近赤外（NIR）の光は、マウス前庭感覚上皮におけるミトコンドリア機能のマーカーの発現を増加させる

Summary

ミトコンドリア機能障害は、細胞老化の特徴である。本論文では、高齢化マウス前庭感覚上皮におけるミトコンドリア機能を改善するために、非侵襲的近赤外（NIR）処理を使用しています。

Abstract

加齢とのバランス機能の低下を減衰させるための戦略は、主にバランスの作業や運動などの物理的な治療法に焦点を当てている。しかし、これらのアプローチは、バランスの衰退の根本的な原因に対処していない。マウスを用いて、前庭感覚上皮における細胞の代謝に近赤外光（NIR）の影響を評価した。収集されたデータは、このシンプルで安全な介入は自然老化の有害な影響からこれらの脆弱な細胞を保護することができることを示している。 mRNAは、孤立した末梢前庭感覚上皮（膨大部稜と卵形黄斑）から抽出し、続いてcDNAライブラリーに転写した。このライブラリは、その後ユビキタス酸化防止剤（SOD-1）の発現についてプローブした。抗酸化遺伝子の発現は、その後、細胞代謝を定量した。若い（4週間）でのNIR経頭蓋配信を使用し、古い（8から9ヶ月）マウス、および5日間の簡単な治療レジメン（90秒/日AYS）、この作業は、単独NIrを前庭感覚上皮におけるミトコンドリアの機能を改善するのに十分であり得ることを示唆する。前庭有毛細胞の機能を改善するための治療に使用可能な、手頃な価格の、非侵襲的な方法は現在存在しないので、外部NIrを放射線の適用は、前庭感覚上皮inthe細胞代謝の老化の影響に対抗する潜在的な戦略を提供する。

Introduction

定率性能およびその後滝一般的であり、残念ながら、多くの場合、自然老化¹の特徴を定義する。この減少の影響は、物理的および社会的の両方である、と大幅に高齢者の生活の質を低減することができます。応答では、物理療法やリハビリテーションは、滝の研究の焦点となっているが、繰り返し滝の有病率の一貫した減少と関連していない。同時に、作業は、末梢または中枢前庭系（バランスを維持する責任システム）乏しく、これらのシステムを標的とする潜在的な治療戦略の変更や制限された不均衡の根本的な原因を調査する。

加齢性黄斑変性症^2-4、アルツハイマー病モデル^5-8、およびパーキンソン病^9-12を含む加齢関連神経変性疾患に関する最近の研究は、済州の神経保護効果を示した近赤外（NIR）光のmple非侵襲的アプリケーション。さらに、前庭系に、NIrをインビトロ¹³前庭一次求心性ニューロンの活性を増大させるために使用されてきた。 NIR光のメカニズムはよく理解されていないが、NIrをを使用してほとんどの研究は、NIRは、細胞代謝を促進するために、ミトコンドリア複合体IV（シトクロムcオキシダーゼ^）14-17を刺激すること^を示唆している。前庭感覚上皮ではI型有毛細胞の表皮下プレートは、ミトコンドリア¹⁸で緻密であり、そのように治療のNIR治療のための作用部位を表すことができる。

ここで、頭蓋の簡単な非侵襲的処置レジメンは、細胞の代謝を測定するために使用することができる（および含意、ミトコンドリア機能によって）マウス前庭感覚上皮に記載されているNIrを適用した。また議論前庭感覚上皮の調製物であり、それは、NIRはubiquitoの発現を増加させることが示されている感覚上皮における我々の抗酸化剤（スーパーオキシドジスムターゼ1） -以前に蝸牛の有毛細胞の生存¹⁹にとって重要であることが示される。

Protocol

倫理声明：以下のとおり、すべての手順は、シドニーの動物倫理委員会の大学によって承認された。

1.動物

注：1と8から9カ月齢のマウス（C57 / BL6）は、動物資源センター（パース、オーストラリア）から入手した。マウスは、シドニー大学のボッシュ齧歯類の施設に収容した。

1. 食料と水を自由にアクセスできる12/12時間の明/暗サイクル上の標準的なマウスケージの住宅マウス。
2. 近赤外線に各年齢群で除算マウス（NIR）処理された、または偽の比較のために（対照）処置群。

2.近赤外（NIR）照射とシャム治療

1. 治療レジメンの完了前に髪の迅速な再成長を防ぐために可能な限り厳密に電気かみそりでマウスの頭頸部領域に毛皮を剃る。マウスの病原体を含まない状態を維持するために、70％エタノールを使用してシェービング動物や別々のケージから動物との間にF10獣医消毒剤の間に楽器をきれいにする。動物が過剰に処理されないので、治療前の先頭に3日間 - この2か。
2. 尾の近位端を保持することによってマウスを拘束し、誤った結果をもたらし得る応力を最小限にするように、一方またはベンチトップの手のひらにリラックスできるようにする。
3. LED NIrを（670 nm）を（発光ダイオード）1デバイスホールド- 2センチ離し暴露（坊主頭）地域からの90秒（ 図1A）のための装置のスイッチを入れる。
   注：90秒の曝露の結果として温度変化を100mlの水に0.2°C <として測定された。
4. 動物の偽処置群について2.3が、デバイスがオフになった（ 図1B）を残す-繰り返して、2.2を繰り返します。
5. 動物の近赤外ブロックされて治療群2.3が、アルミ箔でデバイスをカバーする - 繰り返して、2.2を繰り返します。
6. approximat毎日2.5 - 繰り返して、2.2ステップ5日間連続してE 24時間間隔。
7. 五日目、治療後に両耳から前庭感覚上皮（3クリステと1卵形黄斑）を抽出（下記のセクション3を参照してください）。

3.組織抽出²⁰

1. 26のNaHCO _3、11グルコース、250グリセロール、2.5のKCl、1.2のNaH ₂ PO _4、1.2のMgCl _2、および2.5のCaCl _2：（mm）をからなるグリセロールベースの人工脳脊髄液（ACSF）の300ミリリットルを準備します。 7.4のpHを確立し、カルシウム沈殿（曇り）を避けるためにカルボゲン溶液（95％O ₂および5％CO _{2）、CaCl 2を}添加する前にガス。氷スラリーが形成されるように45分間、-80℃の冷凍庫に溶液を冷却する。
2. 標識されたスクリュートップマイクロチューブ内のRNA単離、溶解緩衝液を調製する（液体窒素中で凍結および融解の間時の管の圧力変化蓋のポッピングを停止する）に従って製造業者の説明書または通常の実験室の実践に。アルミデュワーフラスコ内の液体窒素をご用意ください。
   注：液体窒素を取り扱う際、防護服とeyewareを使用してください。その気体の形態のボリュームが液体の形の約700倍であると窒息の原因となりますので、液体窒素は風通しのよい部屋で使用されていることを確認。
3. 深く腹腔内注射を介してケタミン（400 mg / kgを）をマウスに麻酔し。後肢反射が完全にマウスが完全に麻酔をしていることを示すものとして沈静化することを許可する。
4. 鋭いステンレス製のはさみでマウスを斬首し、かみそりの刃（丸みを帯びた＃22）を使用して、頭蓋骨の矢状皮膚に沿って切開する。この時点で、全体を通して3.5のステップ- 3.9、組織上の氷冷ACSFの通常のアプリケーションによって、できるだけ涼しい頭蓋冠、脳、および基礎となる前庭装置を保つ。
5. Smalのを作る標準パターンハサミの尖った腕の使い方Lラムダで頭蓋骨を切開し、矢状縫合に沿って切断。
6. 静かに脳をドラッグすることなく、骨の下面にできるだけ近いブレードを保ち頭頂骨の下の浅い骨鉗子の一方のアームをスライドさせます。安全で脳が露出するまで後方に横方向に頭頂骨と後頭骨を引き離す。
7. 小さなステンレス製のへらを使用して、内耳神経（CN VIII）を露出するために離れて、前と中頭蓋窩から脳を持ち上げる。直接前庭有毛細胞を神経支配する一次求心性軸索上の不必要な緊張を防ぐために神経を横断する。
8. CN VIIIの切断後TOTOで脳を削除します。
9. 中頭蓋窩における蝸牛及び末梢前庭器官を含む骨迷路を観察します。各骨迷路の横に二つの小さな切開部を作成し、前方の三半規管を保持し、後で引いて、構造全体を切除同盟国。
10. 継続的にカルボゲンで灌流しながら、すぐに（ ステップ3.1で説明したように）の氷冷ACSF溶液を含む解剖皿に切除された迷路を浸す。
11. 実体顕微鏡下では、蝸牛によって迷路を押しながら、ピンセットで皿の底に固定します。
    1. 前方半規管（SSC）膨大部上記の骨に小さな開口部に傷を付けまっすぐ細かい鉗子を使用してください。
    2. 静かにすぐに骨の下に到達し、外側に離れて膨大部からフリックすることで、この開口部を拡大する。開口部に鉗子を押し、以下の脆弱な膜迷路を損傷しないためにここに注意が必要です。卵形、前方および横方向の膨大部がすべて露出するまで、このように続けます。可能であれば、また事後膨大部を取り外します。
12. 細かい鉗子を使用して、静かに卵形嚢を持ち上げ、彼らが完全に切り離されるまで、骨迷路から離れて膨大部。可能な場合には、それらを保持するそれらに関連する半規管によって感覚上皮の損傷を避けるために。いくつかのケースでは、半円形膜状管の近位部は、骨から膨大部を解放するために虹彩鋏で切断する必要があるかもしれない。
13. 確実にステップ3.2で先に作成した溶解バッファに鉗子の先端と場所との間に前庭器官を把握する。静かに前庭器官が鉗子から切り離されていることにバッファ内の周りに鉗子を旋回。これは実体顕微鏡下でピンセットを持って来ることでケースです確認してください。
    1. 微小管の蓋のネジと、すぐに液体窒素でサンプルを凍結する。

4. RNA抽出およびRT-PCR

1. メーカーの指示又は好ましい実験室プロトコルに従ってメッセンジャーRNA（mRNA）の抽出の標準的な方法に従ってください。
   注：mRNAの小さな収量を特定するためにキャリアRNAを利用し、市販のキットが、この中で使用されたプロトコル。低い溶出量は、mRNAの最終濃度を増加させることができる。
   注：負の「酵素なし」のコントロール（NECS）と「無DNAテンプレート」コントロール（NTCの）も観察された影響の妥当性を確保するために完了する必要があります。
2. 標的遺伝子^21-23の相補的DNA（cDNA）の増幅のmRNAの逆転写の標準的な方法を適用する。

Representative Results

若い（4週間）と古いでNIrを治療の影響を比較する（8から9ヶ月）マウスを、我々は若いた（n = 16）に、酸化防止剤、スーパーオキシドジスムターゼ1（SOD-1）の発現を測定し、古いた（n = 20）偽処理、または近赤外線遮断され、近赤外処理したマウス。 図2は、若い偽処置動物と比較して若いNIrを処理動物で2倍以上のβアクチン正規化されたSOD-1発現の有意な増加を示しているた（p <0.01）および若年NIrをブロックされた動物に（p <0.01）。古いNIrを処理動物古いNIrをブロックされた動物に（p <0.05）と比較した場合にも、SOD-1の2倍のアップレギュレーション以上を示した。

1. NIrを治療図。照射トリートメントルームで5日間連続して2センチ一日あたり90秒間マウスの頭の上に剃っ領域の上に- 1開催（A）NIrをLEDデバイステッドマウスは。（B）NIrを同じ方法で、90秒の間、オフのデバイスで偽処置したマウスの上方に保持デバイスのLED。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

NIrを処理（90秒/日）の連続5日後のSOD-1遺伝子発現の図2の分析。前庭感覚上皮は、五日目およびRT-PCRを使用するためのプローブし、特定の抗酸化遺伝子に収穫した。 SOD-1遺伝子は、βアクチンするImageJのv1.48を使用して行われ、ベースラインとデンシトメトリーを標準化した。若い偽処置および若年NIrをブロックした対照（4週間）の両方と比較した場合、SOD-1発現の有意なアップレギュレーションした（p <0.01）が、若いNIrを処理動物で観察された。大幅な増加（P＆＃60; 9ヶ月） - 古いNIrをブロックされた動物（8と比較した場合、SOD-1発現の0.05）もNIrを処置した高齢の動物で観察された。すべてのグラフは、若い偽処理対照と比較して、SOD-1遺伝子発現の変化倍率を示している。データは平均±SDを表す。すべてのデータは一元配置分散分析を用いて分析し、統計的有意性は、Tukeyの多重比較事後検定を用いて決定した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ここで説明する代表的な結果は、NIR光の短い頭蓋送達（5日間90秒/日）は、偽処置マウスと比較して老齢マウスにおける抗酸化物質の発現のレベルを上昇させるのに十分であることを示している。放出されながら熱は、ラットの前庭求心²⁴について報告されているよう、ミトコンドリアおよび/ ​​またはニューロンの活性化の源を表すことができる- NIrをすることによって放出される熱の私たちの測定は、90秒間にわたり、<0.2℃であり、そのように引き起こす可能性は低いLED装置ここで説明する変更。報告書は、上記で強調とは異なりまた、ここで使用される近赤外治療は、感覚上皮または前庭求心性神経細胞に直接適用されませんでした、そのようにも感熱チャネル（ 例えば、TRPV4）に影響を与えることはほとんどありません。最後に、他の脳領域で同じNIrを装置を用いた以前の研究は、熱が観察された相違点^7,9の原因ではなかったことを示唆している。

これらのRESUながらLTSは、遺伝子レベルでの加齢に伴う酸化ストレスに対する細胞応答のアップレギュレーションを示し、それは、それらがマウスの全体的なバランス性能に反映されているかどうか、重要なことに、これらの変化は、さらに、タンパク質レベルで発現されるかどうかは明らかではない、または。また、アップレギュレーションは、単一のユビキタス抗酸化について示されている。これは、細胞代謝の複数のマーカーがこの治療計画によって影響を受ける可能性がある。さらに、mRNAを（ 例えば、有毛細胞、支持細胞、前庭求心性および上皮すべて存在する）は、特定の前庭毛髪にNIrを光処理に応答した細胞の代謝の観察された変化を関連付けることは不可能であるトトに前庭器から抽出されて以来細胞または一次求心性タイプ。重要なことに、しかし、記載の調製十分なmRNAを使用することは、細胞の代謝とバランスperfoの行動解析の間の将来の相関の研究を可能にするために、単一のマウスから抽出することができるrmance。

ここで使用される高輝度LEDデバイスは、5日間でエネルギーの25 Jを合計treatment- 90秒ごとに約5 J / cm ²程度^を発する。 （NIrを含む）長波長光を使用する利点は、浸透度であるが、近赤外光の完全な25 Jは、前庭感覚上皮に送達されることを仮定することはできない。マウスでは、光は、末梢前庭器および脳を保護する軟組織及び骨の層を介して少なくとも1mmに浸透しなければならない。ヒトでは、これは、センチメートルに及ぶ。したがって、光の浸透度は、臨床現場へのNIrを光治療戦略の翻訳に関してに記載された技術の限界を表している。最近の研究は、しかし、大脳基底核^25、及び蝸牛²⁶を含む感覚器官を含む脳深部構造に近赤外光を提供する光ファイバを採用しています。これと隣接する周辺前庭器の位置に基づいて蝸牛インプラント²⁷に類似-蝸牛（および乳様突起を介してそれへの臨床アクセス）は、ヒトにおいて、前庭感覚上皮の直接刺激は、外部デバイスによってトリガ小型光ファイバを介して達成され得ることを示唆することが可能である。

いくつかの条件は、研究者の関心に適合するように、上述したプロトコルの変形が可能である。まず、ここで使用される波長（670 nm）は、以前に他の感覚系および動物モデルで報告されたように、赤外領域においてより長い波長を含むように拡張することができる。第二に、治療計画はまた、短期または長期の応答に問題があるかどうかに応じて変化させることができる。ここでは非常に短い治療レジメンを利用したが、これは、NIR誘導された変化のダイナミクスを測定するために、より長い期間、またはより短い期間に拡張することができた。

このプロトコルの主な課題は、組織の生存能力を維持することである組織抽出中。骨迷路を削除し、それから膜迷路を切除するために必要な時間を与え、それが代謝分解を低減することが重要である。これは、全体の手順を通して、氷冷ACSFで組織を入浴やカルボゲンで連続このソリューションを灌流することによって達成される。また、切開手順の最後に、さらなる組織の分解は、抽出された組織を凍結フラッシュする液体窒素を使用して停止させることができる。適切な場合、凍結組織を解凍し、mRNAはさらに、遺伝子分析のために抽出することができる。

ここで説明する方法は、前庭感覚上皮における細胞代謝に対するNIR光治療の完全な影響を記述していないが、この戦略のさらなる適用は、ミトコンドリア機能^28,29および/ ​​または細胞の代謝の他の年齢関連マーカーを含むように修飾することができるそのような低酸素症³⁰として侮辱。最終的に、能力ます。v記述する個々のマウスのestibular細胞代謝プロファイルは、高齢化の間にバランスのパフォーマンスと細胞内プロセス間の相関関係の調査、及びNIR処理を含む治療薬の影響をできるようになります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quantum WARP 10	Quantum Devices	2070N030-A
Screw top microtubules	Quality Scientific Plastics	520-GRD-Q
Ketamine	Parnell, Alexandria Australia
Standard pattern scissors	FST	14001-12
Carbon steel surgical blades #22	Livingstone	SBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16221-14
Stereo microscope	Leica Microsystems	A60S
Dumont #5 SF forceps	FST	11252-00
Isolate II RNA Micro Kit	Bioline	BIO-52075