Summary
רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.
Abstract
יציבות חלבון משפיעה על היבטים רבים של ביולוגיה, ומדידת קינטיקה השחרור של חלבונים יכולה לספק תובנות חשובות במערכות ביולוגיות. בניסויי FDAP, האישור של חלבונים בתוך אורגניזמים חיים ניתן למדוד. חלבון של העניין מתויג עם חלבון פלואורסצנטי photoconvertible, בא לידי ביטוי בvivo וphotoconverted, והירידה באות photoconverted לאורך הזמן היא פיקוח. הנתונים אז מצויד במודל פינוי מתאים כדי לקבוע את חלבון מחצית החיים. חשוב לציין, קינטיקה פינוי אוכלוסיות חלבון בתאים שונים של האורגניזם יכולה להיבחן בנפרד על ידי יישום מסכות compartmental. גישה זו נעשתה שימוש כדי לקבוע את זמן מחצית החיים התוך וחוץ-תאיים של חלבוני איתות מופרשים במהלך פיתוח דג הזברה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניסויי FDAP בעוברי דג הזברה. זה צריך להיות אפשרי להשתמש FDAP לקבוע קינטיקה סליקתכל חלבון taggable בכל אורגניזם אופטי נגיש.
Introduction
הרמות של חלבונים בתאים ואורגניזמים נקבעות על ידי תעריפי ייצור שלהם ואישור. זמן מחצית חיים של חלבון יכולים לנוע בין דקות לימים 1-4. בהרבה מערכות ביולוגיות, יש הייצוב או אישור של חלבוני מפתח השפעות חשובות על פעילות הסלולר. אפנון של יציבות חלבון תאית נדרש להתקדמות מחזור התא 5,6, איתות התפתחותית 7-9, אפופטוזיס 10, ותפקוד תקין ותחזוקה של נוירונים 11,12. יציבות חלבון תאית משפיעה על ההתפלגות וזמינות של חלבונים מופרשים, כגון morphogens 13,14, בתוך רקמה.
במהלך העשורים האחרונים, יציבות חלבון בעיקר הוערכה בתרבית תאים באמצעות דופק תיוג הרדיואקטיבי או ניסויי מרדף cycloheximide 15. בניסויי דופק מרדף כזה, תאים או זמניים נחשפו ל" דופק "של אמין רדיואקטיבייםמבשרי חומצה שמשולבים בחלבונים מסונתזים חדש, או שהם נחשפים לcycloheximide, אשר מעכב את סינתזת חלבון. תאים בתרבית ולאחר מכן נאספו בנקודות זמן שונות, וגם immunoprecipitation אחרי autoradiography (בניסויי דופק מרדף רדיואקטיבי) או מערבית סופג (בניסויי cycloheximide) משמשת לכמת את האישור של חלבון לאורך זמן.
יש מבחני יציבות חלבון קונבנציונליים כמה חסרונות. ראשית, חלבונים במבחנים אלה הם בדרך כלל לא באו לידי ביטוי בסביבות אנדוגני, אלא בתרבית רקמה ולעתים בתאים ממינים שונים. לחלבוני יציבותה תלוי קשר, גישה זו היא בעייתית. שנית, לא ניתן לעקוב אחרי שחרור מחלבון בתאים או אורגניזמים בודדים לאורך זמן, והנתונים ממבחנים אלה משקפים ממוצע של אוכלוסיות שונות של תאים בנקודות זמן שונים. מאחר ותאים בודדים אולי התחילועם כמויות שונות של חלבון, אולי לקח את התווית או cycloheximide רדיואקטיביים בזמנים שונים, או שיש לי קינטיקה אישור שונה, נתונים מצרפיים כזה יכולים להיות מטעים. לבסוף, במקרה של ניסויי מרדף cycloheximide, תוספת של מעכב הסינתזה של החלבונים עלולה להיות השפעות פיסיולוגיות בטעות שיכולות לשנות באופן מלאכותי יציבות חלבון 16-18. ניתן להימנע מחסרונות אלה באמצעות הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), טכניקה שמשתמשת בחלבוני photoconvertible למדוד אישור חלבון באופן דינמי באורגניזמים החיים 19-25 (ראה דיון למגבלות של טכניקת FDAP).
חלבוני photoconvertible הם חלבוני ניאון עירור פליטה שהתכונות ולשנות לאחר חשיפה לאורכי גל מסוים של אור 26. גרסה הנפוצה אחת היא Dendra2, חלבון "ירוק-עד-אדום" photoconvertible שתחילה יש לשעברמאפייני ציטוט ופליטה דומים לחלבוני ניאון ירוקים, אבל אחרי חשיפה ל" photoconversion "בהיר UV -its עירור / מאפייני פליטה להיות דומים לאלה של חלבוני ניאון אדומים 23,27. חשוב לציין, החלבון חדש שיוצר לאחר photoconversion לא יהיה לי מאפייני עירור / פליטה זהות לחלבון photoconverted, המאפשר ניתוק של ייצור ואישור על photoconversion והתבוננות רק בריכה של חלבון photoconverted. תיוג חלבוני עניין עם חלבוני photoconvertible כך מספק דרך נוחה לדופק תווית חלבונים באורגניזמים שלמים, אופטי נגישים חיים.
במבחני FDAP (איור 1 א), חלבון של העניין מתויג עם חלבון photoconvertible ובא לידי ביטוי באורגניזם חי (איור 1). חלבון ההיתוך הוא photoconverted, והירידה באות photoconverted לאורך הזמן מנוטרת על ידי fluorescenמיקרוסקופיה ce (איור 1 ג). הנתונים אז מצויד במודל מתאים כדי לקבוע את זמן מחצית החיים של חלבון ההיתוך (1D איור).
Assay FDAP המתואר כאן נועד לקבוע את זמן מחצית החיים תאיים של חלבוני איתות מופרשים בעוברי דג הזברה בעובר מוקדם 19. עם זאת, גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל אורגניזם מודל שקוף שסובל הדמיה לחיות, ויכול לשמש כדי לפקח על הפינוי של כל חלבון תאיים או תאי taggable. וריאציות של הטכניקה המתוארת כאן בוצעו בתאים בתרבית 20,23 ותסיסנית 22 ועכבר 21 עוברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יצירת photoconvertible Fusion לבנות והזרקת Dechorionated עוברי דג הזברה
- צור מבנה פונקציונלי המכיל את החלבון של עניין התמזג חלבון photoconvertible ירוק לאדום (ראה דיון), ולאחר מכן להשתמש שעתוק במבחנה כדי לייצר mRNA כתרים המקודדים את חלבון ההיתוך כמו בMüller et al., 2012 19.
- השתמש pronase להסיר את chorions מכ -30 עוברי דג הזברה בשלב אחד התא. לחלופין, dechorionate ידני עוברים באמצעות מלקחיים 28.
הערה: עוברים יש dechorionated להדמיה הבאה. אם תרצה, ניתן להזריק עובר דרך סיסית וdechorionated מאוחר יותר, רק לפני ההדמיה.- הפוך 5 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של pronase מStreptomyces griseus במדיום עובר דג הזברה סטנדרטי 19. רוק הפתרון בעדינות על RT במשך 10 דקות, כדי לאפשר פרוטאז לפזר. Aliquot מ '2l לתוך צינורות microcentrifuge והקפאה ב -20 ° C.
- העברה עובר שלב אחד תא לזכוכית 5 סנטימטרים קוטר או צלחת פטרי פלסטיק מצופה agarose המכיל ~ 8 מיליליטר בינוני עובר. הוסף 2 מיליליטר של פתרון מניות pronase מופשר למנה ולדגור על RT במשך 5 עד 10 דקות.
- הימנע מחשיפת עוברים לאוויר או פלסטיק, כמו קשר עם או יגרום עוברי dechorionated להתפקע. מלא כוס זכוכית 200 מיליליטר עם מדיום עובר. מעביר את העוברים לכוס על ידי הטיית צלחת פטרי בזמן שהשקיע אותה בטווח הבינוני.
- , לאחר העוברים התיישבו לתחתית של הכוס לשפוך את רוב בינוני העובר, ואז לשפוך בינוני עובר טרי לתוך הכוס. מסתחרר קל של המדיום לשפוך לתוך הכוס גורם לעוברים לאבד chorions נחלש.
- חזור על שלב 1.2.4.
- מעביר את עוברי dechorionated לצלחת הזרקה מצופה agarose 29 בעזרת פיפטה פסטר זכוכית עם טיפ בערה. Flamingטיפ פיפטה מונע קצוות משוננים מעוברים ופצעו.
- Co-להזריק mRNA והמצומד 29,30 3 kDa Alexa488-dextran (איור 1; ראה דיון לmRNA הציע וכמויות Alexa488-dextran). להזריק ישירות למרכז התא (לא החלמון), כדי להבטיח חלוקה שווה של mRNA וצבע פלואורסצנטי פעם המחשוף מתחיל.
הערה: אות Alexa488 תשמש במהלך ניתוח הנתונים כדי ליצור מסכות compartmental כדי להבחין בין תאיים וקרינה תאית. - העברת עוברים הוחדרו ולמצופה agarose 1-2% ממנה שש היטב פלסטיק מלא בינוני עובר. דגירה בחושך על 28 מעלות צלזיוס עד עוברים הגיעו שלב מאוחר תחום 31 (כ 5 שעות לאחר הפריה). בדוק עוברים כל אחד לשעה 2 בסטראו ולהסיר כל פסולת שנוצרה על ידי עוברים שמתו.
2. הרכבה עוברי דג הזברה לPhotoconversion והדמיה על הפוך Confocal מיקרוסקופ
- השתמש סטראו לזהות 04:59 עוברים בריאים, ולהשתמש בפיפטה פסטר זכוכית עם טיפ בערה כדי להסיר אותם מהצלחת.
- בעדינות להוציא את העוברים לתוך צינור המכיל microcentrifuge ~ 1 מיליליטר של 1% נקודת התכה נמוכה agarose נמסה במדיום העובר של 1x Danieau (ראה חומרי רשימה) (איור 2 א).
הערה: Agarose צריך טמפרטורה בין 40 ל 42 מעלות צלזיוס; טמפרטורות גבוהות עלולות לגרום נזק לעוברים. - צייר את העוברים בחזרה לתוך פיפטה יחד עם כמה agarose. בעדינות להוציא את agarose והעוברים על מכסה הזכוכית של צלחת זכוכית תחתונה (איור 2). ודא שעובי זכוכית הכיסוי תואם למטרה על המיקרוסקופ confocal.
- -להשתמש מחדש פיפטה הזכוכית אם תרצה בכך. כדי לנקות את agarose השייר מתוך פיפטה ולמנוע למעלה ולמטה סתימה, במהירות בינוני עובר פיפטה.מניחים צינור 15 מיליליטר מלא ~ 5 מיליליטר של מדיום עובר בסמוך לסטראו למטרה זו.
- השתמש במכשיר מתכת למצב את העוברים כך שמוט בעלי החיים (blastoderm) פונה למכסה זכוכית. לעבוד במהירות מאז agarose יהיה לגבש ב20-30 שניות. השתמש בסטראו לפקח עמדות העוברים ולהתקין מחדש במידת צורך עד agarose מתקשה.
- חזור על שלבים 2.1-2.4 עד המספר הרצוי של עובר כבר רכוב.
הערה: בניסוי טיפוסי, ארבע טיפות agarose המכילות ארבעה או חמישה עוברים כל תתאמנה בקלות על מכסה הזכוכית. ניתן הדמיה כ -16 עוברים במהלך ניסוי אידיאלי יחיד (איור 2 ג). - כאשר agarose יש הקרושה, למלא את צלחת הזכוכית תחתונה עם מדיום העובר של 1x Danieau.
3. Photoconverting ומדידת ירידה של האיתותים photoconverted
מטרת 25x או 40X מים iזה מתאים לגודל ואת מקדם השבירה של עוברי דג הזברה. עדיף להשתמש בשמן טבילה עם אותו מקדמת השבירה כמים ולא מים בפועל, מאז מים יתאדו במהלך הניסוי חמש שעות. ודא ששמן הטבילה נועד לשימוש עם מטרת מים (לא שמן).
- מניחים ירידה גדולה של שמן טבילה במטרה להבטיח שסרט הנפט בין המטרה ומכסה הזכוכית לא ישבור את מהלכי השלב לתפקידים שונים עובר במהלך הדמיה. באופן מאובטח מניח את צלחת הזכוכית תחתונה על הבמה, כך שהמנה לא יזוז כאשר מהלכי השלב. במידת האפשר, להשתמש בבמה מחוממת על 28 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה האופטימלית להתפתחות דג הזברה.
- להגדיר את העמדה של כל עובר בחבילת התוכנה של מיקרוסקופ confocal. התאם את Z- העומק לכל עובר, ותנסה למקד בערך באותו מטוס בכל עובר.
הערה: כ -30 מיקרומטר מקוטב בעלי החיים היא ללכתעומק od מאז בעומק זה יכול להימנע על השכבה העוטפת של העובר, אזור ההדמיה מוגדל, ופיזור אור הוא מינימאלי. פרוסה אופטית יחידה בעובי של 3.3 מיקרומטר ~ מספקת מספיק נתונים; אין צורך לרכוש Z- מחסנית (ראה סעיף 5). - לאסוף שני אותות במהלך הניסוי: אות "ירוקה" מAlexa488-dextran המצומד-אשר ישמש במהלך ניתוח הנתונים כדי לבודד תאית ו תאי הקרינה-ואות "האדומה" מחלבון ההיתוך לאחר שphotoconverted.
- Excite Alexa488 באמצעות לייזר 488 ננומטר, ולאסוף הקרינה נפלטת בין ~ 500 ו- 540 ננומטר. הערה: לאחר photoconversion, רב ירוקה לאדום חלבוני photoconvertible (למשל, Dendra2) יכול להיות נרגשת עם לייזר 543 ננומטר ופולטים הקרינה בין ~ 550 ו -650 ננומטר. להתאים לפי צורך המבוססים על חלבון photoconvertible בשימוש.
- לרכוש "טרום-photoconversion"תמונות, ולהגדיר את התוכנה של מיקרוסקופ confocal לתמונה כל אחת מהעמדות שהוגדרו בעבר (מהשלב 3.2) עם תנאי ההדמיה המתאימים בכל 10 דקות או 20 לקורס זמן של חמש שעות (ראו סעיף 5 ו דיון).
- לphotoconvert חלבון ההיתוך, לעבור למטרת 10X ולחשוף קבוצות של עוברים לאור UV ממנורת קשת כספית עם מסנן ~ 300-400 ננומטר עירור בתפוקה של 100% למשך 2 דקות. להעביר את מרכז הכובד לאורך ציר z כדי לקדם photoconversion האחיד (ראה סעיף 5). ודא ששמן הטבילה לא לטפטף על מטרת 10x במהלך photoconversion.
הערה: ההסטה של מוקד במהלך photoconversion יכולה להיות אוטומטית כדי למנוע השתנות בין הנסיינים. - לחזור למטרת 25x או 40X מייד לאחר photoconversion. ודא שהעמדות שהוגדרו בעבר מהשלב 3.2 עדיין מדויקות. אם הצלחת עברה במהלך photoconversion, להגדיר מחדש את עמדותיהם של העוברים.
- הפעל את התכנית יצרה בשלב 3.4 ומאפשר הדמיה להמשיך ל5 שעות. שים לב לזמן שחלף בין photoconversion ותחילת הדמיה לכל עובר.
- מדי פעם לבדוק בניסוי. לפקח על רמת בינונית של Danieau ולהוסיף עוד אם יש צורך. הפעל מחדש את התוכנה אם הוא נתקע.
- על מנת לקבוע את ערכי הקרינה הרקע שישמשו במהלך ניתוח הנתונים כדי להעריך את אסימפטוטה של מודל באופן אקספוננציאלי יורד, כוללים כמה עוברים שהוזרקו לי mRNA Alexa488-dextran אך לא בניסוי. כדי לקבוע את הרעש של המכשיר, גם אשר ישמש במהלך ניתוח הנתונים שלאחר מכן, לרכוש תמונה בהעדר מדגם.
4. ניתוח נתונים באמצעות PyFDAP
- ראייה לבדוק את ערכות נתונים כמובן זמן מכל עובר. בטל ערכות נתונים מעוברים שמתו במהלך מתאר לעצמיing, שעבר בצורה משמעותית, שיש להם רמות נמוכות מאוד של אות photoconverted, או המכיל אזורים של תאים שנראים יוצא דופן ויש לי הפסיקו לזוז וחלוקת (אופייני של עוברים פגועים או חולים).
הערה: לפעמים, בועות בשמן הטבילה או ממצאים אחרים יופיעו באחד או שתי תמונות בערכת נתונים אחרים שמישה. שים לב כל תמונות המכילות חפצים; הם ייפסל מאוחר יותר, ועדיין ניתן לנתח נקודות הזמן שנותרו ממערכת נתונים כאלה. - השתמש בPyFDAP חבילת תוכנה מבוססת פייתון כדי לנתח את נתוני FDAP. PyFDAP מחשבת מחצית חיים על ידי קביעת עוצמת הקרינה אדומה תאית ותאית הממוצעת בכל תמונה ומתאים את הנתונים עם פונקצית 56 (איור 3) באופן אקספוננציאלי ופוחת.
- הורד PyFDAP (ראה רשימת חומרים).
- השימוש PyFDAP להפריד תאיים ואות photoconverted תאית (איור 3 א ', ב'). שלנודואר אות Alexa488, שהוא תאיים בקפדנות, כדי ליצור מסכה תאית. החל המסכה הזאת לתמונת הערוץ האדומה המתאימה כדי למנוע פיקסלים תאיים מלהיחשב בעת חישוב עוצמת תאית ממוצעת. כדי למדוד עוצמת תאית ממוצעת, להפוך את המסכה.
- בPyFDAP, להציג את התמונות רעולי פנים שנוצרו בשלב 4.2.2. ראייה לבדוק את התמונות האלה וזורקי ערכות נתונים שבמסכות לא מדויקת להבחין תאיות מהחלל תאי (זה צריך להיות נדיר; לציין כי קרום תא כלולים בתמונות שבמרחב תאי כבר רעול פנים, אבל הם יכולים להסיר על ידי שינוי thresholding אלגוריתם או על ידי החדרת מסכת קרום (למשל, באמצעות קרום-CFP)). גם לבטל את כל תמונות בודדות המכילות חפצים (לדוגמא, בועות בשמן הטבילה) שזוהו בשלב 4.1.
- השתמש PyFDAP לחשב עוצמות הקרינה תאיות ו תאית ממוצעת לEACתמונת h. PyFDAP מחשבת ממוצעים אלה על ידי סיכום העוצמות של פיקסלים שנופלים מחוץ למסכה והמפרידה במספר הכולל של פיקסלים סיכמו.
- להתאים את נתוני הקרינה (איור 3 ג) עם הפונקציה מעריכית הבאה:
כאשר t הוא שלאחר photoconversion-הזמן, ג (t) היא עוצמה בערך נתון של t, ג 0 היא העצמה בזמן t = 0, k הוא שיעור המרווח קבוע, ו- y 0 הוא אסימפטוטה שהפונקציה מתקרבת כקרינה יורד (1D איור). y 0 יכול להיות מוגבל על בסיס המדידות בשלב 3.8 19. - השתמש PyFDAP כדי לחשב את זמן מחצית החיים של חלבון התאי ו תאי (τ) מקבועי קצב (k) אישור שימוש ביחסים הבאים:
5. ניסויי בקרה להערכת Photobleaching, שלא במתכוון photoconversion, וphotoconversion אחידות
- photobleaching הערכה
הערה: Photobleaching עלול לגרום ירידת artifactual בעוצמת הקרינה המשקפת את מאפייני ההלבנה של חלבון פלואורסצנטי בנוסף לאישור של החלבון של עניין.- כדי להעריך photobleaching האפשרי, לבצע סט אחד של ניסויי FDAP עם 10 דקות במרווחים בין ההדמיה וסט שני עם 20 דקות במרווחים בין ההדמיה (איור 4). לנתח את הנתונים משני הסטים של ניסויים באמצעות PyFDAP כפי שתואר בסעיף 4.
- השווה את זמן מחצית חיים מהניסויים מרווח דקות 10 ו -20. עוד מחצית חיים מניסויי מרווח 20 דקות מצביעים photobleaching המשמעותי. אם זמן מחצית החיים משני הניסויים זהים, אוריהobleaching הוא לא דאגה משמעותית.
- לחלופין, להעריך photobleaching על ידי רכישת סדרה של 30 ~ תמונות מייד לאחר photoconversion. ירידה משמעותית בעוצמת הקרינה מציינת photobleaching המשמעותי.
- אם photobleaching מזוהה, להשתמש בכוח הלייזר נמוך, לקצר את זמן הדמיה, או לשקול את השימוש בחלבון photoconvertible photostable יותר 32.
- הערכת photoconversion שלא במתכוון.
הערה: Dendra2 ניתן photoconverted באמצעות תאורת 488 ננומטר 27. כאשר Alexa488 המרגש עם לייזר 488 ננומטר כמתואר בשלב 3.3.1, photoconversion שלא במתכוון, ולכן עליית artifactual במחצית-החיים לכאורה של החלבון של עניין הוא אפשרי. עם זאת, אנחנו ואחרים 33 מצאנו כי 488 תאורת ננומטר היא שיטה לא יעילה של photoconversion בעוברי דג הזברה.- השתמש בניסוי השליטה המתואר בשלב 5.1.1 כדי לזהות photoconversion שלא במתכוון. השווה את זמן מחצית חיים מהניסויים מרווח דקות 10 ו -20. זמן מחצית חיים קצרים יותר מניסויי מרווח 20 דקות מצביעים photoconversion שוגג משמעותי. אם זמן מחצית החיים משני הניסויים זהים, שלא במתכוון photoconversion הוא לא דאגה משמעותית.
- אם photoconversion שוגג מזוהה, השתמש חשמל נמוך יותר 488 ננומטר לייזר ופעמים הדמיה קצרות יותר, כדי למנוע בטעות photoconverting Dendra2.
- הערכת אחידות photoconversion.
הערה: אם photoconversion מוטה לכיוון קוטב בעלי החיים של העובר, הירידה בקרינה תושפע דיפוזיה חלבון או תנועת תא למטוסים עמוקים (איור 5 א).- כדי לקבוע אם photoconversion הוא אחיד, להביע את חלבון מופרש photoconvertible (לניסויים עם חלבוני היתוך תאיים) או חלבון cytoplasmic photoconvertible (לניסויים עם חלבוני היתוך תאיים). Photoconvert כרגיל, tתרנגולת לרכוש Z- מחסנית המקיפה ביותר של blastoderm כל 20 דקות במשך 80 דקות.
- אם photoconversion מוטה לכיוון קוטב בעלי החיים, את עוצמת הקרינה במטוסים עמוקים יותר תגדיל לאורך זמן עקב דיפוזיה או תנועת תא (איור 5). אם photoconversion לא האחיד מזוהה, להתמקד עמוק יותר לתוך העוברים במהלך photoconversion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FDAP נעשה שימוש כדי לקבוע את זמן מחצית החיים של חלבוני איתות תאיים בעוברי דג הזברה 19. אחד מחלבונים אלו, פזילה, גורמת ביטוי של גני mesendodermal במהלך embryogenesis 34. לפזול-Dendra2 מפעיל ביטוי של גני mesendodermal ברמות דומות לפזילה לא מתויגת, כפי שהודגם על ידי qRT-PCR ובמבחני הכלאה באתר 19. עוברים היו שיתוף הזריקו עם Alexa488-dextran וmRNA קידוד פזילה-Dendra2 ונתונים לassay FDAP. ירידה בעוצמת אות photoconverted תאית לאורך הזמן היא (איור 4 א) ברור. פרופילי עוצמת תאיים מ -23 עוברים שנוצרו באמצעות PyFDAP. נתונים שהתקבלו היה מצויד בPyFDAP עם מודל קינטיקה פינוי מסדר ראשון, וk ממוצע שיעור מרווח קבוע של 1.00 x 10 -4 / sec, המקביל לτ מחצית חיים ממוצע של 116 דקות, נקבע. פרופיל עוצמה דומהקבועים של ושיעור המרווח התקבלו כאשר המרווחים בין ההדמיה היו 10 או 20 דקות, המצביעים על כך photoconversion photobleaching או שלא במתכוון לא תרם באופן משמעותי לשינויים בעוצמה (איור 4).
איור 1. הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP) סקירה. () Workflow של ניסוי FDAP. הזרקה (B) של mRNA וצבע ניאון לעובר דג הזברה בשלב אחד התא. חלבון המופק מmRNA כעובר מתפתח במשך כ -5 שעות לפני ההדמיה. צבע תוויות בתאים (עיגולים ירוקים). (C) חלבון ההיתוך הוא photoconverted באמצעות דופק UV, והירידה בעוצמת אות photoconverted לאורך הזמן היא פיקוח. (ד) נתונים מצוידים בירידה אקספוננציאלית פונקציה להשיג קבועי קצב (k) אישור וזמן מחצית חיים (τ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עוברי איור 2. הרכבה דג הזברה לניסויי FDAP. () עוברי דג הזברה (blastoderm = לבן, חלמון = שחור) מועברים ממדיום עובר (כחול) לנמס agarose (צהוב). (ב) עוברים וagarose ממוקמים על מכסה הזכוכית של צלחת זכוכית תחתונה. לאחר מכן עוברים ממוקמים באופן ידני, כך שמוט בעלי החיים פונה למכסה זכוכית. חתך של צלחת זכוכית תחתונה מוצג. סקירה סכמטי של צלחת זכוכית תחתונה עם מספר טיפות agarose המכילות ארבעה עוברים כל (תצוגה מסתכלת למטה לתוך הצלחת) (C)."Target =" w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניתוח נתונים באמצעות PyFDAP. () PyFDAP משתמש באלגוריתם thresholding Otsu 35 ליצירת מסכות התוך וחוץ-תאיות מהאות תאית Alexa488 (הירוקה). אות photoconverted (אדום) (ב) מעובר לבטא חלבון היתוך Dendra2 מופרש (פוזל-Dendra2 19). עוצמות הקרינה חוּץ והתאיות ממוצעת חושבו באמצעות המסכות שמוצג (A). החלל החיצוני של העובר הוצא מחישובים אלה על ידי השלכת פיקסלים מחוץ לעיגול הצהוב. (CIR השחור (C) PyFDAP צילום מסך בו מוצגות נתוני עוצמת תאיים מניסוי FDAPcles) מצויד בפונקציה אקספוננציאלית יורדת (קו אדום מקווקו). מחצית החיים תאיים מצויינים על ידי החץ האדום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. נציגי תוצאות FDAP. (א) העובר נציג להביע מופרש פזילה-Dendra2 רק לפני photoconversion (שמאל קיצוני) ו- 27, 87, ולאחר photoconversion-287 דקות. (ב) כדי לשלוט על photobleaching וphotoconversion שלא במתכוון (ראה סעיף 5), ניסויים עם 10 או 20 דקות במרווחים בוצעו (נתונים ממולר et al., 2012 19). בPyFDAP, פרופילי עוצמת תאיים נוצרו, מצויד בפונקציות באופן אקספוננציאלי יורדות, ומנורמל על ידי subtracטינג y 0 הערך המצויד מכל נקודת נתונים ומפרידים ידי המצויד ג 0 ערך. נתונים מ-10 דקות (השחורה, n = 11) ו -20 דקות (כחול, n = 12) ניסויי מרווח היו אז בממוצע, בהתאמה. ברים שגיאה מצביעים סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. הערכת אחידות photoconversion. () Photoconversion לא אחיד של חלבון תאי יכול להוביל למחצית חיים קצרים לכאורה בטעות אם חלבון photoconverted מתמוסס לתוך מטוסים עמוקים יותר לאורך זמן. (ב) כדי לקבוע אם photoconversion הוא אחיד, Z- מחסנית המכסה את רוב blastoderm נרכש בכמה נקודות זמן פוסט-photoconversיון. עוצמת הקרינה תגדל במטוסים עמוקים יותר לאורך זמן אם photoconversion היה לא אחיד (שים לב שפיזור אור גורם למטוסים עמוקים יותר להופיע עמום יותר מטוסים גבוהים יותר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההצלחה של ניסוי FDAP מסתמכת על הדור של חלבון היתוך photoconvertible פונקציונלי. תיוג חלבון יכול להשפיע על פעילותה הביולוגית ו / או נכסי biophysical, כוללים הלוקליזציה שלה, מסיסות, ויציבות 36-41. להיות מוכן לבחון את הפעילות של כמה מבני היתוך שונים כדי למצוא אחד שהוא פעיל. מצאנו כי שינוי המיקום של photoconvertible החלבון ביחס לחלבון של עניין או באמצעות linkers הארוך יותר (לדוגמא, באמצעות LGDPPVAT רצף החומצות האמיניות 19) יכול לשפר את הפעילות של חלבון ההיתוך. במקרה של חלבוני איתות, הפעילות של חלבון ההיתוך יכולה להיקבע על ידי בדיקת יכולתה כדי לגרום לביטוי של גני המטרה 19. qRT-PCR או הכלאה באתר לספק קריאות טובות של ביטוי גן המטרה 19. שימו לב כי הפרוטוקול המתואר כאן נועד לקבוע את היציבות של חלבוניםבעובר דג הזברה המוקדם וידרוש שינוי להעריך את יציבות חלבון בהקשרים אחרים.
חלבון photoconvertible הירוק לאדום Dendra2 27 שמש בהצלחה בניסויי FDAP דג הזברה 19 (איור 4), אבל אפשרויות אחרות הן 26,42 זמינים. כדי להימנע מחפצים פוטנציאליים עקב צבירה של חלבון ההיתוך, לבחור חלבון photoconvertible monomeric. חלבוני Photoactivatible יכול לשמש גם בFDAP מבחני 20-22,26.
לפני ביצוע ניסוי FDAP, מספר היבטים של הפרוטוקול צריכים להיות מותאמים. להזריק כמויות שונות של mRNA כדי לקבוע את הסכום הנמוך ביותר שמספק אות שמיש לאחר photoconversion; ~ 50 mRNA pg הוא סכום התחלה טוב. על מנת ליצור מסכות compartmental משמעותיות (איור 3), אות Alexa488 חייבת להיות בהירה מספיק ללהתחרות נגד האות מחלבון ההיתוך לא-photoconverted כי הוא מיוצר כל הזמן מmRNA המוזרק; להזריק בין 0.2 ל -4 ng של Alexa488-dextran למצוא את הכמות האופטימלית של צבע פלואורסצנטי. מצא את תנאי הדמיה שלאחר ההמרה האופטימלית ולהשתמש באותם תנאים לכל הניסויים עם מבנה נתון. השתמש בהדמיה כמותי טובה מתרגל 43, ולבחור טווח דינמי מתאים כדי למנוע פיקסלים רוויים במסלול האדום. לקבוע את מרווח ההדמיה המתאים לכל חלבון היתוך. חלבונים עם מחצית חיים קצרים מאוד עשויים לדרוש הדמיה תכופה יותר על כולל פרק זמן קצר יותר. להקים את טכניקת photoconversion האופטימלית המבוססת על האורגניזם וחלבון photoconvertible בשימוש. אנו מתארים שיטת photoconversion חזקה אחד באמצעות מנורת קשת כספית בשלב 3.5, אבל Dendra2 יכול גם להיות photoconverted עם לייזר 405 33 או 488 ננומטר 27.
li אחדmitation של פרוטוקול FDAP זה הוא שביטוי יתר של החלבון של העניין נדרש. ביטוי יתר עלול להשפיע על יציבות חלבון, למשל, דרך ביטוי חריג של גנים אחרים שמשנים קינטיקה האישור של החלבון 14,44. אם החלבון של עניין היא מולקולת איתות, לשקול ביצוע ניסויים בנוכחות מעכב איתות כדי לקבוע אם חוסם ביטוי של גני המטרה משפיעה על יציבות חלבון. בעתיד, ייתכן שניתן ליצור עוברים מהונדסים מבטא שילובי photoconvertible תחת השליטה של אלמנטי ביטוי אנדוגני 45-50. אם עובר מהונדס לייצר אות מספיק, ניסויי FDAP בהקשר שאינו מתקבלים על הדעת הם ביטוי יתר, אולי באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון להתבונן ירידת הקרינה בכל העובר 51.
יישומים אפשריים נוספים של FDAP כוללים חוקרים את מנגנוני that להסדיר יציבות חלבון על ידי בחינת ההשפעות של הפרעות שונות (לדוגמא, ביטוי של פרוטאזות המשוערת) או שינויי חלבון (לדוגמא, זירחון) על יציבות. לדוגמא, גורמי השליטה היציבות תאית של הפזילה אינם ידועים כרגע. אותות התפתחותיים מופרשים רבים הפנימו על ידי תאים 52-55, אשר יכול לתרום לשחרורו של הפזילה וligands האחר ממרחב החוץ תאי. ניסויי FDAP בי הפנמה חסומה עשויים לספק מידע על מנגנוני שליטה אישור חלבון תאי.
בניגוד למבחנים מקובלים למדידת יציבות חלבון 15, FDAP מציע אלטרנטיבה מבוססת מיקרוסקופיה בי האישור של חלבונים יכול להיות במעקב לאורך זמן בתוך אורגניזמים חיים. שיטות דומות שימשו כדי לפקח על פינוי חלבון במערכות מודל אחרים מאשר עוברי דג הזברה 2023. יש פרוטוקול זה FDAP הפוטנציאל להיות מותאם כדי לקבוע את זמן מחצית החיים של כל חלבון taggable במערכות ביולוגיות שבו ההדמיה חיה אינה ריאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אי לנו קונפליקטים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לג'פרי פארל, ג'יימס גניון, וג'ניפר ברגמן להערות על כתב היד. KWR נתמכה על ידי קרן מדע בוגר תכנית עמיתי המחקר הלאומית במהלך הפיתוח של assay FDAP. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מ- NIH לAFS ועל ידי מענקים מקרן המחקר הגרמנית (Emmy תכנית נטר), מקס פלאנק החברה, והתכנית לאדם Frontier המדע (פיתוח קריירה פרס) לראש הממשלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Life Technologies | AM1340 | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | |
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage |
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use |
| Glass Pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos |
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 |
| 15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium | BD Falcon | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | |
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25X or 40X water objective | Objective for imaging | ||
| 10X air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
- Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O'Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Parry, D. H., O'Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
- Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
- Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
- MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
- Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
- Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
- Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
- Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
- Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
- Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
- Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
- Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
- Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
- Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
- Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
- Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
- Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
- Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
- Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
- Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
- Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
- Bläßle, A., Müller, P. PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, forthcoming (2014).
