Abstract
B linfociti immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) è un processo in cui inizialmente espresso IgM passa ad altri isotipi IgH, come IgA, IgE e IgG. Misurazione di IgH CSR in vitro è un metodo fondamentale per lo studio di un certo numero di processi biologici che vanno dalla ricombinazione e riparazione del DNA agli aspetti della immunologia molecolare e cellulare. Test in vitro CSR coinvolge citofluorimetrica superficie di misurazione espressione Ig sulle cellule B attivate. Mentre la misurazione di IgA e IgG sottoclassi è semplice, misurazione delle IgE con questo metodo è problematico a causa IgE solubile legame FcεRII / CD23 espresso sulla superficie delle cellule B attivate. Qui si descrive una procedura unica per la misurazione accurata delle IgE-produzione di cellule del mouse B che hanno subito la RSI nella cultura. Il metodo si basa sulla tripsina-mediata scissione di complessi IgE-CD23 sulla superficie delle cellule, consente il rilevamento di IgE-cellule produttrici B lineage da cycolorazione toplasmic. Questa procedura offre una soluzione conveniente per l'analisi di citometria di flusso della RSI a IgE.
Introduction
Durante immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) in topi e nell'uomo, il IgH μ esoni regione costanti (Cu) vengono cancellati e sostituiti da uno dei diversi gruppi di downstream esoni regione costanti (C H s) (es Cγ, Cε e Cα), risultando in un interruttore dalla produzione di IgM alla produzione di altre classi di Ig (ad esempio IgG, IgE, o IgA). CSR avviene entro interruttore (S) le regioni, che sono 1-10 sequenze kb situati 5 'per ogni set di C H 1 s. L'attivazione indotta citidina deaminasi (AID) enzima avvia CSR attraverso l'attività citidina deamination.
IgE è un mediatore chiave della malattia allergica 2 e una maggiore comprensione di come IgE è prodotto e regolato può aprire le porte a nuovi approcci terapeutici per la malattia atopica. In topi e nell'uomo, IgE è isotipo Ig più strettamente regolata. IgE è normalmente rilevato livelli migliaia di times meno di altri IgH isotipi 3, ma possono essere molto elevati negli stati di malattia 4. Tuttavia, la RSI per IgE non è completamente comprensibile. In vitro attivazione delle cellule B con IL-4 in combinazione con anti-CD40 o LPS, induce la RSI sia IgG1 e IgE 5. Cellule B attivate esprimono il recettore a bassa affinità IgE FcεRII / CD23 2,6, che lega IgE solubile secreta nella cultura dopo CSR. Perciò quando si analizzano con citometria a flusso, le cellule B con il recettore legato IgE macchia simile a B cellule che esprimono endogenamente IgE 7. Mentre è noto che il mouse B cellule esprimono il recettore a bassa affinità IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, nella nostra esperienza non sembra interferire con la misura di commutazione classe IgG1. Tuttavia, quando si misura IgE commutazione dopo l'attivazione delle cellule B nella cultura, non specifica di superficie legato IgE può oscurare l'analisi. Con i metodi di colorazione comuni, le cellule non-IgE-esprimono macchia positivo per IgE.
Delineato qui è una strategia che è stata utilizzata per condurre test di CSR e rilevare vere cellule-IgE esprimono B da topi 9-11. Il trattamento delle cellule B attivate con tripsina, un reagente di laboratorio comune a digerire le proteine, rimuove sia cytophylic e la membrana superficiale legata IgE. Permeabilizzazione successiva e colorazione per citoplasmatica IgE rivela così le vere cellule-IgE che producono.
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Protocol
NOTA: Tutti gli esperimenti descritti erano in conformità con le Istituzionale Cura e uso Comitato Animal (IACUC) le linee guida e approvato dal Hospital Children Research animali (ARCH), Boston, Mass.
1. Preparazione dei reagenti
- 1,000x IL-4 Stock: Diluire citochina IL-4 a 20 pg / ml in H 2 O o 0,1% di siero albumina bovina (BSA). Distribuire in 200 aliquote microlitri provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C.
- 1,000x anti-CD40: ottenere dal produttore a 1,0 mg / ml, conservare a 4 ° C.
- B stimolazione cellulare multimediale: per 425 ml di terreno RPMI-1640, aggiungere 75 ml di siero di vitello fetale appena scongelati (FCS), 10 ml di 1,0 M tampone HEPES, 5 ml di L-glutammina magazzino, 5 ml penicillina: streptomicina magazzino, 5 ml essenziali media non essenziali Aminoacidi microlitri minimi (MEM-NEAA), e 3,5 di 2-mercaptoetanolo. Tenere i supporti a 4 ° C per un massimo di una settimana. Aggiungere IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 mcg / ml) immediatamente prima dell'usosolo il volume di supporti necessari.
- 2% FCS-FACS Buffer: Aggiungi 10 ml di FCS a 490 ml di 1x PBS. Conservare a 4 ° C.
- 2x soluzione tripsina-EDTA: Diluire 5 ml di soluzione di 10x tripsina-EDTA magazzino (5,0 g tripsina, EDTA 2,0 g per litro) in 20 ml di PBS 1x. Conservare tripsina-EDTA in 2x aliquote di lavoro a 4 ° C. Lasciar riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Siero fetale di vitello: Mantenere FCS scongelati a 4 ° C per un massimo di due settimane. Mettere in ghiaccio 15 minuti prima che la procedura di colorazione citoplasmatica.
- Neutral-buffered formalina: Preparare una soluzione di formalina al 10% (3,7% paraformaldeide). Formalina è tossica e quindi gestirlo sotto una cappa di laboratorio mentre indossa appropriate DPI. Conservare formalina a temperatura ambiente in un armadietto di immagazzinaggio chimico.
- Metanolo: Conservare metanolo assoluto (100%) a -20 ° C finché le cellule sono pronte per essere permeabilizzate. Si noti che il metanolo è infiammabile e deve essere conservato in un freezer adeguato.
2.Purificazione e attivazione delle cellule B
- Da una milza del mouse appena raccolte, preparare una sospensione di cellule singole premendo delicatamente l'organo attraverso un colino cella di 70 micron con lo stantuffo di una siringa da 3 ml. In una provetta da centrifuga da 15 ml conica, raccogliere le cellule in 10 ml di PBS 1x e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Decantare il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di globuli rossi Lysing Buffer per 5 min. Neutralizzare con 13,5 ml di 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 min.
- (Opzionale) magneticamente separare le cellule B e che utilizzano anti-CD45R (B220) -labeled perline, seguendo il protocollo di purificazione MACS secondo le istruzioni del produttore.
- Stimolare le cellule B purificate a 1,0 x 10 6 cellule / ml in scaldato mezzi stimolazione delle cellule B contenente IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 mcg / ml) per 5 giorni a 37 ° C. Iniziare con 8 ml di coltura divisi in 2 pozzetti di una piastra di coltura da 6 pozzetti (4 ml).
- Controllare culturi giornaliero di mantenere a 1,0 x 10 6 cellule / ml. Regolare la concentrazione suddividendo in altri pozzi e diluendo la cultura dei media con la stimolazione delle cellule B contenente IL-4 freschi e anti-CD40.
3. tripsinizzazione, Fissazione e permeabilizzazione
- Tripsinizzazione
- Raccogliere fino a 1.0 x 10 7 cellule coltivate in una provetta conica da 15 ml, centrifugare a 300 xg per 5 min, e decantare il surnatante.
- Lavare con 10 ml di PBS per rimuovere la proteina residua dal supporto di raccolta delle cellule. Ripetere la fase di centrifugazione e decantare il surnatante.
- Risospendere il pellet di cellule nel volume residuo dopo decantazione (circa 100 ml).
- Aggiungere con cautela 800 ml di temperatura ambiente 0,1% (2x) tripsina-EDTA alle cellule. Versare lentamente con un angolo di 45 ° lungo la parete del tubo conico.
- Chiudere la provetta e miscelare delicatamente inclinando il tubo in modo che il liquido corre lungo la lunghezza del tubo di tempo 5-6s. A filante, precipitato bianco potrebbe formarsi nella soluzione. Limitare il tempo tripsinizzazione di sotto di un min.
- Placare la reazione tripsinizzazione con 1 ml di FCS freddo. Diluire il FCS immediatamente aggiungendo 10 ml di PBS freddo.
- Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C, poi decantare il supernatante e restituire i tubi in ghiaccio.
- Fissazione
- Risospendere le cellule nel volume residuo dopo decantazione. Se necessario, portare il volume fino a 100 ml con PBS freddo.
- In una cappa aspirante, aggiungere 800 ml di soluzione di formalina tamponata neutra al 10% per le cellule e pipettare su e giù. Il tubo scalderà seguito all'aggiunta di formalina. Incubare a 37 ° C per 10 min.
- Permeabilization
- Impostare un mixer da banco vortex ad una velocità di agitazione delicata.
- Disegna 9 ml di freddo (-20 ° C), metanolo in un 10 ml pipetta sierologica.
- Tenere la provetta contenente le cellule sopra il vortex e iniziare dolcemente shaking cellule.
- Aggiungere metanolo freddo al tubo in modo cade a gocce sulle cellule mentre il tubo è ancora scuotendo modo che il metanolo è continuamente miscelazione. Dopo i primi 2 ml di metanolo la velocità di erogazione può essere aumentata a un flusso lento.
- Lasciate che il tubo di sedersi sul ghiaccio per 30 minuti per completare la permeabilizzazione. In alternativa, le cellule possono essere conservati a -20 ° C per un mese.
4. fluorescenza colorazione per IgG1 e IgE di conversione
- Campione Centrifugare a 300 xg per 5 minuti e decantare la soluzione di metanolo. Un precipitato bianco può sedimentare le cellule.
- Aggiungere 10 ml di temperatura ambiente 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 minuti per lavare le cellule. Ripetere una volta. Nota: Lavare il pellet con temperatura ambiente PBS dissolve precipitato in più che può formare dopo la fase 4.1.
- Eseguire un lavaggio supplementare con 10 ml di 2% FCS-tampone FACS.
- Distribuire campioni ad un 96-ben piatto rotondo fondoe centrifugare a 300 xg per 5 min. Decantare il surnatante e mettere il piatto su ghiaccio.
- Stain in 60 ml di 2% di buffer FCS-FACS per bene con le seguenti diluizioni degli anticorpi: anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Dopo 5 min di colorazione, lavare la piastra con 150 ml di 2% FCS-tampone FACS e centrifugare per 5 min a 300 x g.
- Risospendere in 400 ml di 2% di buffer FCS-FACS e pipetta attraverso una 40 micron colino cella nylon in 5 ml FACS tubo.
5. Utilizzare la seguente strategia Gating:
- Isolare CD45R (B220) cellule positive da parte della popolazione brillamento linfociti situato sul / plot SSC FSC (Figura 1).
- Dalle cellule positive B220, utilizzare la trama IgE e IgG1 di rivelare le popolazioni corrispondenti.
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Representative Results
Questa procedura è stata implementata con successo per studiare la RSI a IgE in cellule del mouse B. Per dimostrare l'efficienza di misura della RSI, abbiamo stimolato le cellule B della milza di topo con anti-CD40 e IL-4 come descritto in precedenza 11. Dopo cinque giorni di stimolazione, le cellule sono state raccolte ed elaborate utilizzando il protocollo sopra descritto e colorati con fluorescenza marcata IgM, IgG1, IgE, gli anticorpi e B220 (CD45R). Gated sui linfociti sabbiatura (figura 1), una chiara popolazione di cellule + IgE non possono essere discriminati modo pulito senza trattamento tripsina (Figura 2a). Tuttavia, tripsinizzazione delle cellule prima del fissaggio e permeabilizzazione consente la separazione delle cellule IgE-producono (Figura 2b) a causa della rimozione di IgE-vincolati superficie.
Figura 1: FORWARD vs side scatter plot FACS delle cellule del mouse milza B dopo 5 giorni di stimolazione in coltura con IL-4 e anti-CD40. Blasting linfociti costituiscono il 63% del totale acquisito eventi.
Figura 2:. Effetto della tripsina sulla colorazione citoplasmatica di IgE e IgG1 a cellule B attivate (a, b) trame FACS (sopra) e istogrammi (sotto) gated sul brillamento cellule B della milza da 129 / B6 topi sfondo misti dopo l'attivazione in cultura per 5 giorni con anti-CD40 e IL-4. Fixation e metanolo permeabilizzazione solo (a) e con l'aggiunta di tripsina (b) sono mostrati.
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Discussion
La stimolazione di topo milza cellule B in coltura con anti-CD40 e IL-4 simulerà T helper di tipo 2 (T H 2) le interazioni, il passaggio di classe incoraggiante IgG1 e IgE 5. Cellule B possono essere attivate per la RSI nel contesto di splenociti totale 12 o come purificati cellule B della milza 11. Come indicato nel protocollo (passo 2.3), B arricchimento delle cellule è opzionale, ed è a discrezione dello sperimentatore per determinare se sarebbe vantaggioso. Positivo separazione magnetica delle cellule B e che utilizzano CD45R (B220) -labeled perle è utilizzata qui. Dopo separazione, si raccomanda di verificare la purezza cella FACS in modo che la concentrazione delle cellule B può essere regolato a 1,0 x 10 6 cellule / ml per una corretta citochine e la stimolazione anticorpo. Inoltre va notato che l'IL-4 proteina che ha subito gelo / disgelo potrebbe essere diminuita attività.
Tripsinizzazione delle cellule prima della fissazione e permeabilizzazione consente la Accurmangiato misurazione del passaggio di classe tramite citometria di flusso (Figura 2). La corretta tripsinizzazione delle cellule è fondamentale per l'efficace applicazione di tale procedura. Come FCS può inibire tripsina, un lavaggio PBS 1x viene eseguita prima della fase di tripsinizzazione. Abbiamo trovato una incubazione di 30 secondi a temperatura ambiente è sufficiente per una completa digestione. Durate più lunghe possono influenzare notevolmente la vitalità cellulare.
Prima dell'analisi, è essenziale lavare le cellule più volte con PBS per rimuovere le tracce di metanolo. Metanolo riporto può alterare vincolante 13 anticorpo e può precipitare proteine da FCS utilizzati nel flusso a valle citometria analisi 14. A questo proposito, altri metodi di permeabilizzazione (cioè saponina) possono essere un'alternativa all'utilizzo metanolo. Il metanolo è un solvente organico che dissolve lipidi di membrana, mentre detergenti interrompono integrità della membrana 15. Un vantaggio per il metanolo permeabilizzazione è la capacità di stoccaggio prolungatodi cellule fissate a -20 ° C 14.
Ci sono alcune limitazioni da tenere a mente quando si usa questa procedura. Perché tripsina scinde residui proteici, alcune macchie FACS possono apparire diversi dopo il trattamento, o possono perdere la capacità di legarsi a indirizzare epitopi del tutto. Inoltre, si può verificare una perdita del numero di cellule dopo il trattamento tripsina. Tuttavia, questo non sembra influenzare l'accuratezza delle misurazioni IgE CSR abbiamo trovato questo metodo per essere chiaramente comparabili ai dati di commutazione classe raccolti dalla misurazione delle secrezioni anticorpi dei singoli cloni di ibridoma 11.
Altri metodi sono stati segnalati per rilevare IgE-producono cellule B del mouse. Un metodo utilizza una procedura di lavaggio acido per rimuovere IgE recettore legato prima di colorazione per di membrana IgE on IgE-cellule che esprimono 16 - 18. Un altro metodo utilizza un anticorpo monoclonale anti-IgE per bloccare tutta la superficie IgE prima permeabiliz cellulezione e colorazione per intracellulare IgE delle cellule IgE-esprimono 19. Inoltre, un recente studio profilato un pannello a otto colori FACS per identificare le popolazioni di cellule B IgE-switched nell'uomo escludendo IgM +, IgD +, IgG + e IgA + B sottopopolazioni cellulari 20. Rispetto a questi altri metodi, il metodo qui descritto evita l'uso di denaturazione lavaggi acidi, e anticorpi in eccesso non sono necessari.
Un vantaggio di questo procedimento è che non prescrive anticorpi monoclonali specifici per la misura della RSI IgE. Anticorpi monoclonali anti-IgE alternative hanno dimostrato di rilevare solo molecole endogene IgE. Il clone ibridoma R1E4 produce un topo anti-topo monoclonale IgE anticorpi specifici solo per molecole di superficie endogene, non cytophilic IgE legato a CD23 21,22, ma non è disponibile in commercio. Il protocollo di cui sopra è comodo ed economico perché utilizza comune reage labnti. L'anticorpo anti-IgE usato qui probabilmente si lega al recettore legato IgE in un sito sensibile alla tripsina clivaggio mediato, perché il segnale IgE causa cytophilic IgE è ridotto dopo il trattamento (Figura 2). Tuttavia i ricercatori che eseguono questo protocollo hanno la libertà di scegliere tra una gamma di cloni disponibili in commercio per gli esperimenti. Inoltre, il concetto di utilizzare tripsina per rimuovere le proteine di superficie cellulare può essere esteso al rilevamento di altri marcatori cellulari mediante analisi FACS.
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Acknowledgments
DRW è sostenuto da sovvenzioni NIH AI089972 e AI113217, e dalla mucosa Immunologia Studi della squadra, e in possesso di un Premio alla Carriera per medici scienziati del Wellcome Fondo Burroughs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
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