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Developmental Biology

Photoconversion के बाद प्रतिदीप्ति क्षय का प्रयोग लिविंग zebrafish भ्रूण में प्रोटीन स्थिरता मापने (FDAP)

Published: January 28, 2015 doi: 10.3791/52266
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society

Summary

कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन का स्तर अक्सर कसकर प्रोटीन के उत्पादन और निकासी का संतुलन द्वारा विनियमित रहे हैं। Photoconversion (FDAP) के बाद प्रतिदीप्ति क्षय का प्रयोग, प्रोटीन की निकासी कैनेटीक्स प्रयोगात्मक विवो में मापा जा सकता है।

Abstract

प्रोटीन स्थिरता जीव विज्ञान के कई पहलुओं को प्रभावित करती है, और प्रोटीन की निकासी कैनेटीक्स को मापने जैविक प्रणालियों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। FDAP प्रयोगों में, रहने वाले जीवों के भीतर प्रोटीन की निकासी मापा जा सकता है। ब्याज की एक प्रोटीन, एक photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग विवो में व्यक्त किया और photoconverted, और समय के साथ photoconverted संकेत में कमी नजर रखी है। डेटा तो प्रोटीन आधा जीवन को निर्धारित करने के लिए एक उचित निकासी मॉडल के साथ फिट है। महत्वपूर्ण बात है, जीव के विभिन्न डिब्बों में प्रोटीन आबादी की निकासी कैनेटीक्स पूरक मास्क लगाने से अलग से जांच की जा सकती है। यह दृष्टिकोण zebrafish विकास के दौरान स्रावित संकेत प्रोटीन की intra- और बाह्य आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ, हम zebrafish भ्रूण में FDAP प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। यह की निकासी कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए FDAP उपयोग करने के लिए संभव होना चाहिएकिसी भी ऑप्टिकली सुलभ जीव में किसी भी taggable प्रोटीन।

Introduction

कोशिकाओं और जीवों में प्रोटीन के स्तर पर उत्पादन और निकासी की उनके दरों से निर्धारित होते हैं। प्रोटीन आधा जीवन मिनट से दिनों 1-4 तक हो सकती है। कई जैविक प्रणालियों में, कुंजी प्रोटीन का स्थिरीकरण या निकासी सेलुलर गतिविधि पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इंट्रासेल्युलर प्रोटीन स्थिरता के मॉड्यूलेशन कोशिका चक्र प्रगति 5,6, विकासात्मक संकेतन 7-9, apoptosis के 10, और सामान्य कार्य और न्यूरॉन्स 11,12 के रखरखाव के लिए आवश्यक है। कोशिकी प्रोटीन स्थिरता एक ऊतक के भीतर वितरण और ऐसे morphogens 13,14 के रूप में स्रावित प्रोटीन की उपलब्धता को प्रभावित करता है।

पिछले कुछ दशकों में, प्रोटीन स्थिरता मुख्य रूप से रेडियोधर्मी पल्स-लेबलिंग या cycloheximide पीछा प्रयोगों 15 का उपयोग करते हुए सेल संस्कृति में मूल्यांकन किया गया है। ऐसे पल्स-पीछा प्रयोगों में, कोशिकाओं या तो क्षणिक एक रेडियोधर्मी अमीनो की "पल्स" को उजागर कर रहे हैंएसिड व्यापारियों नए संश्लेषित प्रोटीन में शामिल कर रहे हैं, या वे प्रोटीन संश्लेषण को रोकता है जो cycloheximide, को उजागर कर रहे हैं। संवर्धित कोशिकाओं तो अलग समय बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं, और या तो (रेडियोधर्मी पल्स-पीछा प्रयोगों में) autoradiography द्वारा पीछा immunoprecipitation या (cycloheximide प्रयोगों में) सोख्ता पश्चिमी समय के साथ प्रोटीन की निकासी यों के लिए प्रयोग किया जाता है।

परम्परागत प्रोटीन स्थिरता assays के कई कमियों है। सबसे पहले, इन assays में प्रोटीन अक्सर अपने अंतर्जात वातावरण में व्यक्त नहीं कर रहे हैं, बल्कि विभिन्न प्रजातियों से कोशिकाओं में टिशू कल्चर में है और कभी कभी। जिसका स्थिरता संदर्भ पर निर्भर है प्रोटीन के लिए, इस दृष्टिकोण समस्याग्रस्त है। दूसरा, यह समय के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं या जीवों में प्रोटीन निकासी का पालन करने के लिए संभव नहीं है, और इन assays से डेटा अलग समय बिंदुओं पर कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के एक औसत को दर्शाता है। व्यक्ति की कोशिकाओं शुरू हो सकता है के बाद सेप्रोटीन के विभिन्न मात्रा के साथ, अलग अलग समय पर रेडियोधर्मी लेबल या cycloheximide ले लिया है हो सकता है, या अलग निकासी कैनेटीक्स, इस तरह कुल डेटा को गुमराह किया जा सकता है हो सकता है। अंत में, cycloheximide पीछा प्रयोगों के मामले में, प्रोटीन संश्लेषण अवरोध करनेवाला के अलावा कृत्रिम रूप से प्रोटीन स्थिरता 16-18 बदल सकता है कि अनायास ही मनोवैज्ञानिक प्रभाव पड़ सकता है। इन कमियों को, photoconversion (FDAP) के बाद photoconvertible प्रोटीन जीवों 19-25 जीने में गतिशील रूप से प्रोटीन निकासी को मापने के लिए इस्तेमाल करता है कि एक तकनीक प्रतिदीप्ति क्षय का उपयोग करके बचा जा सकता है (FDAP तकनीक की सीमाओं के लिए चर्चा देखें)।

Photoconvertible प्रोटीन जिसका उत्तेजना और उत्सर्जन गुण प्रकाश 26 के विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के लिए जोखिम के बाद बदल फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते हैं। एक आमतौर पर इस्तेमाल किया संस्करण Dendra2, शुरू में पूर्व की है कि एक "हरी-टू-लाल" photoconvertible प्रोटीन हैप्रशस्ति पत्र और उत्सर्जन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए इसी तरह की संपत्ति है, लेकिन यूवी प्रकाश "photoconversion" को प्रदर्शन के बाद उत्तेजना -its / उत्सर्जन गुण लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन 23,27 के समान हो गया है। महत्वपूर्ण बात है, photoconversion के बाद का उत्पादन नए प्रोटीन photoconverted प्रोटीन का केवल एक पूल के photoconversion पर उत्पादन और निकासी की decoupling और अवलोकन की अनुमति है, photoconverted प्रोटीन के रूप में एक ही उत्तेजना / उत्सर्जन गुण नहीं होगा। Photoconvertible प्रोटीन के साथ ब्याज की प्रोटीन टैगिंग इस प्रकार पल्स-लेबल को बरकरार, ऑप्टिकली सुलभ रहने वाले जीवों में प्रोटीन एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है।

FDAP assays के (चित्रा 1 ए) में, ब्याज की एक प्रोटीन एक photoconvertible प्रोटीन के साथ टैग है और एक जीवित जीव (चित्रा 1 बी) में व्यक्त की है। संलयन प्रोटीन photoconverted है, और समय के साथ photoconverted संकेत में कमी fluorescen द्वारा नजर रखी हैसीई माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1C)। डेटा तो संलयन प्रोटीन (चित्रा -1) के आधे जीवन को निर्धारित करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल के साथ फिट है।

यहाँ वर्णित FDAP परख जल्दी embryogenesis 19 के दौरान zebrafish भ्रूण में स्रावित संकेत प्रोटीन की कोशिकी आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए डिजाइन किया गया था। हालांकि, इस दृष्टिकोण रहते इमेजिंग बर्दाश्त, और किसी भी taggable इंट्रासेल्युलर या बाह्य प्रोटीन की निकासी पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि किसी भी पारदर्शी मॉडल जीव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यहाँ वर्णित तकनीक के बदलाव संवर्धित कोशिकाओं 20,23 और ड्रोसोफिला 22 और माउस 21 भ्रूण में प्रदर्शन किया गया है।

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Protocol

1. एक Photoconvertible फ्यूजन का निर्माण और इंजेक्शन dechorionated zebrafish भ्रूण सृजन

  1. तो मुलर एट अल।, 2012 19 में के रूप में संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग छाया mRNA के उत्पन्न करने के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन का उपयोग करें, एक हरे रंग-टू-लाल photoconvertible प्रोटीन (चर्चा देखें) से जुड़े हुए ब्याज की प्रोटीन युक्त एक कार्यात्मक निर्माण उत्पन्न करता है।
  2. एक सेल चरण में लगभग 30 zebrafish भ्रूण से chorions दूर करने के लिए pronase का प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल रूप से संदंश 28 का उपयोग कर भ्रूण dechorionate।
    नोट: भ्रूण बाद इमेजिंग के लिए dechorionated किया जाना चाहिए। अगर वांछित, भ्रूण इमेजिंग के लिए बस से पहले, बाद में जरायु के माध्यम से इंजेक्शन और dechorionated जा सकता है।
    1. मानक zebrafish भ्रूण मध्यम 19 में Streptomyces griseus से pronase के 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान करें। 10 मिनट प्रोटीज को भंग करने की अनुमति देने के लिए धीरे आरटी पर समाधान रॉक। विभाज्य 2 मीटर-20 डिग्री सेल्सियस पर microcentrifuge ट्यूबों में एल और फ्रीज।
    2. ~ 8 मिलीलीटर भ्रूण मध्यम युक्त एक 5 सेमी व्यास गिलास या agarose लेपित प्लास्टिक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण एक सेल चरण भ्रूण। डिश के लिए thawed pronase शेयर समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 5 से 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    3. Dechorionated भ्रूण टूटना करने के लिए कारण होगा किसी के साथ संपर्क के रूप में, हवा या प्लास्टिक के लिए भ्रूण को उजागर करने से बचें। भ्रूण मध्यम के साथ एक 200 एमएल कांच बीकर भरें। मध्यम में यह जलमग्न जबकि पेट्री डिश झुकने से बीकर भ्रूण स्थानांतरण।
    4. भ्रूण बीकर के नीचे करने के लिए तय हो चुका है, के बाद फिर बीकर में ताजा भ्रूण मध्यम डालना, भ्रूण मध्यम के सबसे उंडेल। बीकर में डालने के लिये मध्यम के हल्के घूमता भ्रूण उनके कमजोर chorions खोने के लिए कारण बनता है।
    5. दोहराएँ चरण 1.2.4।
  3. एक flamed टिप के साथ एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग कर एक agarose में लिपटे इंजेक्शन पकवान 29 dechorionated भ्रूण स्थानांतरण। ज्वलंतविंदुक टिप घायल भ्रूण से दांतेदार किनारों से बचाता है।
  4. (चित्रा 1 बी, सुझाव mRNA और Alexa488-dextran मात्रा के लिए चर्चा देखें) mRNA और एक 3 केडीए Alexa488-dextran के रूप साधना 29,30 सह इंजेक्षन। दरार शुरू एक बार भी mRNA की वितरण और फ्लोरोसेंट रंजक सुनिश्चित करने के लिए सेल (नहीं जर्दी) के केंद्र में सीधे इंजेक्षन।
    नोट: Alexa488 संकेत intracellular और बाह्य प्रतिदीप्ति के बीच भेद करने के क्रम में पूरक मास्क उत्पन्न करने के लिए डेटा विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा।
  5. भ्रूण माध्यम से भरा एक छह अच्छी तरह से प्लास्टिक पकवान की एक 1-2% agarose लेपित अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण इंजेक्शन भ्रूण। भ्रूण देर क्षेत्र चरण 31 (लगभग 5 घंटा बाद निषेचन) तक पहुँच चुके हैं, जब तक 28 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेते हैं। एक stereomicroscope के तहत भ्रूण हर एक से 2 घंटा की जाँच करें और मर गया है कि भ्रूण के द्वारा उत्पन्न किसी भी मलबे को हटा दें।

2. P के लिए zebrafish भ्रूण बढ़तेएक औंधा confocal खुर्दबीन पर hotoconversion और इमेजिंग

  1. 04:59 स्वस्थ भ्रूण की पहचान है, और पकवान से उन्हें हटाने के लिए एक flamed टिप के साथ एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए एक stereomicroscope का प्रयोग करें।
  2. धीरे 1x Danieau के भ्रूण मध्यम में पिघल 1% कम पिघलने बिंदु agarose की ~ 1 मिलीग्राम से युक्त एक microcentrifuge ट्यूब में भ्रूण बेदखल (2A चित्रा) (सामग्री की सूची देखें)।
    नोट: Agarose 40 और 42 डिग्री सेल्सियस के बीच एक तापमान होना चाहिए; उच्च तापमान भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकता है।
  3. कुछ agarose के साथ साथ वापस पिपेट में भ्रूण ड्रा। धीरे से एक गिलास नीचे पकवान (चित्रा 2 बी) के कवर कांच पर agarose और भ्रूण बाहर निकालें। कवर कांच की मोटाई confocal खुर्दबीन पर उद्देश्य के साथ संगत है सुनिश्चित करें।
    1. अगर वांछित गिलास पिपेट का फिर से उपयोग। पिपेट से बाहर अवशिष्ट agarose के लिए स्वच्छ और ऊपर और नीचे जल्दी clogging है, पिपेट भ्रूण मध्यम रोकने के लिए।अगले इस उद्देश्य के लिए stereomicroscope के लिए भ्रूण माध्यम से ~ 5 मिलीलीटर से भरा एक 15 मिलीलीटर ट्यूब रखें।
  4. पशु ध्रुव (blastoderm) कवर कांच का सामना कर रहा है, ताकि भ्रूण की स्थिति के लिए एक धातु की जांच का प्रयोग करें। Agarose 20-30 सेकंड में स्थिर करना होगा, क्योंकि जल्दी से काम करते हैं। भ्रूण की स्थिति पर नजर रखने और agarose मज़बूत बनाता है जब तक के रूप में आवश्यक मरम्मत करने के लिए stereomicroscope का प्रयोग करें।
  5. भ्रूण की वांछित संख्या मुहिम शुरू की गई है जब तक दोहराएँ 2.1-2.4 कदम।
    ध्यान दें: एक ठेठ प्रयोग में, चार या पांच भ्रूण प्रत्येक युक्त चार agarose बूँदें कांच कवर पर आसानी से फिट होगा। के बारे में 16 भ्रूण एक भी आदर्श प्रयोग (चित्रा -2) के दौरान imaged किया जा सकता है।
  6. Agarose जम गया है, 1x Danieau के भ्रूण मध्यम के साथ गिलास नीचे पकवान भरें।

3. Photoconverting और Photoconverted सिग्नल की कमी मापने

एक 25x या 40X पानी उद्देश्य मैंआकार और zebrafish भ्रूण का अपवर्तनांक के लिए उपयुक्त है। पानी पांच घंटे प्रयोग के दौरान लुप्त हो जाएगा, क्योंकि यह पानी के बजाय वास्तविक पानी के रूप में एक ही अपवर्तक सूचकांक के साथ विसर्जन के तेल का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है। विसर्जन के तेल में एक पानी नहीं है (तेल) उद्देश्य के साथ इस्तेमाल किया जा बनाया गया है कि यह सुनिश्चित करें।

  1. उद्देश्य और गिलास को कवर के बीच तेल फिल्म इमेजिंग के दौरान विभिन्न भ्रूण पदों के लिए मंच चाल के रूप में नहीं टूटेगा यह सुनिश्चित करने के उद्देश्य पर विसर्जन के तेल की एक बड़ी गिरावट रखें। डिश जब मंच चालें बदलाव नहीं होगा तो यह है कि सुरक्षित रूप से मंच पर गिलास नीचे पकवान जगह है। यदि संभव हो तो, 28 डिग्री सेल्सियस, zebrafish विकास के लिए अधिकतम तापमान में एक गर्म मंच का उपयोग करें।
  2. Confocal खुर्दबीन के सॉफ्टवेयर पैकेज में प्रत्येक भ्रूण की स्थिति को परिभाषित करें। प्रत्येक भ्रूण के लिए Z गहराई से समायोजित करें, और प्रत्येक भ्रूण में लगभग एक ही विमान को लक्षित करने के लिए प्रयास करते हैं।
    नोट: के बारे में 30 माइक्रोन पशु पोल से एक जाना हैभ्रूण के घेर परत बचा जा सकता है इस गहराई में के बाद से आयुध डिपो गहराई, इमेजिंग क्षेत्र को बड़ा किया जाता है, और रोशनी बिखरने कम है। ~ 3.3 माइक्रोन की मोटाई के साथ एक ऑप्टिकल टुकड़ा पर्याप्त डेटा प्रदान करता है; एक z ढेर (धारा 5 देखें) प्राप्त करने के लिए कोई जरूरत नहीं है।
  3. प्रयोग के दौरान दो संकेतों लीजिए: Alexa488-dextran से "हरी" संकेत साधना-जो यह photoconverted होने के बाद बाह्य और intracellular प्रतिदीप्ति और संलयन प्रोटीन से "लाल" संकेत को अलग-थलग करने के लिए डेटा विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा।
    1. एक 488 एनएम लेजर का उपयोग Alexa488 उत्तेजित, और ~ 500 और 540 एनएम के बीच उत्सर्जित प्रतिदीप्ति इकट्ठा। नोट: photoconversion के बाद, कई हरे-टू-लाल photoconvertible प्रोटीन (जैसे, Dendra2) एक 543 एनएम लेजर के साथ उत्साहित किया और ~ 550 और 650 एनएम के बीच प्रतिदीप्ति उत्सर्जन कर सकते हैं। इस्तेमाल किया photoconvertible प्रोटीन के आधार पर आवश्यक के रूप में समायोजित करें।
  4. मोल "पूर्व photoconversion"छवियों, और छवि के लिए उपयुक्त इमेजिंग शर्तों के साथ (3.2 कदम से) पहले से परिभाषित पदों में से प्रत्येक confocal खुर्दबीन के सॉफ्टवेयर को विन्यस्त एक पांच घंटे का समय पाठ्यक्रम के लिए हर 10 या 20 मिनट (धारा 5 देखते हैं और चर्चा)।
  5. संलयन प्रोटीन photoconvert करने के लिए, 2 मिनट के लिए 100% उत्पादन में एक ~ 300-400 एनएम उत्तेजना फिल्टर के साथ एक पारा चाप दीपक से पराबैंगनी प्रकाश में भ्रूण के समूहों के एक 10x उद्देश्य के लिए स्विच और बेनकाब। । वर्दी photoconversion (धारा 5 देखें) को बढ़ावा देने के लिए Z अक्ष के साथ फोकस शिफ्ट विसर्जन के तेल photoconversion दौरान 10x उद्देश्य पर ड्रिप नहीं है यह सुनिश्चित।
    नोट: photoconversion के दौरान ध्यान देने का स्थानांतरण प्रयोगकर्ताओं के बीच परिवर्तनशीलता से बचने के लिए स्वचालित किया जा सकता है।
  6. तुरंत photoconversion के बाद वापस 25x या 40x उद्देश्य के लिए स्विच। 3.2 कदम से पहले से परिभाषित पदों पर अभी भी सही कर रहे हैं सुनिश्चित करें। पकवान photoconv दौरान स्थानांतरित कर दिया हैंersion, भ्रूण की स्थिति को फिर से परिभाषित करते हैं।
    1. 3.4 कदम में बनाया कार्यक्रम शुरू करने और इमेजिंग 5 घंटे के लिए जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं। Photoconversion और प्रत्येक भ्रूण के लिए इमेजिंग की शुरुआत के बीच गुजरे समय ध्यान दें।
  7. कभी कभी प्रयोग पर जाँच करें। Danieau के माध्यम के स्तर की निगरानी और यदि आवश्यक हो तो और अधिक जोड़ने। यह रुक गई है अगर सॉफ्टवेयर पुनरारंभ करें।
  8. एक तेजी से घटते मॉडल की asymptote अनुमान लगाने के लिए डेटा विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा कि पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मूल्यों को निर्धारित करने के लिए, प्रयोग में Alexa488-dextran के नहीं बल्कि mRNA के इंजेक्शन के साथ किया गया है कि कुछ भ्रूण शामिल हैं। यह भी बाद में डेटा विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा जो साधन शोर, यह निर्धारित करने के लिए, एक नमूना के अभाव में एक छवि अधिग्रहण।

4. PyFDAP का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण

  1. दिखने में प्रत्येक भ्रूण से समय बेशक डेटा सेट का निरीक्षण किया। Imag के दौरान मृत्यु हो गई है कि भ्रूण से डेटा सेट त्यागेंphotoconverted संकेत का स्तर बहुत कम है, या कि असामान्य लग रही है और चलती है और (घायल या बीमार भ्रूण की विशिष्ट) विभाजित बंद कर दिया है कि कोशिकाओं के क्षेत्रों में होते हैं कि काफी स्थानांतरित कर दिया है कि आईएनजी,।
    नोट: कभी-कभी, विसर्जन के तेल में बुलबुले या अन्य कलाकृतियों एक अन्यथा प्रयोग करने योग्य डेटा सेट में एक या दो छवियों में दिखाई देगा। कलाकृतियों होते हैं कि किसी भी चित्र नोट; वे बाद में खारिज कर दिया जाएगा, और इस तरह के एक डेटा सेट से शेष समय बिंदुओं अभी भी विश्लेषण किया जा सकता है।
  2. FDAP डेटा का विश्लेषण करने के लिए अजगर आधारित सॉफ्टवेयर पैकेज PyFDAP का प्रयोग करें। PyFDAP प्रत्येक छवि में औसत intracellular और बाह्य लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण करने और एक तेजी से घटते समारोह 56 (चित्रा 3) के साथ डाटा फिटिंग द्वारा आधा जीवन खरीदते हैं।
    1. PyFDAP डाउनलोड करें (देखें माल की सूची)।
    2. इस्तेमाल की PyFDAP intracellular और बाह्य photoconverted संकेत (चित्रा 3 ए, बी) को अलग करने के लिए। हमेंएक intracellular मुखौटा बनाने के लिए, सख्ती से इंट्रासेल्युलर है जो Alexa488 संकेत, ई। औसत कोशिकी तीव्रता की गणना करते समय विचार किया जा रहा से इंट्रासेल्युलर पिक्सल को रोकने के लिए इसी लाल चैनल की छवि के लिए यह मुखौटा लागू करें। औसत इंट्रासेल्युलर तीव्रता मापने के लिए, मुखौटा पलटना।
    3. PyFDAP में कदम 4.2.2 में उत्पन्न नकाबपोश चित्र प्रदर्शित। दिखने में इन छवियों का निरीक्षण किया और मास्क सही रूप में बाह्य अंतरिक्ष से इंट्रासेल्युलर (इस दुर्लभ होना चाहिए अंतर नहीं है, जिसमें डेटा सेट त्यागने;, कि कोशिका झिल्ली बाह्य अंतरिक्ष नकाबपोश किया गया है, जिसमें छवियों में शामिल कर रहे हैं ध्यान दें, लेकिन वे thresholding फेरबदल से हटाया जा सकता है एल्गोरिथ्म या एक झिल्ली मुखौटा शुरू करने से (उदाहरण के लिए, का उपयोग कर झिल्ली-सी एफ पी))। इसके अलावा कदम 4.1 में पहचान की कलाकृतियों (जैसे, विसर्जन के तेल में बुलबुले) युक्त किसी भी एकल छवियों त्यागें।
    4. पूर्वी वायु कमान के लिए औसत बाह्य और intracellular प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करने के PyFDAP का प्रयोग करेंएच छवि। PyFDAP माथुर पिक्सल की कुल संख्या से नकाब और विभाजन के बाहर गिर कि पिक्सल की तीव्रता संक्षेप द्वारा इन औसत खरीदते हैं।
    5. निम्नलिखित घातीय समारोह के साथ प्रतिदीप्ति डेटा (चित्रा -3 सी) फिट:

      टी समय के बाद photoconversion, सी (टी) टी का एक दिया मूल्य पर तीव्रता है, जहां सी 0 = 0 टी में तीव्रता है, कश्मीर निकासी दर स्थिर है, और y शून्य समारोह प्रतिदीप्ति के रूप में दृष्टिकोण है कि asymptote है कम हो जाती है (चित्रा -1)। Y 0 कदम 3.8 19 में माप के आधार पर विवश किया जा सकता है।
    6. निम्नलिखित रिश्ते का उपयोग कर निकासी दर स्थिरांक (कश्मीर) से बाह्य और intracellular प्रोटीन आधा जीवन (τ) की गणना करने के PyFDAP का उपयोग करें:

5. नियंत्रण प्रयोगों photobleaching, अनजाने photoconversion, और photoconversion एकरूपता का आकलन करने के लिए

  1. आकलन photobleaching
    नोट: photobleaching ब्याज की प्रोटीन की निकासी के अलावा फ्लोरोसेंट प्रोटीन का विरंजन गुण को दर्शाता है कि प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक artifactual कमी हो सकती है।
    1. संभव है, photobleaching के आकलन इमेजिंग और इमेजिंग के बीच 20 मिनट के अंतराल (चित्रा 4) के साथ एक दूसरे सेट के बीच 10 मिनट के अंतराल के साथ FDAP प्रयोगों के एक सेट करने के लिए। धारा 4 में वर्णित के रूप में PyFDAP का उपयोग करते हुए प्रयोगों के दोनों सेट से डेटा का विश्लेषण।
    2. 10 और 20 मिनट के अंतराल प्रयोगों से आधा जीवन की तुलना करें। लंबे समय तक आधा जीवन 20 मिनट के अंतराल प्रयोगों से महत्वपूर्ण photobleaching से संकेत मिलता है। दोनों प्रयोगों से आधा जीवन समान हैं, photobleaching एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय नहीं है।
    3. वैकल्पिक रूप से, तुरंत photoconversion के बाद ~ 30 छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करके photobleaching का आकलन करें। प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक महत्वपूर्ण कमी महत्वपूर्ण photobleaching को इंगित करता है।
    4. Photobleaching से पाया जाता है, कम लेजर शक्ति का उपयोग इमेजिंग समय कम है, या एक अधिक photostable photoconvertible प्रोटीन 32 उपयोग करने पर विचार।
  2. अनजाने photoconversion का आकलन।
    नोट: Dendra2 488 एनएम रोशनी 27 का उपयोग कर photoconverted जा सकता है। 488 एनएम लेजर के साथ रोमांचक Alexa488 ब्याज की प्रोटीन के स्पष्ट आधा जीवन में कदम 3.3.1, अनजाने photoconversion और इसलिए एक artifactual वृद्धि में वर्णित के रूप में जब भी संभव है। हालांकि, हम और दूसरों 33 488 ​​एनएम रोशनी zebrafish भ्रूण में photoconversion की एक अक्षम तरीका है कि मिल गया है।
    1. अनजाने photoconversion पता लगाने के लिए कदम 5.1.1 में वर्णित नियंत्रण प्रयोग का प्रयोग करें। 10 और 20 मिनट के अंतराल प्रयोगों से आधा जीवन की तुलना करें। 20 मिनट के अंतराल प्रयोगों से कम आधा जीवन महत्वपूर्ण अनजाने photoconversion संकेत मिलता है। दोनों प्रयोगों से आधा जीवन समान हैं, तो अनजाने photoconversion एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय नहीं है।
    2. अनजाने photoconversion पाया जाता है, Dendra2 photoconverting अनजाने से बचने के लिए एक कम 488 एनएम लेजर शक्ति और कम इमेजिंग टाइम्स का उपयोग करें।
  3. Photoconversion एकरूपता का आकलन।
    नोट: photoconversion भ्रूण के पशु ध्रुव की ओर झुका हुआ है, तो प्रतिदीप्ति में कमी गहरी विमानों (चित्रा 5A) में प्रोटीन प्रसार या सेल आंदोलन से प्रभावित हो जाएगा।
    1. Photoconversion वर्दी है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, (बाह्य संलयन प्रोटीन के साथ प्रयोगों के लिए) एक स्रावित photoconvertible प्रोटीन या (इंट्रासेल्युलर संलयन प्रोटीन के साथ प्रयोगों के लिए) एक cytoplasmic photoconvertible प्रोटीन व्यक्त करते हैं। हमेशा की तरह Photoconvert, टीमुर्गी 80 मिनट के लिए हर 20 मिनट blastoderm के सबसे को शामिल एक z ढेर अधिग्रहण।
    2. Photoconversion पशु ध्रुव की ओर झुका हुआ है, तो गहरी विमानों में प्रतिदीप्ति तीव्रता के कारण प्रसार या सेल आंदोलन (चित्रा 5 ब) के लिए समय के साथ वृद्धि होगी। गैर वर्दी photoconversion पाया जाता है, photoconversion दौरान भ्रूण में गहरा ध्यान केंद्रित।

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Representative Results

FDAP zebrafish भ्रूण 19 में कोशिकी संकेत प्रोटीन का आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन प्रोटीनों में से एक, भेंगापन, embryogenesis 34 के दौरान mesendodermal जीनों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है। भेंगा-Dendra2 QRT- पीसीआर द्वारा और सीटू संकरण assays के 19 में प्रदर्शन के रूप में, untagged भेंगापन के समान स्तर पर mesendodermal जीनों की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है। भ्रूण Alexa488-dextran और mRNA भेंगा-Dendra2 एन्कोडिंग और FDAP परख के अधीन के साथ सह इंजेक्शन थे। समय के साथ कोशिकी photoconverted संकेत तीव्रता में कमी का स्पष्ट (चित्रा -4 ए) है। 23 भ्रूण से कोशिकी तीव्रता प्रोफाइल के PyFDAP का उपयोग कर उत्पन्न किया गया। परिणामी डेटा एक पहले के आदेश निकासी कैनेटीक्स मॉडल के साथ PyFDAP में लगाया गया था, और 116 मिनट की एक औसत आधा जीवन τ करने के लिए इसी 1.00 एक्स 10 -4 / सेकंड के एक औसत निकासी की दर लगातार कश्मीर, निर्धारित किया गया था। इसी प्रकार तीव्रता प्रोफ़ाइलइमेजिंग के बीच अंतराल कि photobleaching से या अनजाने photoconversion तीव्रता में परिवर्तन (4B चित्रा) के लिए काफी योगदान नहीं था, सुझाव, 10 या 20 मिनट के थे जब एस और निकासी दर स्थिरांक प्राप्त किया गया।

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रतिदीप्ति क्षय के बाद photoconversion (FDAP) अवलोकन। (ए) एक FDAP प्रयोग के कार्यप्रवाह। (बी) mRNA के इंजेक्शन और एक सेल मंच पर एक zebrafish भ्रूण में एक फ्लोरोसेंट रंजक। भ्रूण इमेजिंग के लिए पहले के बारे में 5 घंटा से अधिक के रूप में विकसित प्रोटीन mRNA से निर्मित है। डाई कोशिकाओं (हरी हलकों) लेबल। (सी) संलयन प्रोटीन एक यूवी नाड़ी का उपयोग photoconverted है, और समय के साथ photoconverted संकेत की तीव्रता में कमी नजर रखी है। (डी) डेटा एक तेजी से घटते के साथ लगे हैं समारोह निकासी दर स्थिरांक (कश्मीर) और आधा जीवन (τ) प्राप्त करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2. FDAP प्रयोगों के लिए बढ़ते zebrafish भ्रूण। (ए) zebrafish भ्रूण (काला blastoderm = सफेद, जर्दी =) agarose पिघल (पीला) में भ्रूण मध्यम (नीला) से स्थानांतरित कर रहे हैं। (बी) भ्रूण और agarose एक गिलास नीचे पकवान के कवर कांच पर रखा जाता है। पशु पोल कवर कांच का सामना कर रहा है, ताकि भ्रूण तो स्वयं तैनात हैं। एक गिलास नीचे पकवान की एक पार अनुभाग में दिखाया गया है। (सी) चार भ्रूण प्रत्येक (डिश में नीचे देख देखें) युक्त कई agarose बूंदों के साथ एक गिलास नीचे पकवान के योजनाबद्ध सिंहावलोकन।w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
PyFDAP। (ए) PyFDAP का उपयोग कर चित्रा 3. डेटा विश्लेषण इंट्रासेल्युलर Alexa488 संकेत (हरा) से intra- और बाह्य मास्क उत्पन्न करने के लिए Otsu thresholding एल्गोरिथ्म 35 का उपयोग करता है। एक स्रावित Dendra2 संलयन प्रोटीन (भेंगा-Dendra2 19) को व्यक्त करने के लिए एक भ्रूण से (बी) Photoconverted संकेत (लाल)। औसत अति- और intracellular प्रतिदीप्ति तीव्रता (ए) में दिखाया गया मास्क का उपयोग कर की गणना की गई। भ्रूण के बाहर अंतरिक्ष पीले सर्कल के बाहर पिक्सल discarding द्वारा इन गणनाओं से बाहर रखा गया था। (सी) PyFDAP स्क्रीनशॉट एक FDAP प्रयोग से कोशिकी तीव्रता डेटा प्रदर्शित (काला circles) एक तेजी से घटते समारोह (लाल धराशायी लाइन) के साथ लगे। कोशिकी आधा जीवन लाल तीर द्वारा संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि FDAP का परिणाम है। (ए) को व्यक्त करने के लिए एक प्रतिनिधि भ्रूण photoconversion (एकदम बाएं) और 27, 87, और 287 मिनट के बाद photoconversion को भेंगा-Dendra2 सिर्फ पूर्व स्रावित। (बी) photobleaching और अनजाने photoconversion (धारा 5 देखें) के लिए नियंत्रित करने के लिए, 10 या 20 मिनट के अंतराल प्रयोगों के साथ प्रदर्शन किया गया (से मुलर एट अल। डेटा, 2012 19)। PyFDAP में, बाह्य तीव्रता प्रोफाइल, उत्पन्न किया गया तेजी से घटते कार्यों के साथ सुसज्जित है, और subtrac द्वारा सामान्यीकृतting 0 मूल्य सी सज्जित द्वारा प्रत्येक डेटा बिंदु और विभाजन से सज्जित Y 0 मूल्य। अंतराल प्रयोगों थे 10 मिनट (काला, एन = 11) और 20 मिनट (नीला, एन = 12) के आंकड़ों फिर क्रमश: औसत। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
Photoconverted प्रोटीन समय के साथ गहरा विमानों में diffuses अगर चित्रा photoconversion एकरूपता का आकलन 5.। एक बाह्य प्रोटीन (ए) गैर वर्दी photoconversion एक ग़लती से कम स्पष्ट आधा जीवन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। (बी) photoconversion वर्दी है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, कई बार में अधिग्रहण कर लिया है blastoderm के सबसे को कवर एक z ढेर के बाद photoconvers अंकआयन। Photoconversion गैर वर्दी (प्रकाश बिखरने अधिक विमानों की तुलना में मद्धम प्रकट करने के लिए गहरी विमानों का कारण बनता है कि ध्यान दें) था अगर प्रतिदीप्ति तीव्रता समय के साथ गहरा विमानों में वृद्धि होगी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक FDAP प्रयोग की सफलता के लिए एक कार्यात्मक photoconvertible संलयन प्रोटीन की पीढ़ी पर निर्भर करता है। एक प्रोटीन टैगिंग अपने जैविक गतिविधि और / या इसके स्थानीयकरण, विलेयता, और स्थिरता 36-41 सहित biophysical गुणों को प्रभावित कर सकते हैं। सक्रिय है कि एक खोजने के लिए कई अलग अलग फ्यूजन निर्माणों की गतिविधि का परीक्षण करने के लिए तैयार रहें। हमने पाया है कि ब्याज की प्रोटीन के लिए photoconvertible प्रोटीन रिश्तेदार की स्थिति को बदलने या उससे अधिक समय Linkers का उपयोग कर (जैसे, अमीनो एसिड अनुक्रम LGDPPVAT 19 का प्रयोग करके) संलयन प्रोटीन की गतिविधि को बढ़ा सकते हैं। संकेत प्रोटीन के मामले में, संलयन प्रोटीन की गतिविधि लक्ष्य जीन 19 की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने की क्षमता के परीक्षण के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। QRT- पीसीआर या स्वस्थानी संकरण में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति 19 की अच्छी readouts प्रदान करते हैं। बनाया गया है यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्रोटीन की स्थिरता को निर्धारित करने के लिए ध्यान दें किजल्दी zebrafish भ्रूण में और अन्य संदर्भों में प्रोटीन स्थिरता का आकलन करने के लिए संशोधन की आवश्यकता होगी।

हरे-टू-लाल photoconvertible प्रोटीन Dendra2 27 zebrafish FDAP प्रयोगों 19 (चित्रा 4) में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, लेकिन अन्य विकल्प उपलब्ध 26,42 हैं। कारण संलयन प्रोटीन का एकत्रीकरण के लिए संभावित कलाकृतियों से बचने के लिए, एक मोनोमेरिक photoconvertible प्रोटीन का चयन करें। यह भी FDAP में इस्तेमाल किया जा सकता Photoactivatible प्रोटीन 20-22,26 assays।

एक FDAP प्रयोग का प्रदर्शन करने से पहले, प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को अनुकूलित किया जाना चाहिए। Photoconversion के बाद useable के संकेत देता है कि न्यूनतम राशि निर्धारित करने के लिए mRNA की विभिन्न मात्रा इंजेक्षन; ~ 50 पीजी mRNA के एक अच्छा प्रारंभिक राशि है। सार्थक पूरक मास्क उत्पन्न करने के लिए आदेश (चित्रा 3) में, Alexa488 संकेत काफी उज्ज्वल होना चाहिएलगातार इंजेक्शन के mRNA से उत्पादन किया है कि गैर-photoconverted संलयन प्रोटीन से संकेत के खिलाफ प्रतिस्पर्धा; फ्लोरोसेंट रंजक की अधिकतम राशि को खोजने के लिए Alexa488-dextran के एनजी 0.2 और 4 के बीच इंजेक्षन। इष्टतम के बाद रूपांतरण इमेजिंग स्थितियों का पता लगाएं और एक दिया निर्माण के साथ सभी प्रयोगों के लिए एक ही शर्तों का उपयोग करें। 43 प्रथाओं अच्छा मात्रात्मक इमेजिंग का प्रयोग करें, और लाल चैनल में संतृप्त पिक्सल से बचने के लिए एक उपयुक्त गतिशील रेंज का चयन करें। प्रत्येक संलयन प्रोटीन के लिए उपयुक्त इमेजिंग अंतराल निर्धारित करते हैं। बहुत ही कम आधा जीवन के साथ प्रोटीन एक छोटे कुल समय अवधि में अधिक लगातार इमेजिंग आवश्यकता हो सकती है। इस्तेमाल किया जीव और photoconvertible प्रोटीन के आधार पर इष्टतम photoconversion तकनीक स्थापित करना। हम 3.5 चरण में एक पारा चाप दीपक का उपयोग कर एक मजबूत photoconversion विधि का वर्णन है, लेकिन Dendra2 भी एक 405 33 या 488 एनएम लेजर 27 के साथ photoconverted जा सकता है।

एक लीइस FDAP प्रोटोकॉल का mitation ब्याज की प्रोटीन की overexpression आवश्यक है। Overexpression प्रोटीन की निकासी कैनेटीक्स 14,44 को संशोधित कि अन्य जीन की असामान्य अभिव्यक्ति के माध्यम से, उदाहरण के लिए, प्रोटीन स्थिरता को प्रभावित कर सकता है। ब्याज की प्रोटीन एक संकेत अणु है, तो लक्ष्य जीनों की अभिव्यक्ति अवरुद्ध प्रोटीन स्थिरता को प्रभावित करता है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए एक संकेतन अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में प्रयोगों प्रदर्शन पर विचार करें। भविष्य में, यह अंतर्जात अभिव्यक्ति तत्वों 45-50 के नियंत्रण के तहत photoconvertible fusions व्यक्त ट्रांसजेनिक भ्रूण उत्पन्न करने के लिए संभव हो सकता है। ट्रांसजेनिक भ्रूण पर्याप्त संकेत उत्पादन करते हैं, तो एक गैर overexpression के संदर्भ में FDAP प्रयोगों शायद पूरे भ्रूण 51 में प्रतिदीप्ति कमी निरीक्षण करने के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी का उपयोग, बोधगम्य हैं।

FDAP के संभावित आगे अनुप्रयोगों तंत्र था की जांच में शामिलटी अलग perturbations (ख्यात proteases की जैसे, अभिव्यक्ति) या स्थिरता पर प्रोटीन संशोधनों (जैसे, फास्फारिलीकरण) के प्रभाव का परीक्षण करके प्रोटीन स्थिरता को विनियमित। उदाहरण के लिए, भेंगापन की कोशिकी स्थिरता कारकों को नियंत्रित वर्तमान में अज्ञात हैं। कई स्रावित विकासात्मक संकेतों बाह्य अंतरिक्ष से भेंगापन और अन्य ligands के निकासी के लिए योगदान कर सकता है जो कोशिकाओं को 52-55, से भली भाँति रहे हैं। FDAP प्रयोगों में जो internalization के बाह्य प्रोटीन निकासी नियंत्रित तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान हो सकता है अवरुद्ध है।

प्रोटीन स्थिरता 15 को मापने के लिए पारंपरिक assays के लिए इसके विपरीत, FDAP प्रोटीन की निकासी रहने वाले जीवों के भीतर समय के साथ नजर रखी जा सकता है जिसमें एक माइक्रोस्कोपी आधारित विकल्प प्रदान करता है। इसी तरह के तरीकों zebrafish भ्रूण के अलावा अन्य मॉडल प्रणाली में प्रोटीन निकासी की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है 20-23। इस FDAP प्रोटोकॉल क्षमता है रहते इमेजिंग संभव है, जहां जैविक प्रणालियों में किसी भी taggable प्रोटीन का आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए अनुकूलित किया जाना है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए संघर्ष का कोई नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए जेफरी फैरेल, जेम्स Gagnon, और जेनिफर Bergmann को धन्यवाद देना चाहूंगा। KWR FDAP परख के विकास के दौरान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया। इस काम एएफएस एनआईएच से अनुदान द्वारा और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (एमी नोथेर कार्यक्रम), मैक्स प्लैंक सोसायटी, और प्रधानमंत्री के लिए मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम (कैरियर विकास पुरस्कार) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Life Technologies AM1340 To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa Life Technologies D34682 Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish BD Falcon Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus Sigma P5147 Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass Petri dish For embryo dechorionation
200 ml glass beaker For embryo dechorionation
Microinjection apparatus For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 16520-100 For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette Kimble Chase (via Fisher) 63A53WT For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium BD Falcon For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals 
25X or 40X water objective Objective for imaging
10X air objective Objective for photoconversion
Immersion oil Immersion oil with the same refractive index as water

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विकास जीवविज्ञान अंक 95 प्रतिदीप्ति क्षय photoconversion (FDAP) प्रोटीन स्थिरता निकासी दर confocal माइक्रोस्कोपी photoconvertible प्रोटीन के बाद Dendra2 भ्रूण zebrafish
Photoconversion के बाद प्रतिदीप्ति क्षय का प्रयोग लिविंग zebrafish भ्रूण में प्रोटीन स्थिरता मापने (FDAP)
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