Summary
Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.
Abstract
Eiwitstabiliteit invloed op vele aspecten van de biologie, en het meten van de klaringskinetiek van eiwitten kan belangrijke inzichten verschaffen in biologische systemen. In FDAP experimenten, kan de klaring van eiwitten in levende organismen worden gemeten. Een eiwit van belang wordt gelabeld met een photoconvertible fluorescent eiwit expressie in vivo en photoconverted, en de daling van de photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd. De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt klaringsmodel de halfwaardetijd van het eiwit te bepalen. Belangrijk is dat de klaringskinetiek eiwit populaties in verschillende compartimenten van het organisme worden afzonderlijk door toepassing compartimentele maskers onderzocht. Deze benadering is gebruikt om de intra- en extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten bepaalt gedurende ontwikkeling van de zebravis. We beschrijven hier een protocol voor FDAP experimenten in de zebravis embryo's. Het moet mogelijk zijn om FDAP om de kinetiek van de klaring bepalenelke taggable eiwit in elk optisch toegankelijke organisme.
Introduction
De niveaus van proteïnen in cellen en organismen worden bepaald door de productiesnelheden en klaring. Eiwit halfwaardetijden kan variëren van enkele minuten tot dagen 1-4. In veel biologische systemen, de stabilisatie of klaring van belangrijke eiwitten heeft belangrijke gevolgen voor de cellulaire activiteit. Modulatie van intracellulair eiwit stabiliteit vereist voor celcyclusprogressie 5,6, ontwikkelings signalering 7-9, apoptose 10 en normale functie en onderhoud van neuronen 11,12. Extracellulaire proteïne stabiliteit beïnvloedt de verdeling en de beschikbaarheid van uitgescheiden eiwitten zoals morfogenen 13,14 binnen een weefsel.
In de afgelopen decennia heeft eiwitstabiliteit vooral beoordeeld in celkweek met behulp van radioactieve pulse-labeling of cycloheximide chase experimenten 15. In dergelijke pulse-chase experimenten worden cellen hetzij tijdelijk blootgesteld aan een "puls" van radioactieve aminozuurvoorlopers die zijn opgenomen in nieuw gesynthetiseerde eiwitten of ze worden blootgesteld aan cycloheximide, die eiwitsynthese remt. Gekweekte cellen worden dan verzameld op verschillende tijdstippen, en hetzij immunoprecipitatie gevolgd door autoradiografie (radioactieve pulse-chase experimenten) of western blotting (in cycloheximide experimenten) wordt gebruikt om de klaring van eiwit kwantificeren tijd.
Conventionele eiwitstabiliteit assays meerdere tekortkomingen. Eerst eiwitten in deze assays worden vaak niet uitgedrukt in hun endogene omgevingen, maar in weefselkweek en soms van verschillende species. Voor eiwitten waarvan de stabiliteit is contextafhankelijk deze benadering problematisch. Ten tweede is het niet mogelijk om eiwitten speling in individuele cellen of organismen te volgen in de tijd en de gegevens van deze testen geeft een gemiddelde van verschillende populaties van cellen op verschillende tijdstippen. Aangezien individuele cellen kan zijn begonnenmet verschillende hoeveelheden eiwit, mogen hebben de radioactieve merker of cycloheximide op verschillende tijdstippen, of kunnen verschillend klaringskinetiek, zoals geaggregeerde gegevens misleidend kunnen zijn. Tenslotte, bij cycloheximide chase experimenten toevoeging van de eiwitsyntheseremmer kan onbedoelde fysiologische effecten die kunstmatig eiwit stabiliteit 16-18 kunnen veranderen hebben. Deze gebreken kunnen worden vermeden door gebruik fluorescentievervaltijd Na Photoconversion (FDAP), een techniek die gebruik maakt photoconvertible eiwitten proteïne klaring dynamisch meten levende organismen 19-25 (zie bespreking beperkingen van de FDAP techniek).
Photoconvertible eiwitten zijn fluorescerende eiwitten waarvan excitatie en emissie-eigenschappen veranderen na blootstelling aan specifieke golflengten van het licht 26. Een vaak gebruikte variant is Dendra2, een "groen-to-rode" photoconvertible eiwit dat in eerste instantie heeft excitatie en emissie eigenschappen vergelijkbaar groen fluorescerende eiwitten, maar na blootstelling aan UV licht- "fotoconversie" -haar excitatie- / emissie-eigenschappen worden vergelijkbaar met die van rode fluorescente proteïnen 23,27. Belangrijk is dat nieuwe eiwit geproduceerd na photoconversion niet hetzelfde excitatie / emissie-eigenschappen als de photoconverted eiwit, waardoor ontkoppeling van de productie en de klaring na photoconversion en observatie van slechts een pool van photoconverted eiwit. Tagging eiwitten van belang met photoconvertible eiwitten biedt dus een handige manier om de pulse-label eiwitten in intacte, optisch toegankelijke levende organismen.
In FDAP assays (figuur 1A), is een eiwit van belang gelabeld met een photoconvertible eiwit en uitgedrukt in een levend organisme (Figuur 1B). Het fusie-eiwit wordt photoconverted en de daling photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd door fluorescence microscopie (figuur 1C). De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt model om de halfwaardetijd van het fusie-eiwit (figuur 1D) te bepalen.
De FDAP assay beschreven is ontworpen om het extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten in zebravisembryo bepalen tijdens de vroege embryogenese 19. Echter, kan deze benadering worden aangepast aan elke transparante modelorganisme dat live beeldvorming tolereert, en kunnen worden gebruikt om de klaring van taggable intracellulair of extracellulair eiwit controleren. Variaties van de hier beschreven techniek zijn uitgevoerd in gekweekte cellen 20,23 en Drosophila 22 en muis 21 embryo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het genereren van een photoconvertible Fusion Construct en het injecteren van dechorionated zebravis embryo's
- Genereer een functionele construct dat het eiwit van interesse gefuseerd aan een groen naar rood photoconvertible eiwit (zie bespreking), vervolgens in vitro transcriptie capped mRNA genereren coderend voor het fusie-eiwit volgens Muller et al., 2012 19.
- Gebruik pronase de chorions ongeveer 30 zebravis embryo verwijderen aan het ene-cellig stadium. Als alternatief handmatig dechorionate embryo's met behulp van een tang 28.
Opmerking: Embryo's moeten worden dechorionated voor latere beeldvorming. Desgewenst kan embryo later worden geïnjecteerd door het chorion en dechorionated, vlak voor beeldvorming.- Voeg een 5 mg / ml voorraadoplossing van pronase van Streptomyces griseus in standaard zebravis embryo medium 19. Schommel de oplossing voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 10 min om het protease te lossen. Aliquot 2 ml in microcentrifugebuizen en bevriezen bij -20 ° C.
- Overdracht één-cel embryo's van een glas 5 cm diameter of agarose gecoate plastic petrischaal met ~ 8 ml embryo medium. Voeg 2 ml ontdooide pronase voorraadoplossing om de schotel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 10 min.
- Vermijd blootstelling van embryo's aan lucht of plastic, zoals contact met ofwel zal veroorzaken dechorionated embryo's te scheuren. Vul een 200 ml bekerglas met embryo medium. Breng het embryo aan de beker door het kantelen van de petrischaal terwijl het onder te dompelen in het medium.
- Nadat de embryo's zich hebben gevestigd op de bodem van de beker, giet het grootste deel van het embryo medium, en giet dan verse embryo medium in de beker. De milde wervelende van het medium gieten in de beker zorgt ervoor dat de embryo's om hun verzwakte chorions verliezen.
- Herhaal stap 1.2.4.
- Breng de dechorionated embryo tot een agarose gecoate injectie schaal 29 met een glazen Pasteur pipet met een gevlamde tip. Vlammendede pipet tip voorkomt dat de scherpe randen van het verwonden van embryo's.
- Co-injecteren het mRNA en een 3 kDa Alexa488-dextranconjugaat 29,30 (Figuur 1B; zie bespreking voor suggereerde mRNA en Alexa488-dextran bedragen). Injecteer direct in het midden van de cel (niet de dooier) een gelijkmatige verdeling van mRNA en fluorescente kleurstof waarborgen eenmaal splitsing begint.
Opmerking: De Alexa488 signaal wordt gebruikt tijdens gegevensanalyse compartimentele maskers te genereren voor het onderscheid tussen intracellulair en extracellulair fluorescentie. - Transfer geïnjecteerde embryo tot een 1-2%-agarose gecoate putje van een zes-en kunststof schotel gevuld met embryo medium. Incubeer in het donker bij 28 ° C tot embryo's laat bol stadium 31 (ongeveer 5 uur na de bevruchting) hebben bereikt. Controleer embryo's om de een tot 2 uur onder een stereomicroscoop en verwijder eventueel vuil gegenereerd door embryo's die zijn overleden.
2. Montage zebravis embryo's voor Photoconversion en Imaging op een omgekeerde confocale microscoop
- Gebruik een stereomicroscoop om 04:59 gezonde embryo's te identificeren, en gebruik een glas Pasteur pipet met een gevlamde tip om ze van het gerecht te verwijderen.
- Uitwerpen zachtjes de embryo's in een microcentrifugebuis met ~ 1 ml gesmolten 1% laag smeltpunt agarose in 1x Danieau's embryo medium (zie Materials List) (Figuur 2A).
Opmerking: Agarose moet een temperatuur hebben tussen 40 en 42 ° C; hogere temperaturen kan het embryo beschadigen. - Trek de embryo's terug in de pipet samen met enkele agarose. Uitwerpen zachtjes de agarose en embryo's op de cover glas van een glazen bodem schaal (figuur 2B). Zorg ervoor dat de dikte van het dekglas verenigbaar is met de doelstelling van de confocale microscoop.
- Hergebruik de glazen pipet indien gewenst. De resterende agarose schoon van de pipet en verstopping snel pipet embryo medium voorkomen en neer.Plaats een 15 ml buis gevuld met ~ 5 ml embryo medium naast de stereomicroscoop voor dit doel.
- Met een metalen sonde naar de embryo positioneren zodat de animale pool (blastoderm) naar het dekglas. Werk snel, omdat de agarose zal stollen in 20-30 sec. Gebruik de stereomicroscoop de standpunten van de embryo's te monitoren en stel zo nodig tot de agarose verhardt.
- Herhaal stap 2,1-2,4 totdat het gewenste aantal embryo is gemonteerd.
Opmerking: In een typisch experiment zullen vier agarose druppels met vier of vijf embryo elke passen gemakkelijk op de cover glas. Ongeveer 16 embryo's kunnen worden afgebeeld tijdens een ideaal experiment (figuur 2C). - Wanneer de agar is gestold, vul de glazen bodem schotel met 1x Danieau's embryo medium.
3. Photoconverting en meten van de Daling van de photoconverted Signal
Een 25X of 40X water objectieve is geschikt voor de grootte en de brekingsindex van zebravis embryo. Het beste is om immersie olie te gebruiken met dezelfde brekingsindex als water dan de werkelijke water, omdat water verdampt tijdens de vijf uur durende experiment. Zorg ervoor dat de immersie olie is ontworpen om gebruikt te worden met een water (geen olie) doelstelling.
- Zet een grote druppel immersie olie op de doelstelling dat de oliefilm tussen de objectieve en dekglas niet zal breken in de fase verplaatst naar verschillende posities embryo tijdens de beeldvorming. Veilig plaats de glazen bodem schotel op het podium, zodat het gerecht niet zal verschuiven wanneer het podium beweegt. Indien mogelijk een verwarmde fase bij 28 ° C, de optimale temperatuur voor ontwikkeling van de zebravis.
- Definieer de positie van elk embryo's in de confocale microscoop softwarepakket. Stel de z-diepte voor elk embryo, en proberen om ruwweg richten hetzelfde vlak in elk embryo.
Opmerking: ongeveer 30 micrometer van het dier paal is een good diepte omdat op deze diepte de omhullende laag van het embryo kan worden vermeden, wordt beeldgebied gemaximaliseerd en lichtverstrooiing minimaal is. Een enkele optische schijfje met een dikte van ~ 3,3 micrometer voldoende gegevens; er is geen noodzaak om een z-stack (zie hoofdstuk 5) verwerven. - Verzamel twee signalen tijdens het experiment de "green" signaal van de Alexa488-dextran conjugaat die wordt gebruikt tijdens gegevensanalyse extracellulaire en intracellulaire fluorescentie en de "rode" signaal van het fusie-eiwit isolaat na het photoconverted.
- Excite Alexa488 met behulp van een 488 nm laser, en het verzamelen van uitgezonden fluorescentie tussen ~ 500 en 540 nm. Let op: Na photoconversion, veel groen-op-rood photoconvertible eiwitten (bijvoorbeeld Dendra2) kan enthousiast met een 543 nm laser zijn en uitstralen fluorescentie tussen ~ 550 en 650 nm. Pas als nodig is gebaseerd op de photoconvertible eiwit gebruikt.
- Acquire "pre-photoconversion"Beelden, en elk van de eerder gedefinieerde posities (van stap 3.2) met de juiste beeldvorming voorwaarden configureren van software van de confocale microscoop om het elke 10 of 20 minuten voor een vijf uur durende tijdsverloop (zie hoofdstuk 5 en Bespreking).
- Om het fusie-eiwit photoconvert, overschakelen naar een 10x objectief en bloot groepen van embryo's aan UV-licht van een kwik booglamp met een ~ 300-400 nm excitatie filter bij 100% output voor 2 min. Verschuiven de focus langs de z-as naar uniforme photoconversion (zie hoofdstuk 5) te bevorderen. Zorg ervoor dat de immersie olie druipt niet op de 10x objectief tijdens photoconversion.
Opmerking: De verschuiving van de focus tijdens photoconversion kon worden geautomatiseerd om de variatie tussen onderzoekers te vermijden. - Ga terug naar de 25X of 40X objectief onmiddellijk na photoconversion. Zorg ervoor dat de eerder gedefinieerde posities uit stap 3.2 zijn nog nauwkeurig. Als de schaal verschoven tijdens photoconversie, opnieuw definiëren van de posities van de embryo's.
- Start het programma gemaakt in stap 3.4 en laat beeldvorming te blijven gedurende 5 uur. Noteer de tijd tussen fotoconversie en de start van beeldvorming voor elk embryo.
- Af en toe controleren op het experiment. Toezicht op het niveau van Danieau's medium en voeg zo nodig meer. Start de software als het tot stilstand is gekomen.
- Om de achtergrond fluorescentie waarden die zullen worden tijdens data-analyse te schatten asymptoot van een exponentieel afnemende model te bepalen, omvatten enkele embryo's die zijn geïnjecteerd met Alexa488-dextran maar niet mRNA in het experiment. Om het instrument ruis, die ook zullen worden tijdens gegevensanalyse bepalen verwerven afbeelding in afwezigheid van een monster.
4. Het analyseren van de gegevens met behulp PyFDAP
- Visueel te inspecteren het tijdsverloop datasets van elk embryo. Gooi datasets uit embryo's die stierven tijdens IMAGing, die aanzienlijk verschoven, dat zeer lage niveaus van photoconverted signaal hebben, of dat de regio's van de cellen die ongebruikelijk kijken en zijn gestopt met bewegen en te delen (typisch van gewonde of zieke embryo's) bevatten.
Opmerking: Af en toe, bellen in de immersie olie of andere artefacten zal verschijnen in een of twee afbeeldingen in een anders bruikbare dataset. Noteer alle beelden die artefacten bevatten; zij zullen later worden weggegooid, en de resterende tijdstippen van dergelijke data set kan nog worden geanalyseerd. - Gebruik de Python-based softwarepakket PyFDAP de FDAP gegevens te analyseren. PyFDAP berekent halfwaardetijden door bepaling van de gemiddelde intracellulaire en extracellulaire rode fluorescentie-intensiteit in elk beeld en aanbrengen gegevens met een exponentieel afnemende functie 56 (figuur 3).
- Download PyFDAP (zie Materialen List).
- Gebruik PyFDAP intracellulaire en extracellulaire photoconverted signaal (figuur 3A, B) te scheiden. Onse de Alexa488 signaal, dat is strikt intracellulaire, om een intracellulaire masker te creëren. Breng dit masker aan overeenkomstige afbeelding van de rode kanaal om te voorkomen dat intracellulaire pixels overweging wordt genomen bij het berekenen van de gemiddelde extracellulaire intensiteit. Om gemiddelde intracellulaire intensiteit te meten, inverteren het masker.
- In PyFDAP, geven de gemaskerde beelden gegenereerd in stap 4.2.2. Visueel te inspecteren deze beelden en gooi datasets waarin maskers niet nauwkeurig intracellulaire van extracellulaire ruimte (dit moet zeldzaam zijn te onderscheiden; er rekening mee dat de celmembranen worden opgenomen in beelden waarin extracellulaire ruimte is gemaskeerd, maar ze konden worden verwijderd door het veranderen van de drempelwaarden algoritme of door de invoering van een membraan masker (bijvoorbeeld met behulp van membraan-GVB)). Ook gooi een enkele afbeeldingen met artefacten (bijvoorbeeld, bellen in de immersie olie) die in stap 4.1.
- Gebruik PyFDAP gemiddelde extracellulaire en intracellulaire fluorescentie-intensiteiten voor eac berekenenh afbeelding. PyFDAP berekent deze gemiddelden door optelling van de intensiteiten van pixels die buiten het masker en delen vallen door het totale aantal pixels opgeteld.
- Breng de fluorescentie data (Figuur 3C) met de volgende exponentiële functie:
waarin t de tijd na photoconversion c (t) intensiteit bij een bepaalde waarde van t, c 0 is de intensiteit bij t = 0, k de klaringssnelheid constant en y 0 is de asymptoot dat de functie benadert fluorescentie daalt (figuur 1D). y 0 kan worden beperkt op basis van de metingen in stap 3.8 19. - Gebruik PyFDAP aan de extracellulaire en intracellulaire eiwit halfwaardetijden (τ) van de klaring snelheidsconstanten (k) met de volgende relatie te berekenen:
5. controle-experimenten om te beoordelen Fotobleken, Onbedoelde Photoconversion en Photoconversion Uniformiteit
- Het beoordelen photobleaching
Opmerking: Fotobleken kan een artefact afname in fluorescentie intensiteit die de blekende eigenschappen van het fluorescente eiwit in aanvulling op de goedkeuring van het eiwit van interesse weergeeft veroorzaken.- Om mogelijke photobleaching beoordelen, voert u een set van FDAP experimenten met 10 min intervallen tussen beeldvorming en een tweede set met 20 min intervallen tussen beeldvorming (figuur 4). Analyseer de gegevens van beide sets van experimenten met PyFDAP zoals beschreven in hoofdstuk 4.
- Vergelijk het half-leven van de 10 en 20 min interval experimenten. Langere halfwaardetijden van 20 min interval experimenten wijzen op een significante fotobleking. Als de halfwaardetijd van beide experimenten zijn identiek, photobleaching is niet een belangrijke zorg.
- Als alternatief beoordelen photobleaching door het verwerven van een reeks van ~ 30 beelden direct na photoconversion. Een significante afname in fluorescentie-intensiteit geeft duidelijk fotobleken.
- Als photobleaching wordt gedetecteerd, gebruiken lagere laservermogen, verlagen beeldvorming tijd, of overwegen om een meer fotostabiel photoconvertible eiwit 32.
- Het beoordelen van onbedoelde photoconversion.
Opmerking: Dendra2 kan worden photoconverted behulp van 488 nm verlichting 27. Wanneer spannend Alexa488 de 488 nm laser zoals beschreven in stap 3.3.1, onbedoelde fotoconversie en dus een kunstmatig verhoging van de halfwaardetijd van het eiwit van interesse mogelijk. Echter, wij en anderen 33 hebben gevonden dat 488 nm verlichting is een inefficiënte manier van photoconversion in de zebravis embryo's.- Gebruik de controle-experiment in stap 5.1.1 beschreven om onbedoelde photoconversion detecteren. Vergelijk het half-leven van de 10 en 20 min interval experimenten. Kortere halfwaardetijd van 20 min interval experimenten wijzen op een significante onbedoelde photoconversion. Als de halfwaardetijd van beide experimenten zijn identiek, onbedoelde photoconversion is niet een belangrijke zorg.
- Als onbedoelde photoconversion wordt gedetecteerd, gebruik dan een kleinere 488 nm laservermogen en kortere beeldvorming keer per ongeluk te voorkomen photoconverting Dendra2.
- Het beoordelen photoconversion uniformiteit.
Opmerking: Als fotoconversie wordt voorgespannen naar de animale pool van het embryo, de afname in fluorescentie beïnvloed door proteïne diffusie of beweging van cellen in diepere gebieden (figuur 5A).- Om te bepalen of photoconversion uniform is, drukken een afgescheiden photoconvertible eiwit (voor experimenten met extracellulaire fusie-eiwitten) of een cytoplasmatisch photoconvertible eiwit (voor experimenten met intracellulaire fusie-eiwitten). Photoconvert zoals gebruikelijk, tkip verwerven van een z-stack omvat meeste blastoderm elke 20 min gedurende 80 min.
- Als photoconversion is beïnvloed naar het dier paal, zal de fluorescentie-intensiteit in diepere vliegtuigen boven de tijd toenemen als gevolg van diffusie of cel beweging (Figuur 5B). Als niet-uniforme photoconversion gedetecteerd richten dieper in het embryo tijdens photoconversion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FDAP is gebruikt om de halfwaardetijden van extracellulaire signaaleiwitten bepalen zebravisembryo 19. Een van deze eiwitten, Scheel, induceert expressie van genen gedurende embryogenese mesendodermal 34. Scheel-Dendra2 activeert expressie van mesendodermal genen op een niveau dat vergelijkbaar is met niet-gecodeerde Scheel, zoals aangetoond door qRT-PCR en in situ hybridisatie assays 19. Embryo's werden co-geïnjecteerd met Alexa488-dextran en mRNA coderend Scheel-Dendra2 en aan de FDAP assay. Een lagere extracellulaire photoconverted signaalsterkte in de tijd duidelijk (figuur 4A). Extracellulaire intensiteit profielen van 23 embryo's werden gegenereerd met behulp van PyFDAP. De verkregen data werd aangebracht PyFDAP een eerste-orde klaringskinetiek model en een gemiddelde klaring snelheidsconstante k van 1,00 x 10 -4 / sec, wat een gemiddelde halfwaardetijd τ van 116 min, werd bepaald. Vergelijkbare intensiteit profiels en klaring constanten werden verkregen wanneer de intervallen tussen beeldvorming waren 10 of 20 min, wat erop wijst dat fotobleking of onbedoelde photoconversion niet significant bijdragen aan de intensiteit veranderingen (figuur 4B).
Figuur 1. fluorescentievervaltijd Na Photoconversion (FDAP) overzicht. (A) Workflow van een FDAP experiment. (B) Injectie van mRNA en een fluorescerende kleurstof in een zebravis embryo in de een-cellig stadium. Eiwit wordt geproduceerd uit het mRNA als het embryo ontwikkelt zich ongeveer 5 uur voorafgaand aan beeldvorming. De kleurstof labels cellen (groene cirkels). (C) Het fusieproteïne wordt photoconverted met UV puls, en de afname in de intensiteit van de photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd. (D) De gegevens zijn voorzien van een exponentieel afnemende functie om klaring snelheidsconstanten (k) en de halfwaardetijd (τ) te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Montage zebravis embryo's voor FDAP experimenten. (A) zebravis embryo's (blastoderm = eiwit, eigeel = zwart) worden overgedragen van embryo medium (blauw) in gesmolten agarose (geel). (B) Embryo's en agarose worden geplaatst op de cover glas van een glazen bodem schotel. Embryo's worden vervolgens handmatig gepositioneerd dat het dier poolvlakken het dekglas. Een dwarsdoorsnede van een glazen onderste schaal weergegeven. (C) Schematisch overzicht van een glazen bodem schotel met meerdere agarose druppels met vier embryo's per stuk (uitzicht op zoek naar beneden in de schaal).w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Data-analyse met behulp van PyFDAP. (A) PyFDAP gebruikt de Otsu thresholding algoritme 35 tot intra- en extracellulaire maskers uit de intracellulaire Alexa488 signaal (groen) te genereren. (B) photoconverted signaal (rood) uit een embryo uitdrukken van een afgescheiden Dendra2 fusie-eiwit (Squint-Dendra2 19). Gemiddelde extra- en intracellulaire fluorescentie intensiteiten werden berekend met de in (A) maskers. De ruimte buiten van het embryo werd uit deze berekeningen uitgesloten door afdanking pixels buiten de gele cirkel. (C) PyFDAP screenshot tonen van extracellulaire intensiteit gegevens van een FDAP experiment (zwarte circles) uitgerust met een exponentieel dalende functie (rode stippellijn). De extracellulaire halfwaardetijd wordt aangegeven door de rode pijl. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Representatieve FDAP resultaten. (A) als vertegenwoordiger embryo tot expressie uitgescheiden Scheel-Dendra2 juist voor fotoconversie (uiterst links) en 27, 87 en 287 min na fotoconversie. (B) Om te controleren voor fotobleken en onbedoelde photoconversion (zie hoofdstuk 5), werden experimenten met 10 of 20 min intervallen uitgevoerd (gegevens van Müller et al., 2012 19). In PyFDAP werden extracellulaire intensiteitprofielen gegenereerd, voorzien exponentieel afnemende functie, en genormaliseerd door subtracting de aangepaste y 0 waarde van elk gegeven en te delen door de gemonteerde c 0 waarde. Gegevens van het 10 min (zwart, n = 11) en 20 min (blauw, n = 12) interval experimenten werden vervolgens gemiddeld, respectievelijk. Fout balken geven de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Het beoordelen photoconversion uniformiteit. (A) Niet-uniforme photoconversion uit een extracellulair eiwit kan leiden tot een foutief korte halfwaardetijd als photoconverted eiwit diffundeert in diepere vlakken in de tijd. (B) Om te bepalen of photoconversion is uniform, een z-stack die het grootste deel van de blastoderm wordt verworven op verschillende tijdstippen na photoconversion. Fluorescentie-intensiteit zal toenemen in diepere vliegtuigen over tijd als photoconversion was niet uniform (er rekening mee dat lichtverstrooiing veroorzaakt dieper vliegtuigen naar dimmer dan hogere niveaus verschijnen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het succes van een FDAP proef berust op het genereren van een functioneel photoconvertible fusieproteïne. Tagging een eiwit kan zijn biologische activiteit en / of biofysische eigenschappen, zoals de lokalisatie, oplosbaarheid en stabiliteit 36-41 beïnvloeden. Wees bereid om de activiteit van verschillende fusieconstructen testen om een die actief is te vinden. Wij hebben gevonden dat de positie van de photoconvertible eiwit ten opzichte van het eiwit van interesse of met meer linkers (bijvoorbeeld met de aminozuursequentie LGDPPVAT 19) kan de activiteit van het fusie-eiwit verhogen. Bij signalering eiwitten kan de activiteit van het fusie-eiwit bepaald door het testen van het vermogen om expressie van doelgenen 19 induceren. qRT-PCR of in situ hybridisatie goed uitlezingen van expressie van het doelwitgen 19. Merk op dat de hier beschreven protocol ontwikkeld om de stabiliteit van eiwitten te bepalenin de vroege zebravis embryo en zou aangepast moeten eiwitstabiliteit evalueren andere contexten.
De groene tot rode photoconvertible eiwit Dendra2 27 is met succes gebruikt bij de zebravis FDAP experimenten 19 (figuur 4), maar andere opties beschikbaar 26,42. Om potentiële artefacten als gevolg van aggregatie van het fusie-eiwit te voorkomen, kiest u een monomeer photoconvertible eiwit. Fotoactiveerbare eiwitten kunnen ook worden gebruikt in assays FDAP 20-22,26.
Voordat een FDAP experiment verscheidene aspecten van het protocol moeten worden geoptimaliseerd. Injecteren verschillende hoeveelheden mRNA aan het laagste bedrag dat bruikbaar signaal geeft na photoconversion te bepalen; ~ 50 pg mRNA is een goed uitgangspunt bedrag. Om zinvolle compartimentele maskers te genereren (Figuur 3), moet de Alexa488 signaal helder genoeg omtegen het signaal van de niet-photoconverted fusie-eiwit dat continu wordt geproduceerd uit de geïnjecteerde mRNA concurreren; injecteren tussen 0,2 en 4 ng Alexa488-dextran de optimale hoeveelheid fluorescerende kleurstof vinden. Vind de optimale post-conversie beeldvorming voorwaarden en gebruiken dezelfde voorwaarden voor alle experimenten met een bepaalde constructie. Gebruik goede kwantitatieve beeldvorming beoefent 43 en kies een geschikte dynamische bereik te verzadigde pixels in het rode kanaal te voorkomen. Bepaal de juiste beeldvormende interval voor elke fusieproteïne. Eiwitten met een zeer korte halfwaardetijd kan vaker beeldvorming over een kortere totale tijd nodig. Bepaal de optimale photoconversion techniek die gebaseerd is op het organisme en photoconvertible eiwit gebruikt. We beschrijven een robuuste photoconversion methode met behulp van een kwik booglamp in stap 3.5, maar Dendra2 kan ook worden photoconverted met een 405 33 of 488 nm laser 27.
Eén limitation deze FDAP protocol dat overexpressie van het eiwit van interesse vereist. Overexpressie invloed kunnen eiwitstabiliteit, bijvoorbeeld door abnormale expressie van andere genen die het eiwit klaringskinetiek 14,44 wijzigen. Als het eiwit van interesse een signaalmolecule overwegen om experimenten in de aanwezigheid van een signalering remmer te bepalen of het blokkeren expressie van doelgenen beïnvloedt eiwitstabiliteit. In de toekomst zal het mogelijk zijn om transgene embryo expressie photoconvertible fusies onder de controle van endogene expressie elementen 45-50 genereren. Wanneer transgene embryo's voldoende signaal FDAP experimenten in een niet-overexpressie context denkbaar, wellicht met licht vel microscopie fluorescentie afname van het gehele embryo 51 waarnemen.
Mogelijke verdere toepassingen van FDAP onder meer onderzoek naar de mechanismen that regelen eiwitstabiliteit door onderzoek van de effecten van verschillende storingen (bijvoorbeeld expressie van vermeende proteasen) of eiwit modificaties (bijvoorbeeld fosforylatie) op stabiliteit. Bijvoorbeeld, de factoren die de extracellulaire stabiliteit van Scheel zijn nog niet bekend. Veel uitgescheiden ontwikkelingsstoornissen signalen worden geïnternaliseerd door cellen 52-55, die zouden kunnen bijdragen aan de klaring van Scheel en andere liganden uit de extracellulaire ruimte. FDAP experimenten waarbij internalisatie wordt geblokkeerd zou informatie over de mechanismen die de extracellulaire eiwitten speling.
In tegenstelling tot conventionele testen voor het meten van eiwitstabiliteit 15 FDAP biedt een microscopie alternatief voor de vereffening van eiwitten kan worden gevolgd in de tijd binnen levende organismen. Soortgelijke werkwijzen zijn gebruikt om eiwitten speling in andere dan zebravisembryo modelsystemen controleren 20-23. Deze FDAP protocol heeft het potentieel om te worden aangepast aan de halfwaardetijd van taggable eiwit in biologische systemen waarbij levende imaging haalbaar bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Jeffrey Farrell, James Gagnon, en Jennifer Bergmann bedanken voor commentaar op het manuscript. KWR werd gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program tijdens de ontwikkeling van de FDAP test. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH aan AFS en door subsidies van de Duitse Stichting voor Onderzoek (Emmy Noether Program), het Max Planck Instituut en het Human Frontier Science Program (Career Development Award) naar PM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Life Technologies | AM1340 | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | |
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage |
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use |
| Glass Pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos |
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 |
| 15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium | BD Falcon | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | |
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25X or 40X water objective | Objective for imaging | ||
| 10X air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
- Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O'Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Parry, D. H., O'Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
- Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
- Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
- MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
- Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
- Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
- Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
- Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
- Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
- Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
- Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
- Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
- Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
- Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
- Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
- Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
- Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
- Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
- Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
- Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
- Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
- Bläßle, A., Müller, P. PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, forthcoming (2014).
