Summary
Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.
Abstract
Proteinstabilität beeinflusst viele Aspekte der Biologie und der Messung der Abstand Kinetik der Proteine können wichtige Einblicke in biologische Systeme. In FDAP Experimenten kann die Clearance von Proteinen in lebenden Organismen zu messen. Ein Protein von Interesse wird mit einem Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein markiert ist, ausgedrückt in vivo und Photokonversion und die Abnahme der photokonvertiertem Signals über die Zeit überwacht wird. Die Daten werden dann mit einem geeigneten Spaltmodell, um die Proteinhalbwertszeit zu bestimmen, ausgestattet. Wichtig ist, dass die Clearance-Kinetik der Proteinpopulationen in verschiedenen Kompartimenten des Organismus getrennt durch Anlegen compartmental Masken untersucht werden. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die intra- und extrazelluläre Halbwertszeiten von sekretierten Signalproteinen während Zebrabärblingentwicklung bestimmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für FDAP Experimente im Zebrafischembryonen. Es sollte möglich sein, FDAP verwenden, um den Abstand Kinetik bestimmenjede taggable Protein in jedem optisch zugänglich Organismus.
Introduction
Die Niveaus von Proteinen in Zellen und Organismen werden durch ihre Produktionsraten und Clearance bestimmt. Proteinhalbwertszeiten kann von Minuten bis Tagen 1-4 liegen. In vielen biologischen Systemen, die Stabilisierung oder Verrechnung von Schlüsselproteinen hat wichtige Auswirkungen auf die Zellaktivität. Modulation der intrazellulären Proteinstabilität ist für die Zellzyklusprogression 5,6, entwicklungsSignalisierungs 7-9, Apoptose 10, und die normale Funktion und Wartung der Neuronen 11,12 erforderlich. Extrazelluläre Proteinstabilität beeinflusst die Verteilung und Verfügbarkeit von sezernierten Proteinen, wie Morphogene 13,14, innerhalb eines Gewebes.
Im Laufe der letzten Jahrzehnte, die Proteinstabilität wurde vor allem in der Zellkultur mit radioaktivem Pulsmarkierung oder Cycloheximid Chase-Experimente 15 bewertet. In solchen Pulse-Chase-Experimente werden die Zellen entweder transient zu einem "Impuls" von radioaktiven Aminosäure ausgesetztSäurevorläufer, die in den neu synthetisierten Proteine eingebaut werden, oder sie können gegen Cycloheximid, das die Proteinsynthese hemmt, ausgesetzt sind. Die kultivierten Zellen werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und entweder Immunfällung, gefolgt von Autoradiographie (radioaktive Pulse-Chase-Experimente) oder Western Blot (in Cycloheximid Versuchen) wird verwendet, um die Clearance des Proteins über die Zeit quantifiziert.
Herkömmliche Proteinstabilität Tests haben mehrere Nachteile. Zuerst Proteine in diesen Assays werden häufig nicht in ihrer endogenen Umgebungen exprimiert, sondern in der Gewebekultur und manchmal in Zellen aus unterschiedlichen Spezies. Für Proteine, deren Stabilität ist kontextabhängig, ist dieser Ansatz problematisch. Zweitens ist es nicht möglich, Proteinclearance in einzelnen Zellen oder Organismen mit der Zeit zu folgen, und die Daten aus diesen Tests reflektiert ein Durchschnitt der verschiedenen Populationen von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten. Da einzelne Zellen begonnen habenmit unterschiedlichen Mengen an Eiweiß, kann die radioaktive Markierung oder Cycloheximid zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen wurden, oder können unterschiedliche Clearance-Kinetik, wie aggregierte Daten irreführend sein können. Schließlich wird in dem Fall von Cycloheximid Chase-Experimente, Zugabe der Proteinsynthese-Inhibitor kann unbeabsichtigte physiologischen Wirkungen, die Proteinstabilität 16-18 künstlich verändern könnten. Diese Mängel können mit Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP), eine Technik, die Photokonvertierbare Proteine zu Protein-Clearance dynamisch in lebenden Organismen 19-25 messen nutzt vermieden werden (siehe Diskussion für Beschränkungen des FDAP Technik).
Photokonvertierbare Proteine fluoreszierende Proteine, deren Anregungs- und Emissionseigenschaften zu ändern nach der Exposition auf bestimmte Wellenlängen des Lichts 26. Eine häufig verwendete Variante ist Dendra2, eine "grüne-to-rot" Photokonvertierbare Protein, das anfangs abZitat und Emissionseigenschaften ähnlich wie das grün fluoreszierende Proteine, aber nach der Einwirkung von UV-Licht- "Photo" -seine Anregungs- / Emissionseigenschaften werden ähnlich denen der rote fluoreszierende Proteine 23,27. Wichtig ist, dass neue Protein nach Photo erzeugt nicht denselben Anregungs- / Emissionseigenschaften wie die photokonvertiertem Proteins ermöglicht Entkoppelung der Produktion und Clearance auf Photo und Beobachtung von nur einem Pool von photokonvertiertem Protein. Kennzeichnen von interessierenden Proteine mit Photokonvertierbare Proteine stellt somit eine bequeme Möglichkeit, impuls Label Proteinen in intakten, optisch zugänglichen lebenden Organismen.
In FDAP Assays (Abbildung 1A) ist ein Protein von Interesse mit einem Photokonvertierbare Protein markiert und ausgedrückt in einem lebenden Organismus (1B). Das Fusionsprotein wird durch Photo, und die Abnahme der photokonvertiertem Signals über die Zeit ist durch fluorescen wachtence-Mikroskopie (Abbildung 1C). Die Daten werden dann mit einem geeigneten Modell angebracht, um die Halbwertszeit des Fusionsproteins (1D) zu bestimmen.
Die hier beschriebene FDAP Assay wurde entwickelt, um die extrazelluläre Halbwertszeiten von sekretierten Signalproteinen in Zebrafischembryos der frühen Embryogenese 19 bestimmen. Allerdings kann dieser Ansatz für jeden transparent Modellorganismus, die Live-Bildgebung toleriert, und könnte verwendet werden, um den Abstand von jedem taggable intrazelluläre oder extrazelluläre Protein zu überwachen angepasst werden. Variationen der hier beschriebenen Technik wurden in kultivierten Zellen 20,23 und Drosophila 22 und der Maus 21 Embryos durchgeführt.
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Protocol
1. Erstellen eines Photokonvertierbare Fusionskonstrukt und Spritzen dechorionated Zebrafischembryonen
- Erzeugen Sie eine funktionale Konstruktion des Proteins von Interesse zu einer grünen-to-rot Photokonvertierbare Protein (siehe Diskussion) fusioniert enthält, dann verwenden Sie in vitro-Transkription zur mRNA mit Cap erzeugen das Fusionsprotein kodiert, wie in Müller et al., 2012 19.
- Verwenden Pronase die Chorion von etwa 30 Zebrafischembryonen im Ein-Zell-Stadium zu entfernen. Alternativ manuell dechorionate Embryonen mit einer Pinzette 28.
Hinweis: Die Embryonen für spätere Bild dechorionated werden. Falls gewünscht, kann Embryos durch das Chorion später injiziert werden und dechorionated, nur vor der Bilderzeugung.- Machen Sie eine 5 mg / ml Stammlösung von Pronase aus Streptomyces griseus in Standard Zebrafischembryo Medium 19. Rock the Lösung vorsichtig bei Raumtemperatur für 10 Minuten, damit der Protease, sich aufzulösen. Aliquot 2 ml in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei -20 ° C.
- Transfer eines Zellstadium Embryonen zu einem Durchmesser von 5 cm Glas oder Agarose-beschichteten Kunststoffpetrischale mit ~ 8 ml Embryo Medium. 2 ml aufgetaute Pronase Stammlösung in die Schale und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 bis 10 min.
- Vermeiden Sie es, Embryonen, um Luft oder Kunststoff, wie Kontakt mit entweder verursacht dechorionated Embryonen zu Bruch. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit Embryo Medium. Transfer der Embryonen in den Becher durch Kippen der Petrischale beim Eintauchen in das Medium.
- Nachdem die Embryonen mit dem Boden des Becherglases angesiedelt, gießen Sie die meisten der Embryo Medium, dann gießen Sie frisch Embryo Medium in das Becherglas. Das milde Verwirbelung des Mediums Gießen in das Becherglas verursacht Embryonen, ihre geschwächten Chorion zu verlieren.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.4.
- Übertragen Sie die dechorionated Embryonen auf einem Agarose-beschichtetes Spritzgussschale 29 mit einer Glaspasteurpipette mit einer Riegelspitze. Lodernddie Pipettenspitze verhindert gezackten Kanten von Embryonen zu verletzen.
- Co-Injektion der mRNA und eine 3 kDa Alexa488-Dextran-Konjugat 29,30 (1B; siehe Diskussion für vorgeschlagen mRNA und Alexa488-Dextran Mengen). Injizieren direkt in der Mitte der Zelle (nicht das Eigelb) eine gleichmäßige Verteilung von mRNA und Fluoreszenzfarbstoff zu gewährleisten, wenn die Spaltung beginnt.
Anmerkung: Die Alexa488 Signal während der Datenanalyse verwendet werden, um Masken Kompartment um zwischen der intrazellulären und extrazellulären Fluoreszenz unterscheiden erzeugen. - Übertragungs injizierten Embryonen auf ein 1-2% Agarose-beschichtete Vertiefung einer Sechs-Well-Kunststoffschale mit Embryomedium gefüllt. Inkubation im Dunkeln bei 28 ° C bis Embryonen späten Sphäre Stufe 31 (ca. 5 Stunden nach der Befruchtung) erreicht. Überprüfen Embryonen jeglicher in 2 Stunden unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie jeglichen Schmutz von Embryonen, die gestorben sind, erzeugt.
2. Montage Zebrafischembryonen für Photoconversion und Imaging auf einem Inverted Konfokalmikroskop
- Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um 04.59 gesunde Embryonen zu identifizieren und mit einem Glas Pasteurpipette mit einer Riegelspitze, um sie aus der Schale zu entfernen.
- Vorsichtig die Embryonen in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 1 ml geschmolzen 1% niedrigschmelzender Agarose in 1x Danieau der Embryo Medium auswerfen (siehe Materialliste) (Abbildung 2A).
Anmerkung: Agarose sollte eine Temperatur zwischen 40 und 42 ° C haben; höheren Temperaturen könnte die Embryonen schädigen. - Zeichnen Sie die Embryonen wieder in die Pipette zusammen mit einigen Agarose. Vorsichtig werfen Sie die Agarose und Embryonen auf dem Deckglas eines Glasbodenschale (2B). Sicherzustellen, dass die Dicke des Deckglases mit dem Ziel auf dem Konfokalmikroskop kompatibel ist.
- Wiederverwenden Glaspipette, falls gewünscht. Um aus der Pipette reinigen Sie die restliche Agarose und Verstopfung, schnell Pipette Embryo Medium nach oben und unten zu verhindern.An der 15-ml-Röhrchen mit ~ 5 ml Embryomedium gefüllt neben dem Stereomikroskop für diesen Zweck.
- Verwenden Sie eine Metallsonde, um die Embryonen zu positionieren, so dass das Tier Pol (Blastoderm) dem Deckglas. Arbeiten Sie schnell, da die Agarose wird in 20-30 sec verfestigt. Verwenden Sie das Stereomikroskop der Embryonen Positionen überwachen und anpassen, bis das Agarose erhärtet.
- Die Schritte 2,1-2,4 bis die gewünschte Anzahl von Embryonen montiert wurde.
Hinweis: In einem typischen Experiment werden vier Tropfen Agarose mit je vier oder fünf Embryonen einfach auf dem Deckglas passen. Über 16 Embryonen während eines einzigen ideale Experiment (Abbildung 2C) abgebildet werden. - Beim Erstarren der Agarose, füllen die Glasbodenschale mit 1x Danieau der Embryo Medium.
3. Photoconverting und Messung der Abnahme des photokonvertiertem Signal
A 25X oder 40X Wasser Ziel is für die Größe und Brechungsindex von Zebrafischembryonen geeignet. Es ist am besten, um Immersionsöl mit dem gleichen Brechungsindex wie Wasser statt tatsächliche Wasser verwenden, da Wasser wird im Laufe der fünfstündigen Experiments verdampfen. Sicherzustellen, dass das Immersionsöl ist zur Verwendung mit einem Wasser (kein Öl) Ziel verwendet werden.
- Platzieren Sie einen großen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel, sicherzustellen, dass der Ölfilm zwischen Objektiv und Deckglas wird nicht wie die Bühne bewegt, um verschiedene Positionen Embryo während der Bildgebung zu brechen. Sicher stellen Sie den Glasbodenschale auf die Bühne, so dass das Gericht nicht zu verschieben, wenn die Bühne bewegt. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen beheizten Phase bei 28 ° C, die optimale Temperatur für die Zebrafisch-Entwicklung.
- Definieren Sie die Position jedes Embryo im Software-Paket des konfokalen Mikroskops. Stellen Sie die Z-Tiefe für jeden Embryo und versuchen, etwa in jedem Embryo Ziel in der gleichen Ebene.
Hinweis: Über 30 & mgr; m aus dem Tier Pol ist ein good Tiefe da in dieser Tiefe die Hüllschicht des Embryos vermieden wird Bildgebungsbereich maximiert wird, und die Lichtstreuung ist minimal. Eine einzelne optische Scheibe mit einer Dicke von ~ 3,3 um ausreichend Daten; es gibt keine Notwendigkeit, eine Z-Stapel (siehe Abschnitt 5) zu erwerben. - Sammeln Sie zwei Signale während des Experiments: die "grüne" Signal von der Alexa488-Dextran-Konjugat-die während der Datenanalyse verwendet werden, um extra- und intrazellulären Fluoreszenz-und die "rote" -Signal aus dem Fusionsprotein zu isolieren, nachdem es photokonvertiertem wird wird.
- Excite Alexa488 mit einem 488 nm Laser, und sammeln emittierte Fluoreszenz zwischen ca. 500 und 540 nm. Anmerkung: Nach Photo viele grün nach rot Photokonvertierbare Proteine (zB Dendra2) angeregt mit einem 543 nm Laser und Fluoreszenz emittieren zwischen ~ 550 und 650 nm. Passen Sie bei Bedarf auf der Grundlage der Photokonvertierbare Protein verwendet.
- Erwerben "pre-Photo"Bilder, und konfigurieren Sie die Software der konfokalen Mikroskop zur Bild jedem der zuvor festgelegten Positionen (aus Schritt 3.2) mit den entsprechenden Abbildungsbedingungen alle 10 oder 20 Minuten für ein Fünf-Stunden-Zeitverlauf (siehe Abschnitt 5 und Diskussion).
- Um das Fusionsprotein photoconvert zu einem 10X-Objektiv ein- und ausgesetzt werden Gruppen von Embryonen mit UV-Licht aus einer Quecksilberbogenlampe mit einer ~ 300-400 nm Anregungsfilter mit 100% Leistung für 2 min. Den Schwerpunkt entlang der z-Achse, um eine einheitliche Photo (siehe Abschnitt 5) zu fördern. Stellen Sie sicher, dass das Immersionsöl nicht auf die 10-fach Objektiv während der Photo tropfen.
Anmerkung: Die Verschiebung des Fokus während Photo könnte, um die Variabilität unter den Experimentatoren zu vermeiden automatisierbar. - Wechseln Sie wieder zu der 25X oder 40X-Objektiv sofort nach Photokonversion. Stellen Sie sicher, dass die zuvor definierten Positionen aus Schritt 3.2 sind noch genau. Wenn das Gericht während photoconv verschobenersion, re-definieren die Positionen der Embryonen.
- Start des Programms in Schritt 3.4 angelegt und ermöglichen Abbildungs für 5 h fortgesetzt. Die verstrichene Zeit zwischen den Photo und dem Beginn der Bildgebung für jeden Embryo verstrichen.
- Überprüfen Sie gelegentlich auf das Experiment. Überwachung des Umfangs Danieau-Medium und fügen Sie mehr, wenn nötig. Starten Sie die Software, wenn sie ins Stocken geraten ist.
- Um die Hintergrund-Fluoreszenz-Werte, die während der Datenanalyse verwendet, um die Asymptote der exponentiell abnehm Modells schätzen wird bestimmen, umfassen einige Embryonen, die mit Alexa488-Dextran nicht jedoch mRNA in dem Experiment injiziert wurden. Zur Ermittlung der Geräterauschen, das auch während der anschließenden Datenanalyse verwendet werden, erfassen eines Bildes in der Abwesenheit einer Probe.
4. Die Analyse der Daten mit Hilfe von PyFDAP
- Sichtprüfung der zeitliche Verlauf Datensätze von jedem Embryo. Entsorgen Sie Datensätze aus Embryonen, die bei imag gestorbention, die wesentlich verschoben, die sehr geringe Mengen an photokonvertiertem Signals haben, oder dass die Regionen von Zellen, die ungewöhnlich aussehen und stillstehen und Division (typisch verletzter oder kranker Embryonen) enthalten.
Hinweis: Gelegentlich, Blasen in der Immersionsöl oder andere Artefakte in ein oder zwei Bilder in einem ansonsten verwendbaren Datensatzes angezeigt. Beachten Sie alle Bilder, die Artefakte enthalten; sie werden später verworfen, und die verbleibenden Zeitpunkten von einer solchen Datensatzes immer noch untersucht werden. - Verwenden Sie den Python-basierte Softwarepaket PyFDAP die FDAP Daten analysieren. PyFDAP berechnet Halbwertszeit durch die Bestimmung der durchschnittlichen intrazellulären und extra rote Fluoreszenz-Intensität in jedem Bild und Anpassen der Daten mit einer exponentiell abnehmenden Funktion 56 (Abbildung 3).
- Laden Sie PyFDAP (siehe Materialliste).
- Verwenden PyFDAP zu trennen intra- und extrazellulären photokonvertiertem Signal (3A, B). Unse die Alexa488-Signal, das strikt intrazellulär ist, um eine intrazelluläre Maske erstellen. Wenden Sie diese Maske auf das entsprechende Bild Rot-Kanal, um intrazelluläre Pixel aus, die bei der Berechnung der extrazellulären durchschnittliche Intensität zu verhindern. Um durchschnittliche intrazellulären Intensität zu messen, drehen Sie die Maske.
- In PyFDAP, zeigen die maskierte Bilder in Schritt 4.2.2 erzeugt. Sichtprüfung der Bilder und entsorgen Datensätzen, in denen Masken nicht genau zu unterscheiden intrazellulären von extrazellulären Raum (dies sollte selten sein; beachten Sie, dass die Zellmembranen sind in Bilder, in dem extrazellulären Raum maskiert ist enthalten, aber sie konnten durch die Veränderung der Schwellen entfernt werden Algorithmus oder durch die Einführung einer Membranmaske (beispielsweise unter Verwendung von Membran-GFP)). Verwerfen auch alle Einzelbilder, die Artefakte (zB Blasen im Immersionsöl) in Schritt 4.1 identifiziert.
- Verwenden PyFDAP durchschnittlichen extra- und intrazellulären Fluoreszenzintensitäten für eac berechnenh Bild. PyFDAP berechnet diese Mittelwerte durch Summieren der Intensitäten der Bildpunkte, die außerhalb der Maske und Teilungs fallen durch die Gesamtzahl von Pixeln summiert.
- Montieren Sie die Fluoreszenzdaten (3C) mit folgender Exponentialfunktion:
wobei t die Zeit nach dem Photo, c (t) die Intensität bei einem bestimmten Wert von t ist, c 0 die Intensität bei t = 0, k die Clearance-Rate konstant ist und y 0 die Asymptote, das die Funktion nähert als Fluoreszenz abnimmt (Figur 1D). y 0 ist, können basierend auf den Messungen in Schritt 3.8 19 eingeschränkt werden. - Verwenden PyFDAP die extra- und intrazellulären Proteinhalbwertszeiten (τ) von den Freiraum Geschwindigkeitskonstanten (k) unter Verwendung der folgenden Beziehung berechnet:
5. Kontrolle Experimente zur Photobleaching, versehentliche Photokonversion, und Photo Uniformity Beurteilen
- Die Beurteilung Bleichen
Hinweis: Das Photobleichen könnte artifactual Abnahme der Fluoreszenzintensität, die die Bleicheigenschaften des fluoreszierenden Proteins neben der Clearance des Proteins von Interesse reflektiert verursachen.- Um mögliche Photobleaching zu bewerten, führen Sie eine Reihe von FDAP Experimente mit 10-Minuten-Intervallen zwischen Bildgebung und einen zweiten Satz mit 20-Minuten-Intervallen zwischen Bildgebung (Abbildung 4). Analysieren Sie die Daten aus beiden Versuchsreihen mit PyFDAP wie in Abschnitt 4 beschrieben.
- Vergleichen Sie die Halbwertszeiten von den 10 und 20 min Intervall Experimente. Längere Halbwertszeiten von 20 Minuten Intervall Versuche lassen eine erhebliche Bleichen. Wenn die Halbwertszeiten von beiden Versuchen identisch sind, Photobleaching ist kein signifikantes Problem.
- Alternativ zu bewerten Bleichen durch den Erwerb einer Reihe von ~ 30 Bilder sofort nach Photokonversion. Eine signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität zeigt signifikante Photobleichen.
- Wenn Ausbleichen erkannt wird, verwenden Sie eine niedrigere Laserleistung, Belichtungszeit zu verringern, oder verwenden Sie eine photo Photokonvertierbare Protein 32.
- Die Beurteilung unbeabsichtigte Photokonversion.
Hinweis: Dendra2 kann mit 488 nm Beleuchtung 27 photokonvertiertem werden. Bei Anregung Alexa488 mit 488-nm-Laser, wie in Schritt 3.3.1 unbeabsichtigte Photo und damit einer artifactual Zunahme der scheinbaren Halbwertszeit des Proteins von Interesse beschrieben möglich. Allerdings haben wir und andere 33 festgestellt, dass 488 nm Beleuchtung ist eine ineffiziente Methode der Photokonversion in Zebrafischembryonen.- Verwenden Sie die in Schritt 5.1.1 Kontrollexperiment, um eine versehentliche Photo erkennen. Vergleichen Sie die Halbwertszeiten von den 10 und 20 min Intervall Experimente. Kürzere Halbwertszeiten von 20 Minuten Intervall Experimente zeigen wesentliche unbeabsichtigte Photokonversion. Wenn die Halbwertszeiten von beiden Experimenten identisch sind, ist eine versehentliche Photo relativ wirkungslos.
- Falls versehentlichen Photo erkannt wird, verwenden Sie eine niedrigere 488 nm Laserleistung und kürzere Aufnahmezeiten zu vermeiden, versehentlich photoconverting Dendra2.
- Die Beurteilung Photo Uniformität.
Hinweis: Wenn Photo zu der animalen Pol des Embryos vorgespannt ist, wird die Abnahme der Fluoreszenz, die durch Proteindiffusion oder Zellbewegung in tiefere Ebenen (5A) beeinflusst werden.- Um festzustellen, ob Photo gleichmäßig ist, drücken eine abgesondert Photokonvertierbare Protein (für Experimente mit extrazellulären Fusionsproteine) oder eine cytoplasmatische Photokonvertierbare Protein (für Experimente mit intrazellulären Fusionsproteine). Photoconvert wie üblich, tHenne erwerben ein Z-Stapel umfasst die meisten der Blastoderm alle 20 min für 80 min.
- Wenn Photo zu der animalen Pol vorgespannt ist, wird die Fluoreszenzintensität in den tieferen Ebenen der Zeit aufgrund von Diffusion oder Bewegung der Zellen (5B) zu erhöhen. Wenn ungleichmäßige Photo erkannt wird, konzentrieren sich tiefer in die Embryonen während der Photokonversion.
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Representative Results
FDAP verwendet worden, um die Halbwertszeiten von extrazellulärer Signalproteine in Zebrafischembryos 19 bestimmen. Eines dieser Proteine, Schielen, induziert die Expression von Genen während der Embryogenese mesendodermal 34. Schielen-Dendra2 aktiviert die Expression von Genen mesendodermal auf einem ähnlichen Niveau untagged Schielen, wie qRT-PCR und in situ-Hybridisierungsassays 19 demonstriert. Die Embryonen wurden mit Alexa488-Dextran und mRNA Schiel Dendra2 und auf die FDAP Test unterzogen zusammen injiziert. Eine Verringerung in der extrazellulären photokonvertiertem Signalintensität über der Zeit ist ersichtlich (4A). Die extrazelluläre Intensitätsprofile von 23 Embryonen wurden mit PyFDAP erzeugt. Die erhaltenen Daten wurden in PyFDAP mit einer ersten Ordnung Clearance-Kinetik Modells angepasst und durchschnittliche lichte Geschwindigkeitskonstante k von 1,00 x 10 -4 / sec, was einer durchschnittlichen Halbwertszeit τ von 116 min wurde bestimmt. Ähnliche Intensitätsprofils und Clearance-Rate Konstanten wurden erhalten, wenn die Abstände zwischen Abbildungs wurden 10 oder 20 Minuten, was darauf hindeutet, dass Bleichen oder unbeabsichtigte Photo nicht signifikant zur Intensitätsänderungen (4B).
Abbildung 1. Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP) Übersicht. (A) Arbeitsablauf eines FDAP Experiment. (B) Die Injektion von mRNA und ein Fluoreszenzfarbstoff in eine Zebrafisch-Embryos im Einzell-Stadium. Protein aus der mRNA hergestellt, wie der Embryo entwickelt sich über etwa 5 Stunden vor der Bildgebung. Der Farbstoff markiert Zellen (grüne Kreise). (C) Das Fusionsprotein wird mit einem UV-Puls photokonvertiertem, und die Abnahme der Intensität des photokonvertiertem Signals über die Zeit überwacht wird. (D) Die Daten werden mit einem exponentiell abnehm ausgestattet Funktion, um Freiraum Geschwindigkeitskonstanten (k) und Halbwertszeiten (τ) zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Montage Zebrafischembryonen für FDAP Experimenten. (A) Zebrafisch-Embryonen (blastoderm = weiß, Eigelb = schwarz) von Embryo-Medium (blau) in Agarose geschmolzen (gelb) übergeben. (B) Die Embryonen und Agarose werden auf das Deckglas eine Glasbodenschale gelegt. Embryos werden dann manuell positioniert, so daß das Tier den Polflächen des Deckglases. Ein Querschnitt einer Glasbodenschale gezeigt. (C) Schematische Darstellung eines Glasbodenschale mit mehreren Agarose Tropfen mit vier Embryonen jeweils (Blick nach unten in die Schüssel).w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Datenanalyse mit PyFDAP. (A) PyFDAP verwendet die Otsu Schwellenalgorithmus 35, um intra- und extrazellulären Masken aus der intrazellulären Signal Alexa488 (grün) zu generieren. (B) photokonvertiertem (rot) aus einem Embryo ein abgesondert Dendra2 Fusionsprotein (Schielen-Dendra2 19) abzugeben. Durchschnittliche extra- und intrazellulärer Fluoreszenz-Intensitäten wurden mit den in (A) gezeigt Masken berechnet. Der Raum außerhalb des Embryos aus diesen Berechnungen durch Verwerfen Pixel außerhalb des gelben Kreis ausgeschlossen. (C) PyFDAP Screenshot Anzeige extrazellulären Intensitätsdaten von einem FDAP Experiment (schwarz cirzeuge) mit einer exponentiell abnehmende Funktion (rot gestrichelte Linie) ausgestattet. Die extrazelluläre Halbwertszeit wird durch den roten Pfeil gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse FDAP. (A) Ein Vertreter Embryo exprimieren abgesondert Schiel Dendra2 kurz vor der Photokonversion (ganz links) und 27, 87 und 287 min nach Photokonversion. (B) Um Photobleaching und unbeabsichtigte Photo (siehe Abschnitt 5) zu steuern, wurden Experimente mit 10 oder 20 Minuten-Intervallen durchgeführt (Daten von Müller et al., 2012, 19). In PyFDAP wurden extrazelluläre Intensitätsprofile erzeugt werden, mit exponentiell abnehmenden Funktionen ausgestattet, und durch subtrac normalisiertting die Einbau y 0 Wert von jedem Datenpunkt und Teilen von der Einbau c 0 Wert. Daten von der 10 min (schwarz, n = 11) und 20 min (blau, n = 12) Intervall Experimente wurden dann gemittelt sind. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Bewertung Photo Uniformität. (A) ungleichmäßige Photo einer extrazellulären Protein kann zu einer falsch kurzen scheinbare Halbwertszeit führen, wenn photokonvertiertem Protein diffundiert in tieferen Ebenen im Laufe der Zeit. (B) zu bestimmen, ob Photo gleichmäßig ist, eine Z-Stapel für die meisten des Blastoderms wird zu verschiedenen Zeitpunkten nach der erworbenen photoconversIonen. Die Fluoreszenzintensität wird in tieferen Ebenen im Laufe der Zeit zu erhöhen, wenn Photo war ungleichmäßige (beachten Sie, dass die Lichtstreuung bewirkt tiefere Ebenen dunkler als höheren Ebenen zu erscheinen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Der Erfolg einer FDAP Experiments beruht auf der Erzeugung eines funktionellen Photokonvertierbare Fusionsprotein. Markierung eines Proteins kann seine biologische Aktivität und / oder biophysikalischen Eigenschaften, einschließlich der Lokalisierung, Löslichkeit und Stabilität 36-41 betreffen. Werden hergestellt, um die Aktivität von mehreren verschiedenen Fusionskonstrukte zu testen, um eine, die aktiv ist, zu finden. Wir haben festgestellt, dass eine Änderung der Position des Photokonvertierbare Protein relativ zu dem interessierenden Protein oder mit längeren Linkern (zB unter Verwendung der Aminosäuresequenz LGDPPVAT 19) kann die Aktivität des Fusionsproteins steigern. Im Falle von Signalproteinen, kann die Aktivität des Fusionsproteins durch Testen ihrer Fähigkeit, die Expression von Zielgenen zu induzieren 19 bestimmt werden. qRT-PCR und in situ Hybridisierung eine gute Positionsanzeigen der Zielgenexpression 19. Beachten Sie, dass die hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, die Stabilität von Proteinen zu bestimmen,in der frühen Zebrafischembryo und würde geändert werden müssen, um die Proteinstabilität in anderen Zusammenhängen zu bewerten.
Die grün-nach-Rot Photokonvertierbare Protein Dendra2 27 erfolgreich im Zebrafisch FDAP Experimente 19 (Abbildung 4) verwendet, aber andere Optionen sind verfügbar 26,42. Um potentielle Artefakte aufgrund der Aggregation des Fusionsproteins zu vermeiden, wählen eine monomere Photokonvertierbare Protein. Photoaktivierbare Proteine können auch in Assays verwendet werden FDAP 20-22,26.
Vor Durchführung FDAP Experiment mehrere Aspekte des Protokolls müssen optimiert werden. Spritzen Sie unterschiedliche Mengen an mRNA, die niedrigste Menge, die nach Photokonversion nutzbare Signal liefert zu bestimmen; ~ 50 pg mRNA ist ein guter Ausgangswert. Um aussagekräftige Kompartment-Masken zu erzeugen (Bild 3), die Alexa488 Signal muss hell genug seinkonkurrieren mit dem Signal von dem nicht photokonvertiertem Fusionsprotein, das ständig von der injizierten mRNA produziert wird; injizieren zwischen 0,2 und 4 ng Alexa488-Dextran, um die optimale Menge an fluoreszierendem Farbstoff finden. Finden Sie die optimale Post-Konvertierungs-Bildgebungsbedingungen und die gleichen Bedingungen für alle Experimente mit einem bestimmten Konstrukt. Verwenden Sie gute quantitative Bildgebung praktiziert 43, und wählen Sie einen geeigneten Dynamikbereich, um gesättigte Pixel im roten Kanal zu vermeiden. Ermitteln Sie die passende Bildintervall für jedes Fusionsprotein. Proteine mit sehr kurzer Halbwertszeiten kann eine häufigere Bildgebung über eine kürzere Gesamtzeit erfordern. Zur Herstellung der optimalen Phototechnik, die auf den Organismus und Photokonvertierbare Proteins verwendet. Wir beschreiben eine robuste Photoverfahren unter Verwendung einer Quecksilberbogenlampe in Schritt 3.5, aber Dendra2 kann auch mit einer 405 33 oder 488-nm-Laser 27 photokonvertiertem werden.
Eine limitation dieser FDAP Protokolls ist, dass die Überexpression des Proteins von Interesse erforderlich ist. Die Überexpression konnte die Proteinstabilität beeinflussen, beispielsweise durch abnormale Expression anderer Gene, die Clearance-Kinetik 14,44 des Proteins zu verändern. Wenn das Protein von Interesse ein Signalmolekül, betrachten die Durchführung von Experimenten in Gegenwart eines Signalisierungs Inhibitor zu bestimmen, ob Blockieren Expression von Zielgenen beeinflusst Proteinstabilität. In der Zukunft kann es möglich sein, transgene Embryonen exprimiert Photokonvertierbare Fusionen unter der Kontrolle der endogenen Expressionselemente 45-50 zu erzeugen. Wenn transgene Embryonen ausreichende Signal sind FDAP Experimenten in einem nichtExpression Zusammenhang denkbar, etwa mit Hilfe von Licht-Blatt Mikroskopie Fluoreszenz Abnahme im gesamten Embryo 51 beobachten.
Mögliche weitere Anwendungen FDAP umfassen die Untersuchung der Mechanismen that regulieren Proteinstabilität durch die Untersuchung der Wirkungen verschiedener Störungen (zB Expression putative Proteasen) oder Proteinmodifikationen (zB Phosphorylierung) auf die Stabilität. Beispielsweise können die Faktoren, die die extrazelluläre Stabilität Schielen sind derzeit nicht bekannt. Viele sezernierte Entwicklungssignale durch Zellen 52-55, die zur Clearance von Schielen und anderen Liganden aus dem extrazellulären Raum beitragen könnten internalisiert. FDAP Experimente, in denen Internalisierung ist blockiert möglicherweise Informationen über Mechanismen, die extrazelluläre Proteinfreiheit bieten.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Tests zur Messung der Proteinstabilität 15 bietet FDAP eine Mikroskopie-basierte Alternative, bei der der Abstand von Proteinen kann im Laufe der Zeit in lebenden Organismen beobachtet werden. Es wurden ähnliche Verfahren verwendet werden, um Proteinfreiheit in anderen als Zebrafischembryonen Modellsysteme überwachen 20-23. Diese FDAP Protokoll hat das Potenzial, angepasst ist, die Halbwertszeit von jeder taggable Protein in biologischen Systemen, bei denen Echtzeit-Bildgebung durchführbar zu bestimmen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Jeffrey Farrell, James Gagnon, und Jennifer Bergmann für Kommentare zum Manuskript danken. KWR wurde von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship-Programm bei der Entwicklung des FDAP Test unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH, um AFS und durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy Noether-Programm), das Max-Planck-Gesellschaft und des Human Frontier Science Program (Career Development Award) an PM unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Life Technologies | AM1340 | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | |
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage |
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use |
| Glass Pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos |
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 |
| 15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium | BD Falcon | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | |
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25X or 40X water objective | Objective for imaging | ||
| 10X air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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