Abstract
B-Lymphozyten-Immunglobulin schwere Kette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) ist ein Verfahren, bei dem zunächst ausgedrückt IgM schaltet auf andere IgH Isotypen, wie IgA, IgE und IgG. Messung der IgH CSR in vitro ist ein Schlüsselverfahren für die Untersuchung einer Reihe von biologischen Prozessen, die von DNA-Rekombination und Reparatur, um Aspekte der molekularen und zellulären Immunologie. In vitro CSR Assay das durchflusszytometrische Meßfläche Ig-Expression auf aktivierten B-Zellen. Während Messung des IgA- und IgG-Subklassen ist einfach, ist die Messung von IgE durch dieses Verfahren problematisch aufgrund löslichen IgE-Bindung an FcεRII / CD23, das auf der Oberfläche von aktivierten B-Zellen. Hier beschreiben wir ein einzigartiges Verfahren für die genaue Messung von IgE-produzierende Maus-B-Zellen, die CSR in Kultur erfahren haben. Das Verfahren basiert auf Trypsin-vermittelten Spaltung von IgE-CD23-Komplexen auf der Zelloberfläche gehalten und erlaubt die Detektion von IgE-produzierenden B-Linie Zellen durch cytoplasmic Färbung. Dieses Verfahren bietet eine komfortable Lösung für die durchflusszytometrische Analyse von CSR an IgE.
Introduction
Während der schweren Immunglobulinkette (IgH) Klassenwechsel-Rekombination (CSR) in Mäusen und Menschen, μ die IgH Exons der konstanten Region (C & mgr;) gelöscht und durch eine von mehreren Sätzen von nachgeschalteten Exons der konstanten Region (C H s) (z Cy ersetzt, C & egr; und C & alpha;), was zu einem Wechsel von der Herstellung von IgM auf die Herstellung von anderen Ig-Klassen (beispielsweise IgG, IgE oder IgA). CSR tritt innerhalb Schalter (S) Regionen, die 1-10 kb-Sequenzen, die 5 'an jeden Satz von C H s 1 sind. Die Aktivierungs-induzierte Cytidindeaminase (AID) Enzym initiiert CSR über Cytidin Desaminierung Aktivität.
IgE ist ein wichtiger Mediator der allergischen Erkrankung 2 und ein besseres Verständnis dafür, wie IgE produziert und reguliert kann Türen zu neuen Therapieansätzen zu atopischen Erkrankung zu öffnen. In Mäusen und Menschen, ist die IgE streng reguliert Ig Isotyp. IgE wird normalerweise in Mengen Tausende von tim erkanntes weniger als andere IgH Isotypen 3, kann jedoch stark bei Krankheitszuständen 4 erhöht werden. Jedoch CSR an IgE ist nicht vollständig verstanden. In vitro-Aktivierung von B-Zellen mit IL-4 in Kombination mit entweder Anti-CD40 oder LPS induziert CSR sowohl IgG1 und IgE 5. Aktivierte B-Zellen exprimieren den niedrigen affinen IgE-Rezeptors FcεRII / CD23 2,6, die die lösliche IgE in Kultur nach CSR abgesondert bindet. Deshalb bei der Analyse mit Durchflusszytometrie, B-Zellen mit rezeptorgebundenen IgE-Färbung ähnlich wie Zellen endogen exprimierenden IgE 7b. Obwohl bekannt ist, dass die Maus-B-Zellen das geringe Affinität IgG-Rezeptor FcγRIIB1 (CD32) 8, in unserer Erfahrung ist es offenbar nicht mit der Messung der Klassenwechsel zu IgG1 stören. Allerdings, wenn die Messung IgE Schalt nach B-Zell-Aktivierung in der Kultur, nicht spezifische oberflächengebundene IgE kann die Analyse verschleiern. Mit gemeinsamen Färbeverfahren, Fleck nicht IgE-exprimierenden Zellen positiv für IgE.
Hier skizziert ist eine Strategie, die verwendet worden ist, um CSR-Tests von Mäusen 9 durchführen und erkennen wahre IgE-exprimierenden Zellen, B - 11. Behandlung von aktivierten B-Zellen mit Trypsin, einem gemeinsamen Labor-Reagens, um Protein zu verdauen, entfernt sowohl cytophylic und Membran-gebundenen Oberfläche IgE. Nachfolgende Permeabilisierung und Färbung für zytoplasmatische IgE zeigt somit die wahren IgE-produzierenden Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Alle hier beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien und von Tierforschung Kinderkrankenhaus (ARCH), Boston, Mass zugelassen.
1. Vorbereitung der Reagenzien
- 1,000x IL-4 Stock: Verdünnen IL-4 Cytokins an 20 ug / ml in H 2 O oder 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Dispense in 200 ul Aliquots in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C.
- 1,000x anti-CD40: Beziehen des Herstellers bei 1,0 mg / ml, Lagerung bei 4 ° C.
- B-Zell-Stimulation Mittel: Auf 425 ml RPMI-1640-Medium, fügen Sie 75 ml frisch aufgetauten fötalem Kälberserum (FCS), 10 ml 1,0 M HEPES-Puffer, 5 ml L-Glutamin Lager, 5 ml Penicillin: Streptomycin Lager, 5 ml Minimum Essential Medium nicht essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) und 3,5 ul 2-Mercaptoethanol. Lagern Sie Druckmaterial bei 4 ° C für bis zu einer Woche. Hinzufügen IL-4 (20 ng / ml) und Anti-CD40 (1.0 ug / ml) unmittelbar vor der Anwendungnur auf das Volumen des benötigten Medien.
- 2% FCS-FACS-Puffer: 10 ml FCS bis 490 ml 1x PBS. Halten bei 4 ° C.
- 2x Trypsin-EDTA-Lösung: 5 ml der 10fach Trypsin-EDTA-Stammlösung (5,0 g Trypsin, 2,0 g EDTA pro Liter) in 20 ml 1 × PBS. Speicher Trypsin-EDTA in 2x Arbeits Aliquots bei 4 ° C. Ermöglichen, sich auf Raumtemperatur gebracht werden.
- Fötalem Kälberserum: Halten aufgetauten FCS bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. Zeigen auf Eis 15 min vor der zytoplasmatischen Färbungsverfahren.
- Neutral-Formalin: Eine 10% ige Formalin-Lösung (3,7% Paraformaldehyd). Formalin ist giftig und daher behandeln es unter einem Laborabzug beim Tragen geeigneter PSA. Shop Formalin bei Raumtemperatur in einer chemischen Speicherschrank.
- Methanol: Shop absolutem Methanol (100%) bei -20 ° C, bis die Zellen bereit sind, durchlässig gemacht werden. Beachten Sie, dass Methanol ist brennbar und sollte in einem angemessenen Gefrierschrank gelagert werden.
2.Reinigung und Aktivierung von B-Zellen
- Von einem frisch geerntet Mäusemilz, bereiten eine Einzelzellsuspension durch leichtes Eindrücken der Orgel durch eine 70 um Zellsieb mit dem Kolben eines 3-ml-Spritze. In ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen sammeln Zellen in 10 ml 1x PBS und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Dekantieren Sie den Überstand und Pellet in 1 ml Rotes Blutkörperchen Lysepuffer für 5 min. Neutralisieren mit 13,5 ml 1 × PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min.
- (Optional) magnetisches Trennen der B-Zellen mit anti-CD45R (B220) -markierten Kügelchen nach der MACS Reinigungsprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Stimulieren gereinigte B-Zellen mit 1,0 × 10 6 Zellen / ml in erwärmt B-Zell-Stimulation Medien, die IL-4 (20 ng / ml) und Anti-CD40 (1.0 ug / ml) für 5 Tage bei 37 ° C. Beginnen Sie mit 8 ml der Kultur in 2 Vertiefungen einer 6-Well-Kulturplatte (je 4 ml) aufgeteilt.
- Überprüfen cultuWieder täglich mit 1,0 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten. Die Konzentration ist anzupassen durch Aufteilen in andere Vertiefungen und mit B-Zell-Stimulationsmittel mit frischem IL-4 und anti-CD40 Verdünnen der Kultur.
3. Trypsinisierung, Fixierung und Permeabilisierung
- Trypsinierung
- Sammeln von bis zu 1,0 x 10 7 kultivierten Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen, Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten und dekantiert den Überstand.
- Waschen mit 10 ml PBS, um die Rest Proteins aus der Zelle Mappen Medien zu entfernen. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und dekantiert die überstehende.
- Zellpellet in dem Restvolumen nach dem Dekantieren (etwa 100 ul).
- 800 ul der Raumtemperatur 0,1% (2x) Trypsin-EDTA sorgfältig in den Zellen. Verzichtet werden langsam in einem Winkel von 45 ° an der Seite des konischen Rohrs.
- Die Tube und vorsichtig durch Kippen des Rohrs, so dass die Flüssigkeit entlang der Länge des Rohres 5-6 Zeit abläufts. Eine fadenziehende, weiße Niederschlag in der Lösung zu bilden. Begrenzen Sie die Zeit, um Trypsinisierung unter min.
- Quenche die Trypsinisierung Reaktion mit 1 ml kaltem FCS. Verdünne das FCS sofort durch Zugabe von 10 ml kaltem PBS gewaschen.
- Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C, dann dekantiert und die Röhrchen zurück zu Eis.
- Fixierung
- Resuspendieren der Zellen in dem Restvolumen nach dem Dekantieren. Falls erforderlich, bringen Volumen von bis zu 100 & mgr; l mit kaltem PBS.
- In einer Abzugshaube, fügen Sie 800 ul von 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung zu den Zellen und pipettieren auf und ab. Das Rohr wird durch die Zugabe von Formalin zu erwärmen. Bei 37 ° C für 10 min.
- Permeabilisierung
- Richten Sie eine Tisch Vortex-Mischer in einem leichtem Schütteln Geschwindigkeit.
- Zeichnen 9 ml kaltem (-20 ° C) Methanol in einen 10 ml serologische Pipette.
- Halten Sie das Röhrchen mit den Zellen über die Vortex-Mischer und sanft starten Shaking die Zellen.
- Kaltes Methanol zu dem Rohr so dass es auf den Zellen tropfenweise fällt, während das Rohr noch Schütteln, so dass das Methanol kontinuierlich gemischt. Nach den ersten 2 ml Methanol kann die Abgabegeschwindigkeit zu einem langsamen Strom erhöht werden.
- Lassen Sie den Schlauch sitzen auf Eis für 30 min, um die Permeabilisierung abzuschließen. Alternativ können die Zellen bei -20 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden.
4. Fluoreszenzfärbung für IgG1 und IgE Class Switching
- Centrifuge Probe bei 300 xg für 5 min und dekantiert die Methanollösung. Ein weißer Niederschlag kann mit den Zellen zu pelletieren.
- 10 ml Raumtemperatur 1x PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min, um Zellen zu waschen. Wiederholen Sie einmal. Hinweis: Das Waschen des Pellets mit Raumtemperatur PBS löst zusätzliche Niederschlag, der nach dem Schritt 4.1 bilden kann.
- Führen Sie eine weitere Waschung mit 10 ml 2% FCS-FACS-Puffer.
- Verteilen Proben in eine 96-Well-Rundbodenplatteund Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Dekantieren und stellte den Teller auf dem Eis.
- Stain in 60 ul 2% FCS-FACS-Puffer pro Vertiefung mit folgenden Antikörperverdünnungen: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200 Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE-FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220), PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Nach 5 min Färbung, waschen der Platte mit 150 ul 2% FCS-FACS-Puffer und Zentrifuge 5 min bei 300 x g.
- Resuspendieren in 400 ul 2% FCS-FACS-Puffer und Pipette durch ein 40 um Nylon Zellsieb in ein 5 ml FACS-Röhrchen.
5. Verwenden Sie die folgenden Gating-Strategie:
- Isolieren CD45R (B220) positive Zellen aus dem Spreng Lymphozyten-Population auf der FSC / SSC Plot (Abbildung 1) befindet.
- Von der B220-positiven Zellen, verwenden Sie die IgE und IgG1 Grundstück, um die entsprechenden Populationen zu offenbaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieses Verfahren wurde erfolgreich durchgeführt, um CSR an IgE in Maus-B-Zellen zu untersuchen. Um die Effizienz bei der Messung CSR demonstrieren angeregt wir Maus Milz-B-Zellen mit anti-CD40 und IL-4, wie zuvor beschrieben 11. Nach fünf Tagen der Stimulation wurden die Zellen gesammelt und mit dem vorstehend beschriebenen und mit fluoreszierend markierten IgM, IgG1, IgE und B220 (CD45R) Antikörpern gefärbt Protokoll verarbeitet. An Strahl Lymphozyten (1), eine klare Population von IgE + Zellen nicht sauber ohne Trypsinbehandlung (Abbildung 2a) unterschieden werden sucht. , Trypsinierung der Zellen vor der Fixierung und Permeabilisierung Jedoch ermöglicht die Trennung der IgE-produzierenden Zellen (Figur 2b), aufgrund der Entfernung von Oberflächen-gebundenen IgE.
Abbildung 1: Forward gegen Seitwärtsstreuung FACS Grundstück von Maus Milz-B-Zellen nach 5 Tagen der Stimulation in Kultur mit IL-4 und anti-CD40. Strahlen-Lymphozyten bilden 63% der gesamten erfassten Ereignisse.
Fig. 2: Wirkung von Trypsin auf zytoplasmatische Färbung von IgE und IgG1 in aktivierten B-Zellen (a, b) FACS-Flächen (oben) und Histogrammen (unten) nach Strahl Milz-B-Zellen von 129 / B6 gemischt Hintergrund Mäusen nach der Aktivierung in Kultur gated für 5 Tage mit anti-CD40 und IL-4. Fixierung und Permeabilisierung Methanol allein (a) und unter Zugabe von Trypsin (b) gezeigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stimulation von Maus-Milz-B-Zellen in Kultur mit Anti-CD40 und IL-4 wird T-Helfer Typ 2 (TH 2) Wechselwirkungen, ermutigend Klassenumschaltzeit IgG1 und IgE 5 simulieren. B-Zellen können für CSR im Rahmen der Gesamt Splenozyten 12 oder als gereinigte Milz-B-Zellen, 11 aktiviert werden. Wie in dem Protokoll (Schritt 2.3) angemerkt, ist B-Zell-Anreicherung optional, und liegt im Ermessen des Experimentators, ob es von Vorteil, zu ermitteln. Positive magnetische Trennung von B-Zellen mit CD45R (B220) -markierten Perlen wird hier genutzt. Nach der Trennung wird empfohlen, um die Zelle Reinheit durch FACS zu überprüfen, so dass die B-Zellkonzentration auf 1,0 x 10 6 Zellen / ml für eine ordnungsgemäße und Cytokin-Antikörper Stimulation angepasst werden. Es sollte auch beachtet werden, dass IL-4-Protein, die Gefrier / Tau-Zyklen unterzogen wurde, konnte Aktivität verringert hat.
Trypsinisierung der Zellen vor der Fixierung und Permeabilisierung erlaubt die Accuraß Messung der Klassenwechsel über Durchflusszytometrie (Abbildung 2). Proper Trypsinisierung der Zellen ist entscheidend für die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens. Als FCS Trypsin ist eine 1x PBS waschen vor der Trypsinisierung Schritt durchgeführt. Wir fanden eine 30 sec Inkubation bei Raumtemperatur für eine vollständige Verdauung. Längere Einwirkzeit können merklich beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen.
Vor der Analyse ist es notwendig, die Zellen mit PBS waschen mehrmals um Spuren Methanol zu entfernen. Methanol Verschleppung kann die Antikörperbindung 13 zu verändern und können Proteine von FCS in nachgelagerten Durchflusszytometrieanalyse 14 verwendet auszufällen. In dieser Hinsicht können andere Permeabilisierung Methoden (Saponin) eine Alternative zur Verwendung von Methanol ist. Methanol ist ein organisches Lösungsmittel, die Membranlipide löst, während Detergenzien stören die Integrität der Membran 15. Ein Vorteil Methanol Permeabilisierung ist die Fähigkeit des erweiterten Speicherder fixierten Zellen bei -20 ° C 14.
Es gibt einige Einschränkungen bei der Verwendung dieses Verfahren im Auge zu behalten. Da Trypsin spaltet Proteinrückstände können einige FACS Flecken erscheinen verschiedene nach der Behandlung, oder kann die Fähigkeit zur Bindung an Epitope ganz gezielt zu verlieren. Darüber hinaus kann ein Verlust der Zellenanzahl nach Trypsin Behandlung auftreten. Allerdings bedeutet dies nicht angezeigt, um die Genauigkeit der IgE CSR Messungen beeinflussen, wie wir diese Methode gefunden eindeutig vergleichbaren, von der Messung der Antikörpersekrete einzelner Hybridomklone 11 gesammelt Klassenwechsel-Daten sein.
Es wurden andere Verfahren berichtet, IgE-produzierende Maus-B-Zellen zu detektieren. Eine Methode verwendet eine Säurewaschverfahren zu entfernen rezeptorgebundenen IgE vor für membrangebundenen IgE auf IgE-exprimierenden Zellen 16 Färbung - 18. Ein weiteres Verfahren verwendet einen monoklonalen anti-IgE-Antikörper, um alle Oberflächen IgE vor Zell permeabiliz blockierenation und Färbung intrazellulärer IgE der IgE-exprimierenden Zellen 19. Darüber hinaus eine aktuelle Studie Profil eine Achtfarben-FACS-Panel an IgE vermittelte B-Zell-Populationen in den Menschen durch den Ausschluss von IgM + IgD + IgG + IgA + B-Zell-Untergruppen 20 zu identifizieren. Im Vergleich zu diesen anderen Verfahren, das hier beschriebene Verfahren vermeidet die Verwendung von denaturierenden sauren Wäschen und überschüssiger Antikörper nicht erforderlich sind.
Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es keine spezifischen monoklonalen Antikörper für die Messung des CSR an IgE. Alternative monoklonalen Anti-IgE-Antikörpern wurde gezeigt, daß nur endogene IgE-Moleküle zu detektieren. Der Hybridomklon R1E4 erzeugt ein Ratte-anti-Maus-IgE monoklonalen Antikörper, der spezifisch nur für endogene Oberflächenmoleküle, nicht cytophilen IgE an CD23 21,22 verbunden, ist jedoch nicht im Handel erhältlich. Das oben beschriebene Protokoll ist praktisch und wirtschaftlich, da es verwendet allgemeine Labor reagents. Die wahrscheinliche hier verwendeten anti-IgE-Antikörper bindet an den Rezeptor gebundenen IgE an einer Stelle empfindlich Trypsin-vermittelten Spaltung, weil die IgE-Signals aufgrund cytophilen IgE nach der Behandlung verringert wird (Figur 2). Doch Forscher der Durchführung dieses Protokolls haben die Freiheit, aus einer Reihe von im Handel erhältlichen Klonen für Experimente auszuwählen. Ferner kann das Konzept der Verwendung von Trypsin, um die Zelloberflächenproteine zu entfernen, um den Nachweis von anderen Zellmarker durch FACS Analyse verlängert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DRW wird durch NIH Zuschüsse AI089972 und AI113217 und durch die Mukosaimmunologie Studies-Team unterstützt, und hat einen Career Award für medizinische Wissenschaftler der Burroughs Wellcome Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
