatie verwarmd medium dat IL-4 (20 ng / ml) en anti-CD40 (1,0 ug / ml) gedurende 5 dagen bij 37 ° C. Begin met 8 ml van de cultuur verdeeld in 2 putjes van een 6-well cultuur plaat (4 per ml).
- Controleer cultuopnieuw dagelijks bij 1,0 x 10 6 cellen / ml te handhaven. Stel de concentratie splitsen in andere putten en verdunnen van de kweek met B-cel stimulatie medium dat vers IL-4 en anti-CD40.
3. trypsinisatie, Fixatie en Permeabilisatie
- Trypsinisatie
- Verzamel tot 1,0 x 10 7 van gekweekte cellen in een 15 ml conische buis, centrifuge bij 300 xg gedurende 5 minuten en decanteer het supernatant.
- Was met 10 ml PBS om de resterende eiwit uit de cel collectie media te verwijderen. Herhaal het centrifugeren stap en decanteer de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de celpellet in het restvolume na decanteren (ongeveer 100 ui).
- Voeg voorzichtig 800 pi kamertemperatuur 0,1% (2x) trypsine-EDTA op de cellen. Verdeel deze vervolgens in een hoek van 45 ° langs de zijkant van de conische buis.
- Sluit de buis en meng voorzichtig door het kantelen van de buis zodat de vloeistof langs de lengte van de buis 6/5 tijds. Een vezelig, witte neerslag kan ontstaan in de oplossing. Beperk de trypsine tijd om onder een min.
- Blus de trypsine reactie met 1 ml koude FCS. Verdun de FCS onmiddellijk door 10 ml koude PBS.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, decanteer de bovenstaande vloeistof en breng de buizen ijs.
- Bevestiging
- Resuspendeer de cellen in het restvolume na decanteren. Eventueel meenemen volume tot 100 ul met koude PBS.
- In een zuurkast, voeg 800 ul van 10% neutraal gebufferde formaline oplossing voor de cellen en pipet op en neer. De buis verwarmen na toevoeging van formaline. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min.
- Permeabilisatie
- Het opzetten van een tafelmodel vortex-mixer op een zacht schudden snelheid.
- Trek 9 ml koude (-20 ° C) methanol in 10 ml serologische pipet.
- Houd de buis met de cellen over de vortexmenger en voorzichtig beginnen ShakinG de cellen.
- Voeg koude methanol aan de buis zodanig valt druppelsgewijs op de cellen terwijl de buis nog schudden zodat de methanol continu mengen. Na de eerste 2 ml methanol de afgifte snelheid kan worden verhoogd tot een langzame stroom.
- Laat de buis zitten op ijs gedurende 30 minuten aan de permeabilisatie voltooien. Als alternatief kunnen de cellen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maximaal een maand.
4. Fluorescentie kleuring voor IgG1 en IgE Class Switching
- Centrifuge monster bij 300 xg gedurende 5 minuten en giet de methanol oplossing. Een witte neerslag kan pellet met de cellen.
- Voeg 10 ml kamertemperatuur 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten om de cellen te wassen. Herhaal een keer. Opmerking: Het wassen van de pellet met kamertemperatuur PBS lost extra neerslag die na stap 4.1 kan vormen.
- Voer een aanvullend wassen met 10 ml van 2% FCS-FACS buffer.
- Verdeel monsters naar een 96 putjes ronde bodemplaaten centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Decanteer supernatant en zet de plaat op het ijs.
- Vlekken in 60 pl 2% FCS-FACS buffer per putje met de volgende verdunningen antilichaam: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100 Anti CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Na 5 min kleuring was de plaat met 150 ul van 2% FCS-FACS buffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Resuspendeer in 400 ul van 2% FCS-FACS buffer en pipet door een 40 pm nylon celzeef in een 5 ml FACS buis.
5. Gebruik de volgende Gating Strategie:
- Isoleer CD45R (B220) positieve cellen van de stralen lymfocyt populatie op de FSC / SSC grafiek (Figuur 1).
- Uit de B220 positieve cellen, gebruik maken van de IgE en IgG1 perceel aan de desbetreffende populaties te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze procedure is met succes toegepast om CSR studeren om IgE in muizen B-cellen. Om de efficiëntie te tonen meten CSR, we gestimuleerde muis milt B-cellen met anti-CD40 en IL-4, zoals eerder 11 beschreven. Na vijf dagen stimulering werden de cellen verzameld en verwerkt volgens de hierboven beschreven en gekleurd met fluorescent gelabelde IgM, IgG1, IgE, en B220 (CD45R) antilichamen protocol. Gated op de stralen lymfocyten (figuur 1), een duidelijke populatie van IgE + cellen niet netjes worden gediscrimineerd zonder trypsine behandeld (Figuur 2a). Echter, trypsine cellen vóór fixatie en permeabilisatie maakt scheiding van de IgE-producerende cellen (Figuur 2b) door het verwijderen van oppervlak gebonden IgE.
Figuur 1: Forward versus zijwaartse verstrooiing FACS plot van de muis milt B-cellen na 5 dagen van stimulatie in de cultuur met IL-4 en anti-CD40. Stralen lymfocyten maken 63% van de totale verworven evenementen.
Figuur 2:. Effect van trypsine op cytoplasmatische kleuring van IgE en IgG1 in geactiveerde B-cellen (A, B) FACS plots (boven) en histogrammen (onder) gated op stralen milt B-cellen van 129 / B6 gemengde achtergrond muizen na activatie in kweek gedurende 5 dagen met anti-CD40 en IL-4. Fixatie en methanol permeabilisatie alleen (a) en toevoeging van trypsine (B) getoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stimulatie van de muis milt B-cellen in cultuur met anti-CD40 en IL-4 zal simuleren T helper type 2 (T H 2) interacties, bemoedigende klasse omschakeling naar IgG1 en IgE 5. B-cellen kunnen worden geactiveerd voor CSR in met de totale splenocyten 12 of gezuiverde milt B-cellen 11. Zoals in het protocol (stap 2.3), B-cel verrijking is optioneel en is ter beoordeling van de onderzoeker als het zou gunstig bepalen. Positieve magnetische scheiding van B-cellen met CD45R (B220) -gemerkte korrels wordt hier gebruikt. Na scheiding wordt aanbevolen de cel zuiverheid controleren door FACS zodat de B-cel concentratie kan worden ingesteld op 1,0 x 10 6 cellen / ml voor de juiste cytokinen en antilichaam stimulatie. Ook moet worden opgemerkt dat IL-4 eiwit dat vries / dooi cycli ondergaan wellicht verminderde activiteit.
Trypsine cellen vóór fixatie en permeabilisatie maakt het Accurat meting van klasse schakelen via stroomcytometrie (Figuur 2). Juiste trypsinisatie van de cellen is van vitaal belang voor de succesvolle toepassing van deze procedure. Zoals FCS trypsine kan remmen, is een 1x PBS wasbeurt uitgevoerd voorafgaand aan de behandeling met trypsine stap. We vonden een 30 seconden incubatie bij kamertemperatuur voldoende voor volledige digestie. Langere looptijden is zeker van invloed levensvatbaarheid van de cellen.
Voorafgaand aan analyse, is het noodzakelijk om de cellen meerdere malen wassen met PBS om sporen methanol te verwijderen. Methanol overdracht kan antilichaam binding 13 te veranderen en kunnen eiwitten uit FCS gebruikt in downstream stromingscytometrische analyse 14 neerslaan. In dit verband kan andere permeabilisatie methoden (bijv saponine) alternatief voor het gebruik van methanol is. Methanol is een organisch oplosmiddel dat membraanlipiden oplost, terwijl detergentia verstoren membraanintegriteit 15. Een voordeel methanol permeabilisatie is het vermogen van langdurige opslagvan gefixeerde cellen bij -20 ° C 14.
Er zijn enkele beperkingen in gedachten te houden bij het gebruik van deze procedure. Omdat trypsine splitst eiwit residuen kunnen sommige FACS vlekken verschijnen verschillende na behandeling, of kan het vermogen te binden aan epitopen geheel richten verliezen. Bovendien kan een verlies in celaantal na trypsine behandeling optreden. Echter, lijkt dit niet de nauwkeurigheid van IgE CSR metingen beïnvloeden wij deze methode gevonden duidelijk vergelijkbare klasse omschakeling verzamelde gegevens meten antilichaam afscheiding van afzonderlijke hybridoma klonen 11 worden.
Andere methoden zijn gemeld IgE-producerende muizen B-cellen te detecteren. Eén werkwijze maakt gebruik van een zuur wasprocedure receptor gebonden IgE voor kleuring membraangebonden IgE op IgE tot expressie brengende cellen 16 te verwijderen - 18. Een andere werkwijze maakt gebruik van een monoklonaal anti-IgE-antilichaam alle oppervlakte IgE blokkeren voordat cel permeabilizatie en kleuring voor intracellulaire IgE van de IgE-exprimerende cellen 19. Bovendien is een recente studie geprofileerde acht kleuren FACS panel IgE-geschakelde B-celpopulaties in mensen te identificeren door uitsluiting + IgM, IgD + IgG + en IgA + B cellen 20. Vergeleken met deze andere werkwijzen de hier beschreven werkwijze vermijdt het gebruik van denaturerende zure wast, en overtollige antistoffen zijn niet nodig.
Een voordeel van deze procedure is dat het geen specifieke monoklonale antilichamen voorschrijft voor het meten van CSR aan IgE. Alternatieve anti-IgE-monoklonale antilichamen is aangetoond dat alleen endogene IgE-moleculen te detecteren. De hybridoma kloon R1E4 produceert een rat-anti-muis IgE monoklonaal antilichaam specifiek alleen voor endogene oppervlaktemoleculen, niet cytofiele IgE gebonden aan CD23 21,22, maar niet commercieel verkrijgbaar. De hierboven beschreven protocol is gemakkelijk en voordelig omdat het gebruik maakt gemeenschappelijke lab reagenNTS. De anti-IgE-antilichaam hier gebruikt waarschijnlijk bindt aan receptor gebonden IgE op een plaats die gevoelig zijn voor trypsine gemedieerde klieving, omdat de IgE-signaal vanwege cytofiele IgE verminderd na behandeling (figuur 2). Maar onderzoekers het uitvoeren van dit protocol hebben de vrijheid om te kiezen uit een reeks van in de handel verkrijgbare klonen voor experimenten. Bovendien kan het concept van het gebruik trypsine celoppervlak eiwitten te verwijderen worden uitgebreid tot de detectie van andere celmerkers door FACS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DRW wordt ondersteund door NIH subsidies AI089972 en AI113217, en door de Mucosal Immunologie Studies Team, en heeft een Career Award voor Medische Wetenschappers van de Burroughs Wellcome Fonds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
