Summary
Mitochondriale Dysfunktion ist ein Markenzeichen von Zellalterung. Dieser Aufsatz benutzt nicht-invasive nahen Infrarot (NIR) Behandlung die Mitochondrienfunktion im alternden Maus vestibulären Sinnesepithel verbessern.
Abstract
Strategien zur Dämpfung Rückgang der Abgleichfunktion mit zunehmendem Alter sind überwiegend konzentrierte sich auf physikalische Therapien einschließlich Balance Aufgaben und Bewegung. Allerdings sind diese Ansätze sich nicht auf die zugrunde liegenden Ursachen von Balance Rückgang. Verwendung von Mäusen wurde die Auswirkung von Licht im nahen Infrarot (NIR) auf den Stoffwechsel der Zellen in der vestibulären Sinnesepithel beurteilt. Die gesammelten Daten zeigen, dass diese einfache und sichere Intervention dieser gefährdeten Zellen vor den schädlichen Wirkungen der natürlichen Alterung schützen. mRNA wurde aus der isolierten peripheren vestibulären Sinnesepithel (crista ampullaris und utricular Makula) extrahiert und anschließend in einer cDNA-Bibliothek transkribiert. Diese Bibliothek wurde dann für die Expression von ubiquitären Antioxidans (SOD-1) sondiert. Antioxidans-Genexpression wurde dann verwendet, um den Zellstoffwechsel zu quantifizieren. Mit Hilfe der transkraniellen Lieferung von NIR bei jungen (4 Wochen) und älteren (8-9 Monate) Mäuse und eine kurze Behandlungsregime (90 sec / Tag für 5 days), diese Arbeit legt nahe, NIR allein kann ausreichen, um die Funktion der Mitochondrien im vestibulären Sinnesepithel verbessern. Da gibt es gegenwärtig keine verfügbaren, preiswert, nicht-invasive Therapieverfahren zur vestibulären Haarzellfunktion verbessern, die Anwendung von externen NIR-Strahlung stellt eine mögliche Strategie, um die Auswirkungen der Alterung auf den Zellstoffwechsel inder vestibulären Sinnesepithel entgegenzuwirken.
Introduction
Degressiven Leistung und anschließende Wasserfälle sind häufig, und leider oft kennzeichnenden Merkmale des natürlichen Alterungs 1. Die Auswirkungen dieser Rückgang ist sowohl physisch als auch sozial sein, und für ältere Menschen deutlich reduziert die Lebensqualität. Als Reaktion darauf haben physikalische Therapie und Rehabilitation im Mittelpunkt der Forschung im Bereich Wasserfälle gewesen, aber noch nicht mit der konsequenten Reduzierung der Prävalenz von wiederholten Stürzen in Verbindung gebracht. Zur gleichen Zeit, Arbeit untersucht Veränderungen im peripheren oder zentralen vestibulären Systems (die für das Gleichgewicht zu halten verantwortlich System) ist knapp, und mögliche therapeutische Strategien zugunsten solcher Systeme und die zugrunde liegenden Ursachen des Ungleichgewichts begrenzt.
Jüngste Arbeiten auf altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen einschließlich altersbedingter Makuladegeneration 2-4, Alzheimer-Krankheitsmodellen 5-8 und Parkinson 9-12 neuroprotektive Wirkungen si gezeigtenmple nicht-invasive Anwendung von Nahinfrarot (NIR). Ferner wird in dem Gleichgewichtsorgan, NIR verwendet wurde, um die Aktivität der vestibulären primären afferenten Neuronen in vitro 13 zu erhöhen. Während der Mechanismus der NIR-Licht ist nicht gut verstanden, haben die meisten Studien mit NIR vorgeschlagen, dass NIR stimuliert Mitochondrien Komplex IV (Cytochrom-c-Oxidase) 14-17 auf den Zellstoffwechsel zu erleichtern. In der vestibulären Sinnesepithel der subkutanen Platte vom Typ I Haarzellen dicht in Mitochondrien 18 und können als solche einen Wirkort für therapeutische NIR-Behandlung darstellen.
Hier eine kurze, nicht-invasive Behandlung Regime transkraniell angewendet NIR, die verwendet werden können, um den Zellstoffwechsel zu messen (und implizit auch die Funktion der Mitochondrien) in der Maus vestibulären Sinnesepithel beschrieben. Ebenfalls diskutiert ist eine Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel und es wird gezeigt, dass NIR erhöht die Expression eines ubiquitous Antioxidans (Superoxiddismutase 1) im Riechepithel - früher gezeigt wichtig für Cochlea Haarzellüberleben 19 zu sein.
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Protocol
Ethik Hinweise: Alle nachstehend beschriebenen Verfahren wurden von der University of Sydney Tierethikkommission genehmigt.
1. Tiere
HINWEIS: 1 und 8-9 Monate alten Mäusen (C57BL / 6) aus dem Tier Resources Centre (Perth, Australien) erhalten. Die Mäuse wurden in der Bosch-Nager-Einrichtung an der Universität von Sydney untergebracht.
- Hausmäuse in Standardmäusekäfige auf einer 12/12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Futter und Wasser ad libitum.
- Teilen Sie Mäusen in jeder Altersgruppe in der Nähe von Infrarot (NIR) behandelt oder scheinbehandelten (Kontroll-) Gruppen zum Vergleich.
2. nahes Infrarot (NIR) Bestrahlung und Sham-Behandlung
- Rasur der Haare am Kopf und Halsbereich der Maus mit einem elektrischen Rasierer so eng wie möglich, um schnelle Nachwachsen der Haare vor der Beendigung der Behandlungsregime zu verhindern. Um die pathogenfreien Zustand der Mäuse zu erhalten, verwenden Sie 70% EthanolInstrumente zwischen Rasieren Tiere und F10 Veterinärdesinfektionsmittel zwischen Tieren aus getrennten Käfigen reinigen. Tun Sie dies 2-3 Tage vor Beginn der Behandlung, damit Tiere nicht über abgewickelt.
- Restrain Maus, indem das proximale Ende des Schwanzes und lassen Sie ihn in der Handfläche einer Hand oder Tisch entspannen, so dass Stress die zu falschen Ergebnissen führen könnte minimieren.
- Halten Sie die NIR (670 nm) LED (Leuchtdiode) Gerät 1-2 cm von der exponierten (rasiert) Bereich und schalten Sie das Gerät für 90 Sekunden (Abbildung 1A).
HINWEIS: Die Temperaturänderung als Ergebnis von 90 Sek Belichtung wurde mit <0,2 ° C in 100 ml Wasser gemessen. - Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 für die Scheinbehandlung Gruppe von Tieren, aber lassen Sie das Gerät ausgeschaltet (Abbildung 1B).
- Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 für den NIR-blockiert Behandlung Gruppe von Tieren, sondern decken Sie das Gerät mit Aluminiumfolie.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,5 täglich um approximatE 24-Stunden-Intervallen an 5 aufeinander folgenden Tagen.
- Entpacken Sie die vestibulären Sinnesepithel (3 Cristae und 1 utrikulären Makula) aus beiden Ohren am fünften Tag nach der Behandlung (siehe Abschnitt 3 unten).
3. Die Gewebeextraktion 20
- Bereiten 300 ml einer Glycerinbasis künstliche cerebrospinale Flüssigkeit (ACSF), bestehend aus (in mM): 26 NaHCO 3, 11 Glucose, 250 Glycerin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl 2, 2,5 CaCl 2. Vor der Zugabe von CaCl 2, Gas der Lösung mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2), um einen pH von 7,4 herzustellen und vermeiden Calciumpräzipitation (Trübung). Kühlen Sie die Lösung in einen -80 ° C Gefrierschrank für 45 Minuten, so dass ein Eisbrei gebildet.
- Bereiten Sie die RNA-Isolierung Lysepuffer in markierter Schraubverschluss Mikroröhrchen (stoppt das Knallen der Deckel bei Rohrdruckänderungen zwischen Einfrieren und Auftauen in flüssigem Stickstoff) nachden Anweisungen des Herstellers oder üblichen Laborpraxis. Haben flüssigem Stickstoff fertig in einem Aluminium Dewargefäß.
HINWEIS: Verwenden Sie Schutzkleidung und eyeware beim Umgang mit flüssigem Stickstoff. Stellen Sie sicher, dass flüssiger Stickstoff befindet sich in einem gut belüfteten Raum verwendet, da das Volumen der Gasform ist etwa 700 mal so seiner flüssigen Form und können Ersticken verursachen. - Tief anaesthetize Mäuse mit Ketamin (400 mg / kg) über eine intraperitoneale Injektion. Lassen Sie die Hintergliedmaße Reflex vollständig als Hinweis darauf, dass Mäuse vollständig betäubt abklingen.
- Enthaupten Mäusen mit scharfen Edelstahl Schere und einen Einschnitt entlang der sagittalen Haut des Schädels mit einer Rasierklinge (gerundet # 22). An dieser Stelle und in Schritte von 3,5 bis 3,9, halten das Schädeldach, Gehirn, und die zugrunde liegenden Vestibularapparat so kühl wie möglich durch die regelmäßige Anwendung der eiskalten ACSF über das Gewebe.
- Mit dem spitzen Arm Standardmuster Schere einen small Einschnitt in den Schädel zu Lambda und entlang der Pfeilnaht geschnitten.
- Schieben Sie den Arm von einem flachen Rongeure unter dem Scheitelbein hält die Klinge so nah wie möglich an der unteren Oberfläche des Knochens, ohne Ziehen des Gehirns. Sichern Sie und ziehen weg die Scheitelbein seitlich und das Hinterhauptbein hinten, bis das Gehirn ausgesetzt ist.
- Verwenden Sie einen kleinen Spatel aus rostfreiem Stahl, und heben Sie das Gehirn weg von der vorderen und mittleren Schädelgrube, um die Gleichgewichtsnerv (CN VIII) aus. Durchschneiden den Nerv, um unnötige Spannung auf die primären afferenten Axone, die direkt innervieren die vestibulären Haarzellen zu verhindern.
- Entfernen Sie das Gehirn in toto nach Durchtrennung des KN-VIII.
- Beachten Sie die knöchernen Labyrinth mit der Cochlea und der peripheren vestibulären Organe in der mittleren Schädelgrube. Machen Sie zwei kleine Schnitte neben jeder knöchernen Labyrinth und Verbrauchsteuern die gesamte Struktur, indem Sie den vorderen Bogengangs und später ziehenVerbündeter.
- Sofort tauchen exzidierten Labyrinthe in einer Sezieren Schale mit eiskaltem ACSF-Lösung (wie in Schritt 3.1 beschrieben), während kontinuierlich mit Carbogen Perfusion.
- Unter einem Stereomikroskop, halten Sie durch das Labyrinth der Cochlea und befestigen Sie sie am Boden der Schale mit einer Pinzette.
- Verwenden Sie gerade feinen Pinzette, eine kleine Öffnung in der Knochen über der vorderen Bogengangs (SSC) Ampulle kratzen.
- Vergrößern Sie vorsichtig diese Öffnung durch das Erreichen unmittelbar unter dem Knochen und schnippte nach außen weg von der Ampulle. Seien Sie vorsichtig, hier nicht schieben Pinzette in die Öffnung und Beschädigung des fragilen häutige Labyrinth unten. Fahren Sie auf diese Weise, bis der Utriculus, vorderen und seitlichen Ampullen alle ausgesetzt sind. Wenn möglich, entfernen Sie auch die hinteren Ampulle.
- Mit feinen Pinzette vorsichtig heben Sie den Utriculus und Ampullen aus dem knöchernen Labyrinth, bis sie vollständig gelöst sind. Wo es möglich ist, halten Sie siedurch die damit verbundenen Bogengänge um eine Beschädigung der Sinnesepithel. In einigen Fällen muss der proximale Teil des halbkreisförmigen membranöse Kanal mit Irisschere geschnitten, um die Ampullen aus dem Knochen zu lösen.
- Sicher erfassen die Vestibularorgane zwischen der Spitze der Pinzette und Stelle in den Lysepuffer zuvor in Schritt 3.2 vorbereitet. Vorsichtig schwenken die Zange um im Puffer, um sicherzustellen, Vestibularorgane wurden aus der Zange abgelöst. Überprüfen Sie in diesem Fall, indem die Zange unter dem Stereomikroskop ist.
- Schrauben Sie den Deckel Mikrotubuli und frieren die Probe in flüssigem Stickstoff unmittelbar.
4. RNA-Extraktion und RT-PCR
- Folgen Standardmethoden der Boten-RNA (mRNA) Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers oder bevorzugte Laborprotokollen.
HINWEIS: Ein handelsüblicher Kit, das Träger RNAs verwendet werden, um zu isolieren geringe Ausbeuten an mRNA wurde in diese verwendetProtokoll. Nieder Elutionsvolumina verwendet, um Endkonzentrationen von mRNA zu erhöhen.
HINWEIS: Negative "kein Enzym" Kontrollen (NEC) und "keine DNA-Template" Kontrollen (NTC) müssen ebenfalls durchgeführt werden, um die Gültigkeit der beobachteten Effekte zu gewährleisten. - Anwenden von Standardverfahren der reversen Transkription von mRNA komplementäre DNA (cDNA) und die Amplifikation von Zielgenen 21-23.
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Representative Results
So vergleichen Sie die Auswirkungen der NIR-Behandlung bei jungen (4 Wochen) und älteren (8-9 Monate) Mäusen messen wir die Expression von antioxidativen Superoxid-Dismutase 1 (SOD-1) in junge (n = 16) und ältere (n = 20) Mäuse, die NIR-behandelten scheinbehandelten oder NIR-blockiert waren. Figur 2 zeigt eine signifikante Zunahme der β-Actin-normalisierten SOD-1-Expression von mehr als 2-fach in jungen NIR-behandelten Tieren im Vergleich zu jungen scheinbehandelten Tieren (p <0,01) und junge NIR-blockierten Tieren (p <0,01). Ältere NIR-behandelten Tiere zeigten auch mehr als eine 2-fach Hochregulierung von SOD-1, wenn mit älteren NIR-blockiert Tieren (p <0,05) verglichen.
Abbildung 1. NIR-Behandlung. (A) NIR-LED-Gerät 1 gehalten - 2 cm über dem rasierten Bereich auf dem Kopf der Maus 90 Sekunden pro Tag an 5 aufeinander folgenden Tagen in Bestrahlung treated Mäusen. (B) NIR LED-Gerät über scheinbehandelten Mäuse in der gleichen Weise, aber mit dem Gerät für die Dauer von 90 Sekunden ausgeschaltet gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Analyse von SOD-1-Genexpression nach 5 aufeinanderfolgenden Tagen der NIR Behandlung (90 sec / Tag). Die vestibuläre Sinnesepithel wurde am fünften Tag und spezifische Antioxidans Gens mittels RT-PCR untersucht geerntet. Die SOD-1-Gen wurde normalisiert, um β-Actin-Baseline und Densitometrie durchgeführt mit ImageJ v1.48. Signifikante Hochregulation (p <0,01) von SOD-1-Expression wurde in jungen NIR-behandelten Tieren beobachtet, im Vergleich mit sowohl jungen scheinbehandelten und junge NIR-blockierten Bedienelementen (4 Wochen). Deutliche Steigerung (p &# 60; 0,05) in SOD-1-Expression wurde auch in älteren NIR-behandelten Tieren beobachtet, wenn mit älteren NIR-blockiert Tiere (8 verglichen - 9 Monate). Alle Diagramme zeigen die fache Veränderung der SOD-1-Gen-Expression im Vergleich zu den jungen scheinbehandelten Kontrolle. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD. Die Daten wurden mit one-way ANOVA analysiert und statistische Signifikanz ermittelt nach Tukey-Mehrfachvergleichs post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Die hier beschriebenen repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass kurze transkranielle Lieferung von NIR-Licht (90 sec / Tag für 5 Tage) ist ausreichend, um das Niveau der Antioxidantien Ausdruck in älteren Mäusen zu erhöhen, wenn mit scheinbehandelten Mäusen verglichen. Während abgegebene Wärme könnte eine Quelle der mitochondrialen und / oder neuronale Aktivierung darstellen, wie Ratte berichtet vestibulären Afferenzen 24 - unsere Messung von Wärme durch die NIR emittierten LED-Gerät war <0,2 ° C über 90 s, und als solche ist unwahrscheinlich, die dazu führen, hier beschriebenen Änderungen. Weitere, im Gegensatz zu dem Bericht ausgeführt, werden die hier verwendete NIR-Behandlung wurde nicht direkt auf die Sinnesepithel oder vestibulären afferenten Neuronen angewandt, und als solche ist auch unwahrscheinlich, dass auf thermosensitive Kanäle (zB TRPV4) auswirken. Schließlich früheren Arbeiten mit dem gleichen NIR Gerät in anderen Hirnregionen haben vorgeschlagen, dass die Wärme nicht die Quelle der beobachteten Unterschiede 7,9.
Während diese results zeigen eine Hochregulation der zellulären Reaktionen auf altersbedingten oxidativen Stress auf genetischer Ebene, ist es nicht klar, ob diese Änderungen weitere auf Proteinebene ausgedrückt, oder wichtiger ist, ob sie sich in der Gesamtbilanz Leistung der Mäuse wieder. Darüber hinaus wird die Hochregulation für eine einzelne allgegenwärtigen Antioxidans gezeigt. Es ist wahrscheinlich, dass mehrere Marker des Zellstoffwechsels von diesem Behandlungsschema sind betroffen. Da ferner mRNA wurde aus Vestibularapparates in toto entnommen (dh Haarzellen, Stützzellen, vestibuläre Afferenzen und Epithel alle vorhanden) ist es nicht möglich, beobachteten Veränderungen im Zellstoffwechsel in Abhängigkeit von NIR-Licht-Behandlung zu einer bestimmten vestibulären Haar beziehen Zelle oder primären afferenten Typ. Wichtig ist aber, mit dem beschriebenen Herstellungs ausreichend mRNA kann von einem einzigen Mausklick extrahiert werden, um künftige korrelative Studien zwischen den Zellstoffwechsel und die Verhaltensanalyse von Gleichgewicht perfo ermöglichenrmance.
Die hohe Intensität LED-Gerät verwendet, hier gibt etwa 5 J / cm 2 pro 90 sec Behandlungs- insgesamt 25 J Energie über 5 Tage. Während der Vorteil der Verwendung von Licht langer Wellenlänge (einschließlich NIR) Penetranz, kann nicht davon ausgegangen, dass die volle 25 J von NIR-Licht wird zu dem vestibulären Sinnesepithel bracht. Bei der Maus muss Licht von mindestens 1 mm durch Schichten von Weichgewebe und Knochen, die den peripheren vestibulären Apparat und schützen das Gehirn eindringen. Beim Menschen erstreckt sich auf Zentimetern. So ist die Penetranz von Licht stellt eine Beschränkung der beschriebenen Technik in Bezug auf die Übersetzung des NIR-Licht Behandlungsstrategien in der klinischen Einstellung. Neuere Arbeiten haben jedoch Glasfasern eingesetzt, um NIR-Licht zu tiefen Hirnstrukturen einschließlich der Basalganglien 25 und Sinnesorgane einschließlich der Cochlea 26 zu liefern. Auf dieser Basis und die Lage des peripheren Vestibularapparat benachbart derCochlea (und klinische Zugriff darauf über den Warzenfortsatz), ist es möglich, dass im menschlichen vorschlagen, könnte eine direkte Stimulation des vestibulären Sinnesepithel durch eine kleine Lichtleiter ausgelöst durch ein externes Gerät erreicht werden - vergleichbar mit einem Cochlea-Implantat 27 .
Mehrere Bedingungen können in der oben beschriebenen, um das Interesse des Forschers anzupassen Protokoll geändert werden. Erstens verwendet die Wellenlänge here (670 nm) kann erweitert zu längeren Wellenlängen im Infrarotbereich umfassen, wie zuvor in anderen sensorischen Systemen und Tiermodellen berichtet. Zweitens können Behandlungen auch abhängig davon, ob kurzfristige oder langfristige Antwort ist in Frage variiert werden. Hier wurde eine sehr kurze Behandlungsschema verwendet, aber dies könnte zu längeren Laufzeiten oder auch kürzere Laufzeiten verlängert, um die Dynamik der NIR-induzierten Veränderungen zu messen.
Die größte Herausforderung dieses Protokolls ist es, die Überlebensfähigkeit des Gewebes zu erhaltenwährend der Gewebeentnahme. Angesichts der Zeit benötigt, um die knöchernen Labyrinth entfernen und Verbrauchsteuern die häutige Labyrinth von ihm, ist es entscheidend, metabolischen Abbau zu reduzieren. Dies wird durch Baden des Gewebes in eiskaltem ACSF während des gesamten Verfahrens und Perfusion diese Lösung kontinuierlich mit Carbogen erreicht. Darüber hinaus am Ende der Präparation Prozedur weiter Gewebeabbau kann mit der Verwendung von flüssigem Stickstoff zu blinken frieren die extrahierten Gewebe angehalten werden. Gegebenenfalls kann man das gefrorene Gewebe aufgetaut und mRNA extrahiert zur weiteren Genanalyse.
Obwohl die hier beschriebenen Methoden beschreiben nicht die vollständige Wirkung der NIR-Licht-Behandlung auf den Zellstoffwechsel im vestibulären Sinnesepithel können weitere Anwendung dieser Strategie geändert, um andere altersassoziierten Marker der Mitochondrienfunktion 28,29 und / oder Zellstoffwechsel einschließen Beleidigungen wie Hypoxie 30. Letztlich ist die Fähigkeit, die v beschreibenestibular zellulären Stoffwechselprofil eines einzelnen Maus wird die Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Leistung und Balance subzellulärer Prozesse während der Alterung, und die Auswirkungen der Therapie mit NIR-Behandlung zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, sie haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Paul Witting und Frau Genevieve Fong für ihre Unterstützung bei der mRNA-Extraktion und PCR zu bestätigen, und die Garnett Passe und Rodney Williams Memorial Foundation für die Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quantum WARP 10 | Quantum Devices | 2070N030-A | |
| Screw top microtubules | Quality Scientific Plastics | 520-GRD-Q | |
| Ketamine | Parnell, Alexandria Australia | ||
| Standard pattern scissors | FST | 14001-12 | |
| Carbon steel surgical blades #22 | Livingstone | SBLDCL 22 | |
| Friedman-Pearson rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Dumont #5 SF forceps | FST | 11252-00 | |
| Isolate II RNA Micro Kit | Bioline | BIO-52075 |
References
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