Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Måling Protein Stabilitet i Living zebrafisk embryoner anvendelse af fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP)

Published: January 28, 2015 doi: 10.3791/52266

Summary

Protein niveauer i celler og væv er ofte stramt reguleret af balance proteinproduktion og clearance. Anvendelse af fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP) kan clearance kinetik proteiner eksperimentelt målt in vivo.

Abstract

Protein stabilitet påvirker mange aspekter af biologi, og måling af clearance kinetik proteiner kan give vigtig indsigt i biologiske systemer. I FDAP eksperimenter, kan måles clearance af proteiner i levende organismer. Et protein af interesse er mærket med en photoconvertible fluorescerende protein udtrykkes in vivo og photoconverted, og faldet i photoconverted signal over tid overvåges. Dataene bliver derefter forsynet med et passende clearance model til at bestemme protein halveringstid. Vigtigt er det, kan clearance kinetikken for protein befolkninger i forskellige rum i organismen undersøges separat ved anvendelse af rumlige masker. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at bestemme de intra- og ekstracellulære halveringstider af secernerede signalproteiner under zebrafisk udvikling. Her beskriver vi en protokol for FDAP eksperimenter i zebrafisk embryoner. Det bør være muligt at anvende FDAP at bestemme clearance kinetikenhver taggable protein i enhver optisk tilgængelig organisme.

Introduction

Niveauerne af proteiner i celler og organismer bestemmes af deres satser produktions- og clearance. Protein halveringstider kan variere fra minutter til dage 1-4. I mange biologiske systemer, stabilisering eller clearance af vigtige proteiner har vigtige virkninger på cellulær aktivitet. Modulation af intracellulær proteinstabilitet er påkrævet for cellecyklusprogression 5,6, udviklingsmæssige signalering 7-9, apoptose 10 og normal funktion og vedligeholdelse af neuroner 11,12. Ekstracellulært protein stabilitet påvirker fordelingen og tilgængeligheden af udskilte proteiner, såsom morfogener 13,14, inden et væv.

I de seneste årtier har proteinstabilitet primært blevet vurderet i cellekultur ved hjælp radioaktiv puls-mærkning eller cycloheximid chase eksperimenter 15. I sådanne puls-chase forsøg celler enten transient udsættes for en "puls" af radioaktivt aminosyreforløberne der er inkorporeret i nyligt syntetiserede proteiner, eller de udsættes for cycloheximid, hvilket inhiberer proteinsyntese. Dyrkede celler opsamles derefter på forskellige tidspunkter, og enten immunopræcipitation efterfulgt af autoradiografi (i radioaktive puls-chase forsøg) eller western blotting (i cycloheximid forsøg) anvendes til at kvantificere clearance af protein over tid.

Konventionelle proteinstabilitet assays har flere mangler. Først proteiner i disse assays er ofte ikke udtrykkes i deres endogene miljøer, men snarere i vævskultur og undertiden i celler fra forskellige arter. For proteiner, hvis stabilitet er kontekstafhængig, denne fremgangsmåde er problematisk. For det andet er det ikke muligt at følge protein clearance i individuelle celler eller organismer over tid, og dataene fra disse assays afspejler et gennemsnit af forskellige populationer af celler på forskellige tidspunkter. Da de enkelte celler kan have startetmed forskellige mængder af protein, kan have taget op det radioaktive etiket eller cycloheximid på forskellige tidspunkter, eller kan have forskellige clearance kinetik, sådanne aggregerede data kan være vildledende. Endelig, i tilfælde af cycloheximid chase eksperimenter tilsætning af proteinsynteseinhibitor kan have utilsigtede fysiologiske virkninger, som kan kunstigt ændre proteinstabilitet 16-18. Disse mangler kan undgås ved hjælp af fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP), en teknik, der udnytter photoconvertible proteiner til at måle protein clearance dynamisk i levende organismer 19-25 (se Diskussion for begrænsninger i FDAP teknik).

Photoconvertible proteiner er fluorescerende proteiner, hvis excitation og emission egenskaber ændres efter udsættelse for bestemte bølgelængder af lys 26. Et almindeligt brugt variant er Dendra2, en "grøn-til-rød" photoconvertible protein, der i første omgang har excitation og emissions- egenskaber svarende til grønt fluorescerende proteiner, men efter eksponering for UV-lys- "fotoomdannelse"-dens excitation / emission egenskaber bliver ligner dem af røde fluorescerende proteiner 23,27. Vigtigt er det, vil nye protein produceret efter fotoomdannelse ikke har de samme excitation / emission egenskaber som den photoconverted protein, så afkobling af produktion og clearance ved fotoomdannelse og observation af kun en pulje af photoconverted protein. Tagging proteiner af interesse med photoconvertible proteiner således giver en bekvem måde at pulse-label proteiner i intakte, optisk tilgængelige levende organismer.

I FDAP assays (figur 1A), er et protein af interesse mærket med et photoconvertible protein og udtrykkes i en levende organisme (figur 1B). Fusionsproteinet er photoconverted, og faldet i photoconverted signal over tid overvåges af fluorescence mikroskopi (figur 1C). Dataene bliver derefter forsynet med en passende model for at bestemme halveringstiden af fusionsproteinet (figur 1D).

Den FDAP assay beskrevet her var designet til at bestemme de ekstracellulære halveringstider af secernerede signalproteiner i zebrafisk embryoner under tidlig embryogenese 19. Imidlertid kan denne fremgangsmåde tilpasses til en hvilken som helst transparent model organisme, som tolererer levende billeddannelse, og kan bruges til at overvåge clearance af enhver taggable intracellulært eller ekstracellulært protein. Variationer af den her beskrevne teknik er blevet udført i dyrkede celler 20,23 og Drosophila 22 og mus 21 embryoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generering af en Photoconvertible Fusion Construct og injektion Dechorionated zebrafisk embryoner

  1. Generere en funktionel konstruktion indeholdende proteinet af interesse fusioneret til en grøn-til-rød photoconvertible protein (se diskussion), derefter bruge in vitro transkription til at generere udjævnede mRNA, der koder for fusionsproteinet som i Müller et al. 2012 19.
  2. Brug pronase at fjerne chorions fra ca. 30 zebrafisk embryoner på en celle stadiet. Alternativt dechorionate embryoner ved anvendelse af pincetter 28 manuelt.
    Bemærk: embryoner skal dechorionated til efterfølgende billeddannelse. Hvis det ønskes, kan embryoner injiceres gennem chorion og dechorionated senere, lige før billeddannelse.
    1. Lav en 5 mg / ml stamopløsning af pronase fra Streptomyces griseus i standard zebrafisk embryo medium 19. Rock opløsningen forsigtigt ved stuetemperatur i 10 minutter for at tillade proteasen at opløse. Alikvot 2 ml i mikrocentrifugerør og fryse ved -20 ° C.
    2. Overfør en celle embryoer til en diameter på 5 cm glas eller agarose-coatet plast Petri-skål indeholdende ~ 8 ml embryo medium. Tilsæt 2 ml optøet pronase stamopløsning til skålen og inkuberes ved stuetemperatur i 5 til 10 min.
    3. Undgå at udsætte embryoner til luft eller plast, som kontakt med enten vil medføre dechorionated embryoner til at briste. Fyld en 200 ml bægerglas med embryo medium. Overfør embryoner til bægeret ved at vippe petriskålen mens nedsænke den i mediet.
    4. Efter embryonerne er afgjort til bunden af ​​bægeret, hæld det meste af embryo medium, så hæld frisk embryo medium i bægerglasset. Den milde hvirvlende af mediet hælde i bægeret forårsager embryoner til at miste deres svækkede chorions.
    5. Gentag trin 1.2.4.
  3. Overfør dechorionated embryoner til en agarose-coatet injektion skålen 29 ved hjælp af en glas Pasteur-pipette med en Flammet spids. Flamingpipettespidsen forhindrer flossede kanter fra sårede embryoner.
  4. Co-injicere mRNA og en 3 kDa Alexa488-dextran konjugat 29,30 (figur 1B, se Diskussion for foreslået mRNA og Alexa488-dextran beløb). Indsprøjtes direkte ind i midten af ​​cellen (ikke blommen) for at sikre jævn fordeling af mRNA og fluorescerende farvestof, når spaltning begynder.
    Bemærk: Alexa488 signal vil blive anvendt i dataanalyse at generere miljømediumspecifikke masker for at skelne mellem intracellulære og ekstracellulære fluorescens.
  5. Overfør injicerede embryoner til en 1-2% agarose-coatede brønd i en seks-godt plastik fad fyldt med embryo medium. Der inkuberes i mørke ved 28 ° C, indtil embryoner har nået sent sfære stadie 31 (ca. 5 timer efter befrugtning). Tjek embryoner hver til 2 timer under et stereomikroskop og fjerne eventuelle rester genereret af embryoner, der er døde.

2. Montering zebrafisk embryoner til Photoconversion og Imaging på et omvendt konfokalmikroskop

  1. Brug et stereomikroskop for at identificere 1-5 sunde fostre, og brug et glas Pasteur pipette med en flammet tip til at fjerne dem fra fadet.
  2. Forsigtigt skubbe embryoner i et mikrocentrifugerør indeholdende ~ 1 ml smeltet 1% agarose med lavt smeltepunkt i 1x Danieau s embryo medium (se Materialer Liste) (figur 2A).
    Bemærk: Agarose bør have en temperatur mellem 40 og 42 ° C; højere temperaturer kan beskadige embryoner.
  3. Tegn embryoner tilbage ind i pipetten sammen med nogle agarose. Forsigtigt skubbe agarose og embryoner på dækglasset af en glas-bund fad (figur 2B). Sørg for, at tykkelsen af ​​dækglasset er forenelig med målsætningen om konfokal mikroskop.
    1. Genbruge glaspipette hvis det ønskes. For at rengøre den resterende agarose ud af pipetten og undgå tilstopning, hurtigt pipette embryo medium op og ned.Anbring en 15 ml rør fyldt med ~ 5 ml embryo medium ved siden af ​​stereomikroskop til dette formål.
  4. Brug en metalsonde at placere embryoner således at dyret pol (blastoderm) vender dækglasset. Arbejd hurtigt da agarose vil størkne i 20-30 sek. Brug stereomikroskopet at overvåge embryoner holdninger og justér efter behov, indtil agarose hærder.
  5. Gentag trin 2,1-2,4 indtil der er monteret det ønskede antal embryoner.
    Bemærk: I et typisk forsøg vil fire agarose dråber indeholdende fire eller fem fostre hver passer nemt på dækglasset. Omkring 16 embryoner kan afbildes i en enkelt ideel eksperiment (figur 2C).
  6. Når agarosen er størknet, fylde glasbund fad med 1x Danieau s embryo medium.

3. Photoconverting og måling af fald i Photoconverted Signal

En 25X eller 40X vand målsætning is passende for størrelsen og brydningsindeks zebrafisk embryoner. Det er bedst at anvende nedsænkning olie med samme brydningsindeks som vand snarere end den faktiske vand, da vand vil fordampe i løbet af de fem timers eksperiment. Sørg for at immersionsolie er designet til at blive anvendt med en vand (ikke olie) mål.

  1. Placer en stor dråbe immersionsolie på målsætningen at sikre, at oliefilmen mellem målet og dækglas ikke vil bryde som scenen bevæger sig til forskellige embryo positioner under billedbehandling. Sikker placere glasbund fad ind på scenen, så fadet ikke vil skifte, når scenen bevæger sig. Brug om muligt en opvarmet fase ved 28 ° C, den optimale temperatur for zebrafisk udvikling.
  2. Definere hver embryo position i konfokalt mikroskop software-pakke. Juster Z-dybde for hver embryo og forsøge at målrette nogenlunde samme plan i hvert foster.
    Bemærk: Omkring 30 pm fra dyret pol er en good dybde da på denne dybde den omsluttende lag af embryonet kan undgås, er imaging område maksimeres, og lysspredning er minimal. En enkelt optisk skive med en tykkelse på ~ 3,3 um giver tilstrækkelig data; der ikke er behov for at erhverve en z-stak (se afsnit 5).
  3. Saml to signaler under forsøget: den "grønne" signal fra Alexa488-dextrankonjugat-som vil blive anvendt i dataanalyse at isolere ekstracellulære og intracellulære fluorescens-og "røde" signal fra fusionsproteinet, når den er photoconverted.
    1. Excite Alexa488 anvendelse af en 488 nm laser, og indsamle udsendte fluorescens mellem ~ 500 og 540 nm. Bemærk: Efter fotoomdannelse, mange grønne-til-rød photoconvertible proteiner (f.eks Dendra2) kan være glade med en 543 nm laser og udsender fluorescens mellem ~ 550 og 650 nm. Juster om nødvendigt på grundlag af photoconvertible protein anvendes.
  4. Anskaf "pre-fotoomdannelse"Billeder, og konfigurere konfokalt mikroskop software til billede hver af de tidligere definerede positioner (fra trin 3.2) med de relevante billeddiagnostiske betingelser hver 10 eller 20 min efter en fem-timers kursus (se afsnit 5 og Diskussion).
  5. Til photoconvert fusionsproteinet skifte til en 10X objektiv og udsætte grupper af embryoner for UV-lys fra en kviksølvbuelampe med ~ 300-400 nm excitationsfilter 100% output i 2 min. Skift fokus langs z-aksen at fremme en ensartet fotoomdannelse (se afsnit 5). Sørg for, at el-olie ikke drypper ned på 10x mål i fotoomdannelse.
    Bemærk: flytning af fokus under fotoomdannelse kunne automatiseres for at undgå variation blandt eksperimentatorer.
  6. Skift tilbage til 25X eller 40X mål umiddelbart efter fotoomdannelse. Sørg for, at de tidligere definerede positioner fra trin 3.2 er stadig korrekte. Hvis fadet flyttet under photoconversion, re-definere positioner embryoner.
    1. Start programmet blev oprettet i trin 3.4 og tillade billeddannelse til at fortsætte i 5 timer. Bemærk tidsrummet mellem fotoomdannelse og starten af ​​billedbehandling for hver foster.
  7. Lejlighedsvis kontrollere på eksperimentet. Overvåg niveauet for Danieau medium og tilføje mere, hvis det er nødvendigt. Genstart softwaren, hvis den er gået i stå.
  8. For at bestemme baggrundsfluorescensen værdier, som vil blive anvendt i dataanalyse at estimere asymptote en eksponentielt faldende model, omfatter visse embryoner, der er blevet injiceret med Alexa488-dextran, men ikke mRNA i eksperimentet. For at bestemme instrument støj, der også vil blive anvendt i efterfølgende analyse data erhverve et billede i fravær af en prøve.

4. Analyse af data ved hjælp af PyFDAP

  1. Kontrollér visuelt tidsforløbet datasæt fra hver foster. Kassér datasæt fra embryoner, der døde under imagING, der skiftede markant, som har meget lave niveauer af photoconverted signal, eller som indeholder regioner af celler, der ser usædvanlige og er stoppet og dividere (typisk tilskadekomne eller syge fostre).
    Bemærk: Af og bobler i fordybelse olie eller andre artefakter vises i et eller to billeder i en ellers brugbar datasæt. Bemærk eventuelle billeder, der indeholder artefakter; de vil blive kasseret senere, og den resterende tid punkter fra sådan et datasæt kan stadig analyseres.
  2. Brug Python-baseret software pakke PyFDAP at analysere FDAP data. PyFDAP beregner halveringstider ved at bestemme den gennemsnitlige intracellulære og ekstracellulære rød fluorescens intensitet i hvert billede og montering af data med en eksponentielt aftagende funktion 56 (figur 3).
    1. Hent PyFDAP (se Materialer List).
    2. Brug PyFDAP at adskille intracellulære og ekstracellulære photoconverted signal (figur 3A, B). Osè Alexa488 signal, som er strengt intracellulært, for at skabe en intracellulær maske. Anvend denne maske til den tilsvarende røde kanal billede for at forhindre intracellulære pixels i at blive ved beregningen gennemsnit ekstracellulær intensitet. For at måle gennemsnitlig intracellulær intensitet, invertere masken.
    3. I PyFDAP, vise de maskerede billeder genereret i trin 4.2.2. Visuel kontrol disse billeder og kassér datasæt, hvor masker ikke præcist skelner intracellulært fra ekstracellulære rum (det bør være sjældne, bemærke, at cellemembraner indgår i billeder, hvor ekstracellulære rum er maskerede, men de kunne fjernes ved at ændre tærskelværdiansættelse algoritme eller ved at indføre en membran maske (f.eks ved hjælp af membran-CFP)). Afviser også alle enkeltbilleder indeholder artefakter (f.eks bobler i immersionsolie) identificerede i trin 4.1.
    4. Brug PyFDAP at beregne gennemsnitlige ekstracellulære og intracellulære fluorescensintensiteter til each billede. PyFDAP beregner disse gennemsnit som summen af ​​intensiteterne af pixels, der falder uden for masken og dividere med det samlede antal pixels summerede.
    5. Monter fluorescensdata (figur 3C) med følgende eksponentiel funktion:

      hvor t er tiden post-fotoomdannelse, c (t) er intensiteten ved en given værdi af t, c 0 er intensiteten ved t = 0, k er udskillelseshastigheden konstant, og y 0 er asymptote at funktionen nærmer fluorescens falder (Figur 1D). y 0 kan være begrænset på grundlag af målinger i trin 3.8 19.
    6. Brug PyFDAP at beregne de ekstracellulære og intracellulære protein halveringstider (τ) fra clearance hastighedskonstanter (k) under anvendelse af følgende relation:

5. kontrolforsøg at Vurdere Fotoblegning, Utilsigtet fotoomdannelse, og fotoomdannelse Ensartethed

  1. Vurdering fotoblegning
    Bemærk: Fotoblegning kan forårsage en kunstig fald i fluorescensintensitet som afspejler blegning egenskaber fluorescerende protein foruden clearance af proteinet af interesse.
    1. For at vurdere eventuel fotoblegning, udføre et sæt FDAP eksperimenter med 10 minutters intervaller mellem billedbehandling og et andet sæt med 20 min intervaller mellem imaging (figur 4). Analysere data fra begge sæt eksperimenter ved hjælp PyFDAP som beskrevet i afsnit 4.
    2. Sammenlign halveringstider fra 10 og 20 min interval eksperimenter. Længere halveringstid fra 20 min interval eksperimenter tyder på betydelig fotoblegning. Hvis halveringstider fra begge forsøg er identiske, photobleaching er ikke en stor bekymring.
    3. Alternativt vurdere fotoblegning ved at erhverve en række ~ 30 billeder umiddelbart efter fotoomdannelse. Et signifikant fald i fluorescens-intensiteten indikerer betydelig fotoblegning.
    4. Hvis der registreres fotoblegning, bruge mindre laser magt, fald imaging tid, eller overveje at bruge en mere fotostabilt photoconvertible protein 32.
  2. Vurdering utilsigtet fotoomdannelse.
    Bemærk: Dendra2 kan photoconverted hjælp 488 nm belysning 27. Når spændende Alexa488 med 488 nm laser som beskrevet i trin 3.3.1, utilsigtet fotoomdannelse og derfor en kunstig stigning i den tilsyneladende halveringstid for proteinet af interesse er mulig. Men vi og andre 33 har konstateret, at 488 nm belysning er en ineffektiv metode til fotoomdannelse i zebrafisk embryoner.
    1. Brug kontrol eksperimentet beskrevet i trin 5.1.1 at detektere utilsigtet fotoomdannelse. Sammenlign halveringstider fra 10 og 20 min interval eksperimenter. Kortere halveringstider fra 20 min interval eksperimenter tyder på betydelig utilsigtet fotoomdannelse. Hvis halveringstider fra begge forsøg er identiske, utilsigtet fotoomdannelse er ikke en stor bekymring.
    2. Hvis der registreres utilsigtet fotoomdannelse, brug en lavere 488 nm laser magt og kortere billeddiagnostiske gange for at undgå utilsigtet photoconverting Dendra2.
  3. Vurdering fotoomdannelse ensartethed.
    Bemærk: Hvis fotoomdannelse er forspændt mod dyret pol af embryonet, vil faldet i fluorescens blive påvirket af protein diffusion eller cellebevægelse i dybere planer (figur 5A).
    1. For at bestemme om fotoomdannelse er ensartet, udtrykker et udskilt photoconvertible protein (til forsøg med ekstracellulære fusionsproteiner) eller en cytoplasmatisk photoconvertible protein (til forsøg med intracellulære fusionsproteiner). Photoconvert som sædvanlig, thøne erhverve en z-stak omfatter det meste af blastoderm hver 20 min i 80 min.
    2. Hvis fotoomdannelse er forspændt mod dyret pol, vil fluorescensintensiteten under dybere stige over tid på grund af diffusion eller cellebevægelse (figur 5B). Hvis der registreres uensartet fotoomdannelse, fokusere dybere ind i embryoner under fotoomdannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FDAP er blevet anvendt til at bestemme halveringstiderne for ekstracellulære signalproteiner i zebrafisk embryoner 19. Et af disse proteiner, Squint, inducerer ekspression af mesendodermal gener under embryogenese 34. Skele-Dendra2 aktiverer ekspression af mesendodermal gener på niveauer svarende til ukodede skele, hvilket fremgår af QRT-PCR og in situ hybridisering assays 19. Embryoner blev co-injiceret med Alexa488-dextran og mRNA, der koder Squint-Dendra2 og underkastes den FDAP assay. Et fald i det ekstracellulære photoconverted signal intensitet over tid er indlysende (figur 4A). Ekstracellulære intensitetsprofiler fra 23 embryoner blev dannet ved anvendelse PyFDAP. De resulterende data blev monteret i PyFDAP med en første ordens kinetik clearance model, og en gennemsnitlig clearance hastighedskonstant k på 1,00 x 10 -4 / sek, svarende til en gennemsnitlig halveringstid τ af 116 min, blev bestemt. Tilsvarende intensitet profils og clearance hastighedskonstanterne blev opnået, når intervallerne mellem billeddannelse var 10 eller 20 min, hvilket tyder på, at fotoblegning eller utilsigtet fotoomdannelse ikke bidrog væsentligt til intensitetsændringer (figur 4B).

Figur 1
Figur 1. Fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP) overblik. (A) Workflow af en FDAP eksperiment. (B) Injektion af mRNA og et fluorescerende farvestof i en zebrafisk embryo på en celle stadiet. Protein produceres fra mRNA som fosteret udvikler sig over ca. 5 timer før billeddannelse. Farvestoffet etiketter celler (grønne cirkler). (C) Fusionsproteinet photoconverted anvendelse af en UV puls, og faldet i intensitet photoconverted signal over tid overvåges. (D) data er udstyret med en eksponentielt aftagende funktion til at opnå clearance hastighedskonstanter (k) og halveringstider (τ). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Montering zebrafisk embryoner til FDAP forsøg. (A) zebrafisk embryoner (blastoderm = æggehvide, æggeblomme = sort) overføres fra embryo medium (blå) i smeltet agarose (gul). (B) Embryoner og agarose er placeret på dækglasset af et glas-bund fad. Embryoer derefter manuelt placeret således, at dyret polflader dækglasset. Et tværsnit af en glasbund skålen vises. (C) Skematisk oversigt over en glas-bund fad med flere agarose dråber indeholdende fire fostre hver (se ser ned i fadet).w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Dataanalyse hjælp PyFDAP. (A) PyFDAP anvender Otsu tærskelværdiansættelse algoritme 35 til at generere intra- og ekstracellulære masker fra det intracellulære Alexa488 signal (grøn). (B) Photoconverted signal (rød) fra et embryo, der udtrykker en secerneret Dendra2 fusionsprotein (squint-Dendra2 19). Ekstra- og intracellulære Gennemsnitlige fluorescensintensiteter blev beregnet ved hjælp af masker, der er vist i (A). Rummet uden for embryo blev udelukket fra disse beregninger ved at kassere pixels uden for den gule cirkel. (C) PyFDAP screenshot viser ekstracellulære intensitet data fra en FDAP eksperiment (sort cirkler) monteret med en eksponentielt aftagende funktion (rød stiplet linie). Det ekstracellulære halveringstid er angivet med den røde pil. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Repræsentant FDAP resultater. (A) er repræsentant embryo udtrykker udskilles skele-Dendra2 lige før fotoomdannelse (længst til venstre) og 27, 87 og 287 minutter efter fotoomdannelse. (B) For at kontrollere for fotoblegning og utilsigtet fotoomdannelse (se afsnit 5), blev der forsøg med 10 eller 20 minutters intervaller udføres (data fra Müller et al. 2012 19). I PyFDAP blev ekstracellulære intensitetsprofiler genereret, monteret med eksponentielt faldende funktioner, og normaliseret ved subtracTing monteret y 0 værdi fra hver datapunkt og dividere med monteret c 0 værdi. Data fra 10 min (sort, n = 11) og 20 min (blå, n = 12) interval eksperimenter blev derefter gennemsnit henholdsvis. Fejlsøjler angiver standardafvigelsen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Vurdering fotoomdannelse ensartethed. (A) Ikke-ensartet fotoomdannelse af et ekstracellulært protein kan føre til en fejlagtigt kort tilsyneladende halveringstid hvis photoconverted protein diffunderer ind i dybere fly over tid. (B) For at bestemme om fotoomdannelse er ensartet, en z-stak dækker det meste af blastoderm erhverves på flere tidspunkter post-photoconversion. Fluorescensintensitet vil stige under dybere over tid, hvis fotoomdannelse var uensartet (bemærk, at lysspredning forårsager dybere fly til at blive vist svagere end højere planer). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Succesen med en FDAP eksperiment afhængig af generering af et funktionelt photoconvertible fusionsprotein. Mærkning af et protein kan påvirke dets biologiske aktivitet og / eller biofysiske egenskaber, herunder dens lokalisering, opløselighed og stabilitet 36-41. Vær forberedt på at teste aktiviteten af ​​flere forskellige fusionskonstruktioner for at finde en, der er aktiv. Vi har fundet, at ændre positionen af photoconvertible protein i forhold til proteinet af interesse eller ved hjælp af længere linkere (fx ved hjælp af aminosyresekvensen LGDPPVAT 19) kan øge aktiviteten af fusionsproteinet. I tilfælde af signalproteiner kan aktiviteten af fusionsproteinet bestemmes ved at teste dets evne til at inducere ekspression af målgener 19. QRT-PCR eller hybridisering in situ giver gode udlæsninger af målgenekspression 19. Bemærk, at protokollen beskrevet her er designet til at bestemme stabiliteten af ​​proteineri den tidlige zebrafisk embryoner og vil kræve modifikation for at vurdere protein stabilitet i andre sammenhænge.

Den grønne-til-rød photoconvertible protein Dendra2 27 har været anvendt med succes i zebrafisk FDAP eksperimenter 19 (figur 4), men der findes andre muligheder 26,42. For at undgå potentielle artefakter på grund af sammenlægning af fusionsproteinet, vælge en monomer photoconvertible protein. Photoactivatible proteiner kan også anvendes i FDAP-analyser 20-22,26.

Før du udfører en FDAP eksperiment, flere aspekter af protokollen skal optimeres. Injicer forskellige mængder af mRNA for at bestemme det laveste beløb, der giver brugbare signal efter fotoomdannelse; ~ 50 pg mRNA er et godt udgangspunkt beløb. For at generere meningsfulde miljømediumspecifikke masker (figur 3), skal Alexa488 signal være lyse nok til atkonkurrere mod signalet fra ikke-photoconverted fusionsprotein, der konstant produceret fra det injicerede mRNA; injicere mellem 0,2 og 4 ng Alexa488-dextran til at finde den optimale mængde af fluorescerende farvestof. Finde den optimale post-konvertering imaging forhold og anvende de samme betingelser for alle forsøg med en given konstruktion. Brug god kvantitativ billedbehandling praksis 43, og vælge en passende dynamisk område for at undgå mættede pixels i den røde kanal. Bestemme den passende billeddannelse interval for hvert fusionsprotein. Proteiner med meget korte halveringstider kan kræve hyppigere billeddannelse over en kortere samlet tidsrum. Etablere den optimale fotoomdannelse teknik baseret på organismen og photoconvertible protein anvendes. Vi beskriver et robust fotoomdannelse metoden i en kviksølv bue lampe i trin 3.5, men Dendra2 kan også photoconverted med en 405 33 eller 488 nm laser 27.

En limitation denne FDAP protokollen er, at overekspression af proteinet af interesse er påkrævet. Overekspression kan påvirke proteinstabilitet, for eksempel gennem unormal ekspression af andre gener, der modificerer proteinets clearance kinetik 14,44. Hvis proteinet af interesse er et signalmolekyle overveje at udføre eksperimenter i nærvær af en signalering inhibitor at afgøre, om blokering ekspression af målgener påvirker proteinstabilitet. I fremtiden kan det være muligt at generere transgene embryoner udtrykker photoconvertible fusioner under kontrol af endogene ekspressionselementer 45-50. Hvis transgene embryoner producere tilstrækkelig signal, FDAP eksperimenter i en ikke-overekspression sammenhæng er tænkelige, måske ved hjælp af lys-ark mikroskopi at observere fluorescens fald i hele embryo 51.

Mulige yderligere anvendelser af FDAP omfatter undersøge mekanismerne THAt regulere proteinstabilitet ved at undersøge virkningerne af forskellige forstyrrelser (f.eks ekspression af formodede proteaser) eller protein modifikationer (fx phosphorylering) på stabilitet. For eksempel, de faktorer, der styrer den ekstracellulære stabilitet af skeløjethed er i øjeblikket ukendt. Mange udskilte udviklingsmæssige signaler internaliseres af celler 52-55, som kan bidrage til clearance af knibe og andre ligander fra det ekstracellulære rum. FDAP forsøg, hvor internalisering er blokeret kan give oplysninger om mekanismer, der styrer ekstracellulært protein clearance.

I modsætning til traditionelle assays til måling af proteinstabilitet 15 FDAP tilbyder en mikroskopi-baseret alternativ, hvor clearance af proteiner kan overvåges over tid i levende organismer. Lignende metoder er blevet anvendt til at overvåge protein clearance i andre end zebrafisk embryoner modelsystemer 20-23. Denne FDAP protokol har potentialet til at blive indrettet til at bestemme halveringstiden af enhver taggable protein i biologiske systemer, hvor levende billeddannelse er mulig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Jeffrey Farrell, James Gagnon, og Jennifer Bergmann for kommentarer til manuskriptet. KWR blev støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under udviklingen af ​​den FDAP analysen. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH til AFS og med tilskud fra den tyske Research Foundation (Emmy Noether Program), Max Planck Society, og Human Frontier Science Program (Career Development Award) til PM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Life Technologies AM1340 To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa Life Technologies D34682 Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish BD Falcon Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus Sigma P5147 Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass Petri dish For embryo dechorionation
200 ml glass beaker For embryo dechorionation
Microinjection apparatus For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 16520-100 For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette Kimble Chase (via Fisher) 63A53WT For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium BD Falcon For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals 
25X or 40X water objective Objective for imaging
10X air objective Objective for photoconversion
Immersion oil Immersion oil with the same refractive index as water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
  3. Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O'Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
  4. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  5. Parry, D. H., O'Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
  6. Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
  7. Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
  8. MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
  9. Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
  10. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  11. Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
  12. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  13. Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
  14. Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
  15. Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
  16. Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
  17. Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
  18. Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
  19. Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
  20. Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
  21. Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
  22. Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
  23. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  24. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
  25. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
  26. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  27. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  28. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  30. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  31. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
  32. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  33. Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
  34. Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
  35. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
  36. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
  37. Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
  38. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
  39. Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
  40. Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
  41. Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
  42. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  44. Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
  45. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  46. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  47. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
  48. Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
  49. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  50. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  51. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
  52. Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
  53. Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
  54. Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
  55. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
  56. Bläßle, A., Müller, P. PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, forthcoming (2014).

Tags

Developmental Biology Fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP) protein stabilitet clearance rate konfokal mikroskopi photoconvertible protein Dendra2 embryo zebrafisk
Måling Protein Stabilitet i Living zebrafisk embryoner anvendelse af fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, K. W., Bläßle, A., More

Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP). J. Vis. Exp. (95), e52266, doi:10.3791/52266 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter