Summary
La disfunción mitocondrial es una característica de la senescencia celular. En este trabajo se utiliza el tratamiento no invasivo de infrarrojo cercano (NIR) para mejorar la función mitocondrial en el ratón epitelio sensorial vestibular envejecimiento.
Abstract
Las estrategias para atenuar la disminución en la función del equilibrio con la edad son predominantemente centrada en terapias físicas que incluyen tareas de equilibrio y ejercicios. Sin embargo, estos enfoques no abordan las causas subyacentes del declive de equilibrio. Utilizando ratones, se evaluó el impacto de la luz del infrarrojo cercano (NIR) en el metabolismo de las células en el epitelio sensorial vestibular. Los datos recogidos muestran que esta intervención simple y seguro puede proteger estas células vulnerables de los efectos perjudiciales del envejecimiento natural. ARNm se extrajo a partir del epitelio sensorial vestibular periférica aislada (ampullaris crista y la mácula del utrículo) y posteriormente se transcribe en una biblioteca de ADNc. Después, esta biblioteca se probaron para la expresión de antioxidante ubicua (SOD-1). Entonces Antioxidante expresión génica se utilizó para cuantificar el metabolismo celular. Utilizando la entrega transcraneal de Nir en jóvenes (4 semanas) y mayores (8-9 meses) los ratones, y un régimen de tratamiento breve (90 seg / día durante 5 díasays), este trabajo sugiere Nir solo puede ser suficiente para mejorar la función mitocondrial en el epitelio sensorial vestibular. Dado que actualmente no hay métodos disponibles, asequibles, no invasivos de la terapia para mejorar la función de las células ciliadas vestibulares, la aplicación de radiación NIR externa proporciona una posible estrategia para contrarrestar el impacto del envejecimiento en el metabolismo celular enel epitelio sensorial vestibular.
Introduction
Disminución en los resultados equilibrio y caídas posteriores son comunes, y por desgracia a menudo características definitorias de envejecimiento natural 1. El impacto de esta disminución puede ser tanto físico y social, y reduce significativamente la calidad de vida de las personas mayores. En respuesta, las terapias físicas y de rehabilitación han sido el foco de la investigación de cataratas, pero no se han asociado con la reducción constante en la prevalencia de caídas repetidas. Al mismo tiempo, el trabajo de investigación de los cambios en el sistema vestibular periférico o central (el sistema responsable de mantener el equilibrio) es escasa, y posibles estrategias terapéuticas dirigidas a estos sistemas y las causas subyacentes del desequilibrio limitado.
Trabajos recientes sobre los trastornos neurodegenerativos asociados con la edad, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad 2-4, modelos de enfermedad de Alzheimer 5-8, y la enfermedad de Parkinson 9-12 han demostrado efectos neuroprotectores de simple aplicación no invasiva de infrarrojo cercano (NIR) la luz. Además, en el sistema vestibular, NIR se ha utilizado para aumentar la actividad de las neuronas aferentes primarias vestibulares in vitro 13. Aunque no se entiende bien el mecanismo de la luz NIR, la mayoría de los estudios que utilizan NIR han sugerido que NIR estimula las mitocondrias complejo IV (citocromo c oxidasa) 14-17 para facilitar el metabolismo celular. En el epitelio sensorial vestibular la placa subcuticular de células que el cabello de tipo es denso en las mitocondrias de 18 años y, como tal, puede representar un punto de acción para el tratamiento terapéutico NIR.
Aquí, una breve régimen, el tratamiento no invasivo de transcraneal aplica NIR que se puede utilizar para medir el metabolismo celular (y por implicación, la función mitocondrial) en el ratón epitelio sensorial vestibular se describe. También se discutió es una preparación del epitelio sensorial vestibular y se muestra que NIR aumenta la expresión de un ubiquitonos anti-oxidante (superóxido dismutasa 1) en el epitelio sensorial - previamente demostrado ser importante para la supervivencia de las células ciliadas cóclea 19.
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Protocol
Declaración de Ética: Todos los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por la Universidad de Comité de Ética Animal Sydney.
1. Los animales
NOTA: 1 y 8 - Un 9 meses de edad ratones (C57 / BL6) se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (Perth, Australia). Los animales fueron alojados en el Fondo para Bosch de roedores en la Universidad de Sydney.
- Ratones Casa en jaulas estándar del ratón en un 12/12 horas de luz / oscuridad ciclo con el acceso a alimentos y agua ad libitum.
- Divida a los ratones en cada grupo de edad en el infrarrojo cercano (NIR) tratados o tratamiento simulado (control) grupos de comparación.
2. Infrarrojo Cercano (NIR) Irradiación y Sham Tratamiento
- Afeitarse la piel en la región de la cabeza y el cuello del ratón con una afeitadora eléctrica tan estrechamente como sea posible para prevenir el rebrote rápida del cabello antes de la finalización del régimen de tratamiento. A fin de mantener el estado libre de patógenos de los ratones, utilice etanol al 70%para limpiar instrumentos entre los animales afeitado y desinfectante veterinaria F10 entre los animales de jaulas separadas. Haga esto 2-3 días antes del comienzo del tratamiento para que los animales no son excesivamente manipulado.
- Restringir ratón manteniendo el extremo proximal de la cola y dejar que se relaje en la palma de una mano o de banco con el fin de minimizar el estrés que podría conducir a resultados falsos.
- Sostenga el NIR (670 nm) LED (diodo emisor de luz) dispositivo 1-2 cm de distancia de la zona expuesta (rebajado) y encienda el dispositivo durante 90 segundos (Figura 1).
NOTA: El cambio de temperatura como resultado de 90 segundos de exposición se midió como <0,2 ° C en 100 ml de agua. - Repita los pasos 2.2 a 2.3 para el grupo de tratamiento simulado de los animales, pero deje el dispositivo apagado (Figura 1B).
- Repita los pasos 2.2 a 2.3 para el grupo de tratamiento bloqueado-NIR de los animales, pero cubre el dispositivo con papel de aluminio.
- Repita los pasos 2.2 a 2.5 días a las approximatintervalos hr e 24 durante 5 días consecutivos.
- Extraer el epitelio vestibular sensorial (3 crestas y 1 mácula utricular) de ambos oídos en el post-tratamiento quinto día (véase la sección 3).
3. Extracción de tejido 20
- Preparar 300 ml de un fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF) basado en glicerol que consiste en (en mM): 26 NaHCO3, 11 glucosa, 250 glicerol, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl2, y 2.5 CaCl 2. Antes de la adición de CaCl2, gas la solución con carbógeno (95% de O2 y 5% de CO 2) para establecer un pH de 7,4 y evitar la precipitación de calcio (nubosidad). Enfriar la solución en un congelador a -80ºC durante 45 min de manera que se forma una suspensión de hielo.
- Preparar el tampón de lisis aislamiento de ARN en microtubos de tapa de rosca marcados (se detiene el estallido de las tapas cuando los cambios de presión del tubo entre la congelación y descongelación en nitrógeno líquido) de acuerdoa las instrucciones del fabricante o las prácticas habituales de laboratorio. Tener nitrógeno líquido listo en un frasco Dewar de aluminio.
NOTA: Utilice ropa protectora y eyeware al manejar nitrógeno líquido. Asegúrese de que se utiliza nitrógeno líquido en una habitación bien ventilada, ya que el volumen de su forma de gas es aproximadamente 700 veces mayor que la de su forma líquida y puede causar asfixia. - Profundamente anestesiar a los ratones con ketamina (400 mg / kg) a través de una inyección intra-peritoneal. Deje que el reflejo de las extremidades posteriores se desplome por completo como indicación de que los ratones están completamente anestesiados.
- Decapitar a los ratones con tijeras de acero inoxidable afiladas y hacer una incisión a lo largo de la piel sagital del cráneo usando una cuchilla de afeitar (redondeado # 22). En este punto y los pasos a lo largo de 3.5 a 3.9, mantener la bóveda del cráneo, el cerebro y aparato vestibular subyacente lo más fresco posible por la aplicación regular de ACSF helada sobre el tejido.
- Utilizando el brazo con punta de tijeras patrón estándar hacer una Small incisión en el cráneo en Lambda y cortar a lo largo de la sutura sagital.
- Deslice suavemente un brazo de una gubia poco profundas debajo del hueso parietal de mantenimiento de la cuchilla lo más cerca posible a la superficie inferior del hueso sin arrastrar el cerebro. Seguros y alejarse del hueso parietal lateral y el hueso occipital posterior hasta que se vea el cerebro.
- Use una pequeña espátula de acero inoxidable y levante el cerebro lejos de la anterior y la fosa craneal media para exponer el nervio vestíbulo coclear (CN VIII). Seccionar el nervio para evitar tensiones innecesarias en los axones aferentes primarias que inervan directamente las células ciliadas vestibulares.
- Retire el cerebro en su totalidad después de la sección del CN VIII.
- Observe el laberinto óseo contiene la cóclea y los órganos vestibulares periféricas en la fosa craneal media. Haga dos incisiones pequeñas al lado de cada laberinto óseo y extirpar toda la estructura sosteniendo el canal semicircular anterior y tirando despuésaliado.
- Inmediatamente sumerja laberintos extirpados en un plato de la disección de la solución que contiene ACSF enfriado en hielo (como se describe en el paso 3.1), mientras continua perfusión con carbógeno.
- Bajo un microscopio estereoscópico, mantenga pulsado el laberinto de la cóclea y fijarlo a la parte inferior del plato con fórceps.
- El uso de fórceps recto finas rayar una pequeña abertura en el hueso por encima del canal semicircular (SSC) ampolla anterior.
- Ampliar suavemente esta apertura al llegar inmediatamente debajo del hueso y chasqueando hacia el exterior lejos de la ampolla. Tenga precaución para no empujar fórceps en la abertura y dañar el laberinto membranoso frágil continuación. Continuar de esta manera hasta el utrículo, anterior y lateral ampollas están expuestos. Si es posible eliminar la ampolla posterior también.
- Con unas pinzas finas, levante suavemente el utrículo y ampollas lejos del laberinto óseo hasta que estén completamente separados. Siempre que sea posible, mantenerlospor sus canales semicirculares asociados para evitar dañar el epitelio sensorial. En algunos casos, puede ser necesario cortar con tijeras iris para liberar las ampollas de la médula la parte proximal del conducto membranoso semicircular.
- Agarrar firmemente los órganos vestibulares entre la punta del fórceps y el lugar en el tampón de lisis preparado anteriormente en el paso 3.2. Agite suavemente la pinza alrededor en el búfer para asegurar órganos vestibulares han desprendido de los fórceps. Compruebe este es el caso de llevar a los fórceps bajo el microscopio estereoscópico.
- Tornillo en la tapa de los microtúbulos y congelar la muestra en nitrógeno líquido inmediatamente.
4. Extracción de ARN y RT-PCR
- Siga métodos estándar de ARN mensajero (ARNm) de extracción de acuerdo con las instrucciones del fabricante o protocolos de laboratorio preferidos.
NOTA: Un kit comercial que utilizó ARN portador para ayudar a aislar pequeños rendimientos de ARNm se utilizó en esteprotocolo. Volúmenes de elución más bajas pueden ser usados para aumentar las concentraciones finales de mRNA.
NOTA: Negativo controles "sin enzima" (CNE) y controles "sin plantilla de ADN" (NTC) también deben completarse para asegurar la validez de los efectos observados. - Aplicar métodos estándar de la transcripción inversa de ARNm en ADN complementario (ADNc) y la amplificación de los genes diana 21-23.
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Representative Results
Para comparar el impacto del tratamiento en Nir joven (4 semanas) y mayores (8-9 meses) los ratones que mide la expresión de antioxidante superóxido dismutasa 1 (SOD-1) en jóvenes (n = 16) y mayores (n = 20) Los ratones que fueron NIR-tratada, tratada simulada, o bloqueado-NIR. La Figura 2 muestra un aumento significativo en normalizado SOD-1 la expresión de β-actina de más de 2 veces en los animales jóvenes tratados con NIR jóvenes en comparación con los animales tratados con placebo (p <0,01) y animales jóvenes bloqueados-NIR (p <0,01). Los animales tratados con Nir mayor también mostraron más de un 2 veces sobre regulación de SOD-1 en comparación con los animales más viejos bloqueados-NIR (p <0,05).
Figura 1. Tratamiento NIR. 2 cm por encima de la región de afeitado en la cabeza del ratón durante 90 segundos por día durante 5 días consecutivos en trea irradiación - (A) Nir dispositivo portátil 1 LEDratones TED. (B) Nir dispositivo mantenido por encima de los ratones tratados con placebo de la misma manera pero con el dispositivo apagado durante la duración de 90 seg LED. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de la SOD-1 la expresión génica después de 5 días consecutivos de tratamiento NIR (90 seg / día). El epitelio sensorial vestibular se cosechó en el quinto día y el gen antioxidante específica sondeado para el uso de RT-PCR. El gen SOD-1 se normalizó a β-actina línea de base y una densitometría realizada utilizando v1.48 ImageJ. Sobre regulación significativa (p <0,01) de la SOD-1 de expresión se observó en los animales jóvenes tratados con NIR en comparación con tanto tratado de referencia y los controles jóvenes bloqueados-NIR (4 semanas) joven. Aumento significativo (p &# 60; 0,05) en SOD-1 de expresión también se observó en los animales más viejos tratados-NIR en comparación con los animales de más edad bloqueados-NIR (8 - 9 meses). Todos los gráficos muestran el pliegue del cambio de SOD-1 la expresión génica en comparación con los jóvenes de control tratado de referencia. Los datos representan la media ± SD. Todos los datos fueron analizados mediante un modelo lineal y la significación estadística determinaron utilizando la comparación múltiple de Tukey post-hoc test. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los resultados representativos descritos aquí muestran que breve entrega transcraneal de la luz NIR (90 seg / día durante 5 días) es suficiente para elevar los niveles de expresión de antioxidantes en ratones de edad avanzada en comparación con los ratones tratados con placebo. Mientras que el calor emitido podría representar una fuente de mitocondrial y / o activación neuronal, según lo informado por vestibular rata aferentes 24 - nuestra medición del calor emitido por el NIR LED dispositivo fue <0,2 ° C durante 90 segundos, y como tal, es poco probable que cause la cambios describen aquí. Además, a diferencia del informe destacó anteriormente, el tratamiento NIR utilizado aquí no se aplicó directamente al epitelio sensorial o neuronas aferentes vestibulares, y como tal, es poco probable que un impacto en canales termo sensibles (por ejemplo, TRPV4) también. Por último, el trabajo previo con el mismo dispositivo de Nir en otras regiones del cerebro han sugerido que el calor no era la fuente de las diferencias observadas 7,9.
Si bien estos results mostrar una sobre regulación de las respuestas celulares al estrés oxidativo asociado a la edad en el nivel genético, no está claro si estos cambios se expresan más a nivel de proteínas, o importante, ya sea que se reflejan en el rendimiento global de la balanza de ratones. Además, la regulación se muestra para un solo antioxidante ubicua. Es probable que múltiples marcadores del metabolismo celular se ven afectados por este régimen de tratamiento. Además, puesto que el ARNm se extrajo del aparato vestibular en su totalidad (es decir, células ciliadas, células de soporte, las fibras aferentes vestibulares y el epitelio todos los presentes) no es posible relacionar los cambios observados en el metabolismo celular en respuesta a tratamiento con luz NIR a un pelo vestibular específica tipo de célula o aferente primaria. Es importante destacar, sin embargo, el uso de la preparación descrita mRNA suficiente se puede extraer de un solo ratón para permitir que los futuros estudios correlativos entre el metabolismo celular y análisis de comportamiento del equilibrio performance.
El dispositivo LED de alta intensidad utilizada aquí emite aproximadamente 5 J / cm 2 por 90 seg de tratamiento- un total de 25 J de energía de más de 5 días. Mientras que la ventaja de la utilización de la luz de longitud de onda larga (incluyendo NIR) es penetrancia, no se puede suponer que la plena 25 J de la luz NIR se entrega al epitelio sensorial vestibular. En el ratón, la luz debe penetrar al menos 1 mm a través de capas de tejido blando y el hueso que protegen el aparato vestibular periférica y el cerebro. En los seres humanos esto se extiende a centímetros. Así, la penetrancia de la luz representa una limitación de la técnica descrita en lo que se refiere a la traducción de NIR estrategias de tratamiento de luz en el entorno clínico. Trabajos recientes sin embargo ha empleado fibra óptica que suministra la luz NIR a las estructuras profundas del cerebro, incluyendo los ganglios basales 25, y órganos de los sentidos, incluyendo la cóclea 26. Basado en esto y la ubicación del aparato vestibular periférica adyacente a lacóclea (y el acceso clínico a la misma a través de la apófisis mastoides), es factible para sugerir que en el ser humano, la estimulación directa del epitelio sensorial vestibular se podría lograr a través de una pequeña fibra óptica provocada por un dispositivo externo - similar a un implante de cóclea 27 .
Varias condiciones pueden ser modificadas en el protocolo descrito anteriormente para adaptarse a los intereses del investigador. En primer lugar, la longitud de onda usada aquí (670 nm) se puede extender para incluir longitudes de onda más largas en el rango infrarrojo como se informó anteriormente en otros sistemas sensoriales y modelos animales. En segundo lugar, los regímenes de tratamiento también se pueden variar dependiendo de si a corto plazo o la respuesta a largo plazo es que se trate. Aquí se utilizó un régimen de tratamiento muy breve, pero esto podría ampliarse para duraciones más largas o más cortas duraciones incluso para medir la dinámica de los cambios inducidos NIR.
El principal reto de este protocolo es la de mantener la viabilidad del tejidodurante la extracción del tejido. Teniendo en cuenta el tiempo necesario para eliminar el laberinto óseo y extirpar el laberinto membranoso de ella, es fundamental para reducir la descomposición metabólica. Esto se logra mediante el baño del tejido en ACSF enfriado en hielo durante todo el procedimiento y perfundir esta solución de forma continua con carbógeno. Además, al final del procedimiento de disección, aún más la degradación del tejido se puede detener con el uso de nitrógeno líquido para congelar el tejido parpadeará extraído. En su caso, el tejido congelado puede ser descongelado y el ARNm se extrae para su posterior análisis genético.
Aunque los métodos descritos aquí no describen el impacto completo del tratamiento de la luz NIR en el metabolismo celular en el epitelio sensorial vestibular, una mayor aplicación de esta estrategia se puede modificar para incluir otros marcadores asociados con la edad de la función mitocondrial 28,29 y / o metabólica celular insultos tales como hipoxia 30. En última instancia, la capacidad para describir la vperfil metabólico celular estibular de un ratón individual permitirá que la investigación de las correlaciones entre el rendimiento de equilibrio y procesos subcelulares durante el envejecimiento, y el impacto de la terapéutica incluyendo tratamiento NIR.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Paul Witting y Genevieve Fong por su ayuda con la extracción de ARNm y PCR, y la Garnett Passe y Rodney Williams Memorial Fundación para el apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quantum WARP 10 | Quantum Devices | 2070N030-A | |
| Screw top microtubules | Quality Scientific Plastics | 520-GRD-Q | |
| Ketamine | Parnell, Alexandria Australia | ||
| Standard pattern scissors | FST | 14001-12 | |
| Carbon steel surgical blades #22 | Livingstone | SBLDCL 22 | |
| Friedman-Pearson rongeurs | FST | 16221-14 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | A60S | |
| Dumont #5 SF forceps | FST | 11252-00 | |
| Isolate II RNA Micro Kit | Bioline | BIO-52075 |
References
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