Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

Published: December 1, 2014 doi: 10.3791/52264
* These authors contributed equally

Abstract

שרשרת כבדה (IGH) רקומבינציה אימונוגלובולין הלימפוציטים B מתג כיתה (CSR) היא תהליך שבו הביע תחילה IgM עובר לisotypes IGH האחר, כגון IgA, IgE וIgG. מדידה של IGH CSR במבחנה היא שיטת מפתח למחקר של מספר תהליכים הביולוגיים הנעים בין רקומבינציה DNA ותיקון להיבטים של אימונולוגיה מולקולרית ותאית. Assay במבחנה CSR כרוך ביטוי איג משטח מדידת הזרימה cytometric על תאי B מופעלים. בעוד מדידת subclasses IgA וIgG היא פשוטה, המדידה של IgE בשיטה זו היא בעייתית בשל IgE המסיס מחייב FcεRII / CD23 הביע על פני השטח של תאי B מופעלים. כאן אנו מתארים הליך ייחודי למדידה מדויקת של IgE-ייצור B עכבר תאים שעברו אחריות חברתית בתרבות. השיטה מבוססת על מחשוף בתיווך טריפסין של מתחמי IgE-CD23 על משטחי תא, ומאפשרת לגילוי של IgE-ייצור תאי B שושלת ידי CYצביעת toplasmic. הליך זה מציע פתרון נוח לניתוח הזרימה cytometric של CSR לIgE.

Introduction

במהלך שרשרת כבדה רקומבינציה אימונוגלובולינים (IGH) מתג כיתה (CSR) בעכברים ובבני אדם, IGH μ אקסונים קבועים אזור (Cμ) יימחקו ויוחלפו על ידי אחד מכמה סטים של אקסונים אזור קבועים במורד הזרם (ים H C) (למשל Cγ, Cε, וCα), וכתוצאה מכך מתג מייצור IgM לייצור של מעמדות אחרות איג (למשל IgG, IgE, או IgA). CSR מתרחש בתוך אזורי מתג (S), שהם 1-10 רצפי kb ממוקמים 5 'לכל קבוצה של C H של 1. אנזים ההפעלה-induced Cytidine deaminase (AID) יוזם אחריות חברתית באמצעות פעילות דיאמינציה cytidine.

IgE הוא מתווך עיקרי של מחלה אלרגית 2 והבנה טובה יותר של איך IgE מיוצר ומוסדר עשוי לפתוח דלתות לגישות טיפוליות חדשות למחלה אטופית. בעכברים ובבני אדם, IgE הוא אלוטיפ איג המוסדר ביותר בחוזקה. IgE בדרך כלל מתגלה באלפי רמות של times פחות מIGH האחר isotypes 3, אבל יכול להיות מורמים מאוד במצבי מחלה 4. עם זאת, אחריות חברתית לIgE הוא הבין באופן חלקי. הפעלה במבחנה של תאי B באמצעות IL-4 בשילוב עם שני אנטי CD40 או LPS, גורם לשני CSR IgG1 וIgE 5. תאי B מופעלים לבטא את קולט הנמוך זיקת IgE FcεRII / CD23 2,6, אשר נקשר IgE המסיס מופרש בתרבות לאחר CSR. לכן בעת ניתוח עם זרימת cytometry, תאי B עם כתם IgE-מחויב קולט בדומה לתאי B אופן אנדוגני להביע 7 IgE. אמנם ידוע כי B עכבר תאים לבטא את הזיקה הנמוכה IgG קולט FcγRIIB1 (CD32) 8, בניסיון שלנו זה לא מופיע להפריע למדידה של מיתוג בכיתה לIgG1. עם זאת, בעת מדידת מיתוג IgE לאחר הפעלת תא B בתרבות, IgE מחויב-פני השטח ספציפיים עלול לטשטש את הניתוח. עם שיטות צביעה משותפות, תאים שאינם IgE להביע להכתים חיובי עבור IgE.

מתואר כאן היא אסטרטגיה שנוצלה לביצוע מבחני אחריות חברתית ולזהות תאי B להביע IgE אמיתיים מעכברים 9-11. טיפול בתאי B מופעלים עם טריפסין, מגיב מעבדה משותפת לעיכול חלבון, מסיר משטח מחויב שני cytophylic וקרום IgE. permeabilization לאחר והצביעה לIgE cytoplasmic כך חושפים את התאים מייצרי IgE האמיתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הניסויים שתוארו כאן היו בהתאם להנחיות ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) ואושרה על ידי בית החולים לבעלי חיים למחקר לילדים (קשת), בוסטון, מסצ'וסטס.

1. הכנת ריאגנטים

  1. בורסת 1,000x IL-4: מדוללים ציטוקינים IL-4 עד 20 מיקרוגרם / מיליליטר בH 2 O או 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA). לוותר ב200 aliquots μl 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge וחנות ב -20 ° C.
  2. 1,000x אנטי CD40: השג מהיצרן ברמה של 1.0 מ"ג / מיליליטר, חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. תקשורת גירוי תא B: כדי 425 מיליליטר של מדיום RPMI-1640, להוסיף 75 מיליליטר של סרום עגל עוברי מופשר טרי (FCS), 10 מיליליטר של 1.0 חיץ M HEPES, מניית L-גלוטמין 5 מיליליטר, 5 מיליליטר פניצילין: מניית סטרפטומיצין, 5 חומצות אמינו μl מיליליטר מינימאלי חיוני בינוני שאינו חיוני (MEM-NEAA), ו -3.5 של 2-mercaptoethanol. שמור תקשורת ב 4 C עד שבוע. הוספת IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) מייד לפני השימושרק להיקף המדיה הדרושה.
  4. 2% FCS-FACS מאגר: הוסף 10 מיליליטר של FCS ל -490 מיליליטר של 1x PBS. לשמור על 4 מעלות צלזיוס.
  5. פתרון 2x טריפסין-EDTA: לדלל 5 מיליליטר של 10x פתרון טריפסין-EDTA מניות (טריפסין 5.0 גר ', EDTA 2.0 גר' לכל ליטר) ב 20 מיליליטר של 1x PBS. חנות טריפסין-EDTA ב2x עובד aliquots ב 4 מעלות צלזיוס. לאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש.
  6. עגל בסרום עוברי: שמור FCS המופשר ב 4 C עד שבועיים. מניחים על קרח 15 דקות לפני ההליך מכתים cytoplasmic.
  7. פורמלין שנאגרו ניטראלי: הכן פתרון 10% פורמלין (paraformaldehyde 3.7%). פורמלין הוא רעיל ולכן להתמודד עם זה מתחת למכסת מנוע קטר מעבדה כשהוא לבוש PPE המתאים. פורמלין לאחסן בטמפרטורת חדר בארון אחסון כימי.
  8. מתנול: מתנול החנות המוחלט (100%) ב -20 ° C עד שהתאים מוכנים להיות permeabilized. הערה מתנול שהוא דליק וצריך להיות מאוחסן במקפיא מתאים.

2.טיהור והפעלה של תאי B

  1. מטחול עכבר טרי שנקטפו, להכין השעיה תא בודדת על ידי הלחיצה בעדינות את האיבר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר עם הבוכנה של מזרק 3 מיליליטר. בצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר, לאסוף תאים ב 10 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. למזוג את גלולה supernatant וגלול ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים lysing הצפת למשך 5 דקות. לנטרל עם 13.5 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות.
  3. מגנטי נפרד (אופציונאלי) תאי B באמצעות אנטי CD45R (B220), שכותרת חרוזים, בעקבות פרוטוקול טיהור MACS לפי הוראות יצרן.
  4. לעורר תאי B מטוהרים ברמה של 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת גירוי תא B חימם המכילה IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 5 ימים על 37 מעלות צלזיוס. התחל עם 8 מיליליטר של התרבות מחולק ל 2 בארות של צלחת תרבות 6 היטב (4 מיליליטר כל אחד).
  5. בדוק cultuמחדש מדי יום כדי לשמור על 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר. התאם את הריכוז על ידי פיצול לתוך בארות אחרות ודילול התרבות עם תקשורת גירוי B תא המכילה IL-4 הטרי ואנטי-CD40.

3. trypsinization, קיבוע, וpermeabilization

  1. Trypsinization
    1. לאסוף עד 1.0 x 10 7 של תאים בתרבית בצינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, ולמזוג supernatant.
    2. לשטוף עם 10 מיליליטר של PBS להסיר את החלבון שיורית מתקשורת אוסף תא. חזור על שלב צנטריפוגה ולמזוג supernatant.
    3. Resuspend התא גלולה בהיקף הנותרת לאחר decanting (כ -100 μl).
    4. בזהירות להוסיף 800 μl של טמפרטורת חדר 0.1% (2x) טריפסין-EDTA לתאים. לוותר לאט בזווית של 45 מעלות כלפי מטה בצד של צינור חרוטי.
    5. סגור את הצינור ומערבבים בעדינות על ידי הטיית הצינור כך הנוזל פועל לאורכו של זמן צינור 5-6s. משקע סיבי, לבן עלול להיווצר בפתרון. הגבל את זמן trypsinization לתחת דקות.
    6. להרוות את תגובת trypsinization עם 1 מיליליטר של FCS הקר. לדלל את FCS מייד על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS הקר.
    7. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, אז למזוג supernatant ולהחזיר את הצינורות לקרח.
  2. קיבוע
    1. Resuspend התאים בהיקף הנותרת לאחר decanting. במידת צורך, להביא נפח עד עם PBS הקר 100 μl.
    2. במנדף, להוסיף 800 μl של 10% פתרון ניטראלי שנאגרו פורמלין לתאים וpipet למעלה ולמטה. הצינור יחמם על התוספת של פורמלין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. Permeabilization
    1. הגדר את מיקסר מערבולת benchtop במהירות רועדת עדינה.
    2. לצייר 9 מיליליטר של (-20 ° C) מתנול הקר לpipet סרולוגיות 10 מיליליטר.
    3. החזק את הצינור המכיל את התאים על פני מיקסר המערבולת בעדינות להתחיל שקיןg התאים.
    4. הוספת מתנול קר לצינור, כך שהוא נופל dropwise על גבי התאים תוך הצינור עדיין רעד כל כך שמתנול הוא הערבוב ברציפות. לאחר 2 מיליליטר הראשון של מתנול מהירות מחלק יכולה להיות מוגברת לזרם איטי.
    5. בואו הצינור לשבת על קרח למשך 30 דקות כדי להשלים את permeabilization. לחלופין, ניתן לאחסן את התאים ב -20 ° C עד חודש.

4. הקרינה מכתים לIgG1 ומיתוג IgE כיתה

  1. מדגם צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ולמזוג את פתרון מתנול. משקע לבן עשוי גלולה עם התאים.
  2. הוסף 10 מיליליטר של בטמפרטורת חדר 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים. חזור פעם אחת. הערה: כביסה גלולה עם טמפרטורת חדר PBS מתמוססת משקע נוסף שעלולות להיווצר לאחר שלב 4.1.
  3. לבצע שטיפה נוספת עם 10 מיליליטר של 2% חיץ FCS-FACS.
  4. להפיץ דוגמאות ל96-גם סיבוב צלחת תחתונהו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. למזוג supernatant ולשים את הצלחת על קרח.
  5. כתם ב -60 μl של 2% חיץ FCS-FACS לכל גם עם דילולים הנוגדן הבאים: Anti-IgM הרשתית / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
  6. לאחר 5 דקות של מכתים, לשטוף את הצלחת עם 150 μl של 2% חיץ FCS-FACS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
  7. Resuspend ב400 μl של 2% חיץ FCS-FACS וpipet דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS 5 מיליליטר.

5. השתמש באסטרטגית gating בעקבות:

  1. לבודד CD45R (B220) תאים חיוביים מאוכלוסיית הלימפוציטים פיצוץ ממוקמת על חלקת FSC / SSC (איור 1).
  2. מהתאים החיוביים B220, להשתמש בעלילת IgE וIgG1 לחשוף האוכלוסיות המתאימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הליך זה יושם בהצלחה ללמוד CSR לIgE בB עכבר תאים. כדי להדגים את היעילות במדידת CSR, אנחנו מגורה תאי B טחול עכבר עם אנטי CD40 וIL-4 כפי שתואר לעיל 11. לאחר חמישה ימים של גירוי, תאים נאספו ועובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל ומוכתם עם fluorescently שכותרתו IgM, IgG1, IgE, וB220 נוגדנים (CD45R). מגודר על לימפוציטים מסוג פיצוץ (איור 1), אוכלוסייה ברורה של IgE + תאים לא יכול להיות מופלה בצורה נקיה ללא טיפול טריפסין (איור 2 א). עם זאת, trypsinization של תאים לפני הקיבוע וpermeabilization מאפשר הפרדת תאי IgE-הייצור (איור 2b) עקב ההסרה של IgE-מחויב פני השטח.

איור 1
איור 1: forwלימפוציטים מסוג ארד לעומת פיזור צד עלילת FACS של תאי B טחול עכבר לאחר 5 ימים של גירוי בתרבות עם IL-4 ואנטי-CD40. פיצוץ מרכיבים 63% מכלל רכש את האירועים.

איור 2
איור 2:. אפקט של טריפסין על מכתים cytoplasmic של IgE וIgG1 בתאי B מופעלים (a, b) מגרשי FACS (לעיל) והיסטוגרמות (להלן) מגודרים על פיצוץ תאי B טחול מעכברי 129 רקע מעורבים / B6 לאחר הפעלה בתרבות במשך 5 ימים עם אנטי CD40 וIL-4. קיבעון וpermeabilization מתנול לבד (א) ועם תוספת של טריפסין (ב) מוצג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

גירוי של תאי B טחול עכבר בתרבות עם אנטי CD40 וIL-4 יהיה לדמות סוג T מסייע 2 (T H 2) אינטראקציות, מיתוג כיתה מעודד לIgG1 וIgE 5. תאי B יכולים להיות מופעלים על אחריות חברתית בהקשר של splenocytes הכולל של 12 או תאי B טחול מטוהרים 11. כפי שצוין בפרוטוקול (שלב 2.3), העשרת תאי B היא אופציונלית, ונתונה לשיקול דעתו של הנסיין כדי לקבוע אם הוא היית מועיל. הפרדה מגנטית חיובית של תאי B באמצעות CD45R (B220), שכותרת חרוזים מנוצלים כאן. לאחר הפרדה, מומלץ לבדוק את טוהר התא על ידי FACS, כך שריכוז תאי B יכול להיות מותאם ל1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר לציטוקינים נכונים וגירוי נוגדן. כמו כן יש לציין כי IL-4 חלבון שעבר מחזורי הפשרת הקפאה / אולי ירידה בפעילות.

Trypsinization של תאים לפני הקיבוע וpermeabilization מאפשר לaccurאכלתי מדידה של מיתוג בכיתה באמצעות cytometry זרימה (איור 2). trypsinization התקין של התאים חיוני ליישום המוצלח של הליך זה. כFCS יכול לעכב טריפסין, לשטוף PBS 1x מתבצע לפני שלב trypsinization. מצאנו דגירה 30 שניות בטמפרטורת חדר מספיקה לעיכול מלא. משכי זמן ניכר יכולים להשפיע על כדאיות תא.

לפני הניתוח, זה חיוני כדי לשטוף את התאים מספר פעמים עם PBS להסיר עקבות מתנול. שריד מתנול עשוי לשנות נוגדן מחייב 13 ויכול לזרז חלבונים מFCS המשמשים בניתוח cytometric זרימה במורד הזרם 14. בהקשר זה, בשיטות permeabilization אחרות (כלומר saponin) עשויות להיות חלופה לשימוש מתנול. מתנול הוא ממס אורגני שמתמוסס שומני קרום, ואילו חומרי ניקוי לשבש שלמות קרום 15. הטבה לpermeabilization מתנול היא היכולת של אחסון מורחבשל תאים קבועים ב -20 ° C 14.

ישנן מספר מגבלות שכדאי לזכור בעת שימוש בהליך זה. בגלל טריפסין שאריות חלבון דבק, כמה כתמי FACS עשויים להיראות שונים לאחר טיפול, או עלול לאבד את היכולת לרתק למקד epitopes לגמרי. בנוסף, הפסד במספר תאים לאחר טיפול טריפסין יכול להתרחש. עם זאת, זו אינה מופיעה כדי להשפיע על הדיוק של מדידות IgE CSR כפי שמצאנו בשיטה זו כדי להיות ברור דומה לנתונים שנאספו ממיתוג כיתת מדידת הפרשות הנוגדן של שיבוטים hybridoma פרט 11.

שיטות אחרות כבר דיווחו לאתר B עכבר תאי IgE-ייצור. שיטה אחת משתמשת בהליך לשטוף את חומצה כדי להסיר IgE-מחויב קולט לפני מכתים לIgE קרום הנכנס בIgE להביע תאים 16-18. שיטה אחרת משתמשת נוגדן אנטי IgE monoclonal לחסום את כל פני השטח IgE לפני permeabiliz התאation וצביעה לIgE תאיים של התאים IgE להביע 19. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה צדודית פנל FACS שמונה צבע לזיהוי אוכלוסיות תאי B עברו-IgE בבני אדם על ידי נטרול IgM +, IGD +, IgG + ותת תא IgA + B 20. בהשוואה לשיטות אחרות אלה, השיטה המתוארת כאן תמנע את השימוש של denaturing שוטף חומצה, ונוגדנים עודפים אינם נחוצים.

הטבה להליך זה היא שזה לא יקבע נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים למדידת CSR לIgE. נוגדנים חד שבטיים נגד IgE אלטרנטיביים הוכחו לזהות מולקולות IgE אנדוגני בלבד. שיבוט hybridoma R1E4 מייצר נוגדנים חד שבטי IgE-עכבר עכברוש אנטי ספציפיים רק למולקולות פני השטח אנדוגני, לא IgE cytophilic חייב CD23 21,22, אך אינו זמין באופן מסחרי. הפרוטוקול שתואר לעיל הוא נוח וחסכוני משום שהיא משתמשת ריאד מעבדה המשותףNTS. הנוגדן אנטי IgE משמש כאן סביר נקשר לIgE באתר רגיש למחשוף בתיווך טריפסין, כי אות IgE בשל IgE cytophilic מצטמצמת לאחר טיפול בכריכת קולט (איור 2). עם זאת יש לחוקרי ביצוע פרוטוקול זה חופש לבחור מתוך מגוון רחב של שיבוטים זמינים המסחרית לניסויים. יתר על כן, הרעיון של שימוש טריפסין להסיר חלבונים בתא שטח יכול להתארך עד לגילוי של סמני תא אחרים על ידי ניתוח FACS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

DRW נתמך על ידי מענקי NIH AI089972 וAI113217, ועל ידי הרירי אימונולוגיה מחקרי צוות, ופרס קריירה עבור מדענים רפואיים מWellcome בורוז הקרן מחזיק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Mouse IgE FITC BD Pharmingen 553415 clone R35-72
Rat Anti-Mouse IgG1 PE BD Pharmingen 550083 clone A85-1
Methanol BDH BDH1135-4LP Keep at -20 °C
Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon Corning 352340
Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon Corning 352350
Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-4052-82 clone RA3-6B2
anti-Mouse/Rat CD40 eBioscience 16-0402-85 clone HM40-3
RPMI Medium 1640 Gibco 11875-093
HEPES (1M) Gibco 15630-080
MEM-NEAA (100x) Gibco 11140-050
Phosphate Buffered Saline (10x) Lifetechnologies (Corning) 46-013-CM
MACS CD45R (B220) microbeads  Miltenyi Biotec 130-049-501
MACS purification column Miltenyi Biotec 130-042-401
IL-4 PeproTech 214-14 Reconstitute in water or 0.1% BSA
Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128-4L
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma Aldrich T4174-100 ml 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P0781-100 ml 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x)
L-Glutamine 200 mM Sigma Aldrich G7513
2-mercaptoethanol (99%) Sigma Aldrich M6250-100 ml
Red cell lysis buffer Sigma Aldrich R7757
Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 SouthernBiotech 1140-17 clone 1B4B1
HyClone Fetal Calf Serum Thermo SH30910.03
B cell Stimulation media B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine,  1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
  2. Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
  3. Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
  4. Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
  5. Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
  6. Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
  8. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
  9. Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
  10. Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
  11. Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
  12. Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
  13. Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
  14. Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
  15. Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
  16. Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
  17. Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
  18. Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
  19. Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
  20. Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
  21. He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
  22. Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).

Tags

אימונולוגיה גיליון 94 רקומבינציה מתג Class AID הפעלת תא B IgE IgG1 CD23 / FcεRII cytometry זרימה טריפסין מכתים cytosolic
איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gallagher, M. P., Shrestha, A.,More

Gallagher, M. P., Shrestha, A., Magee, J. M., Wesemann, D. R. Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells. J. Vis. Exp. (94), e52264, doi:10.3791/52264 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter