Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Måling Protein Stabilitet på Living Sebrafisk embryo med fluoresens Decay Etter Photoconversion (FDAP)

Published: January 28, 2015 doi: 10.3791/52266
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society

Summary

Proteinnivåer i celler og vev er ofte strengt regulert av balansen av proteinproduksjon og klaring. Ved hjelp av fluorescens Decay Etter Photoconversion (FDAP), kan klaringskinetikk av proteiner bli eksperimentelt målt in vivo.

Abstract

Protein stabiliteten påvirker mange aspekter av biologi, og måle klaring kinetikk av proteiner kan gi viktig innsikt i biologiske systemer. I FDAP eksperimenter, kan clearance av proteiner i levende organismer måles. Et protein av interesse er merket med en photoconvertible fluorescerende protein, uttrykt in vivo og photoconverted, og reduksjonen i photoconverted signal over tid blir overvåket. Dataene blir deretter utstyrt med en passende klaring modell for å bestemme protein halveringstid. Viktigere, kan klaringskinetikk protein populasjoner i ulike avdelinger av organismen undersøkes separat ved å bruke compartment masker. Denne fremgangsmåten har blitt brukt for å bestemme de intra- og ekstracellulære halveringstider på utskilte signaleringsproteiner under sebrafisk utvikling. Her beskriver vi en protokoll for FDAP eksperimenter i sebrafisk embryoer. Det bør være mulig å bruke FDAP å bestemme klareringskinetikkennoen taggable protein i noen optisk tilgjengelig organisme.

Introduction

Nivåene av proteiner i celler og organismer er bestemt av deres produksjonshastigheter og klaring. Protein halveringstider kan variere fra minutter til dager 1-4. I mange biologiske systemer, har stabilisering eller klarering av viktige proteiner viktige effekter på celleaktivitet. Modulering av intracellulær proteinstabilitet er nødvendig for cellesyklusprogresjon 5,6, utviklingssignale 7-9, apoptose 10, og normal funksjon og vedlikehold av neuroner 11,12. Ekstracellulært proteinstabilitet påvirker fordelingen og tilgjengeligheten av utskilte proteiner, som for eksempel morphogens 13,14, i en vev.

I løpet av de siste tiårene, har protein stabilitet hovedsakelig blitt vurdert i cellekultur ved hjelp av radioaktiv puls-merking eller Cycloheximide jage eksperimenter 15. I slike puls-chase eksperimenter ble cellene enten forbigående utsettes for en "puls" av radioaktiv aminosyresyreforløpere som blir innlemmet i de nylig syntetiserte proteiner, eller de er utsatt for cykloheksimid, som inhiberer proteinsyntese. Dyrkede celler ble deretter oppsamlet ved forskjellige tidspunkter, og enten etterfulgt av immunoutfelling autoradiografi (i radioaktive puls-chase eksperimenter), eller Western blotting (i cykloheksimid forsøk) blir brukt til å kvantifisere klaring av protein over tid.

Konvensjonelle analyser protein stabilitet har flere svakheter. Først blir proteiner i disse analyser ofte ikke uttrykt i deres endogene miljøer, men heller i vevskultur, og noen ganger i celler fra forskjellige arter. For proteiner hvis stabilitet er kontekstavhengig, er denne tilnærmingen problematisk. For det andre er det ikke mulig å følge proteinet klaring i de enkelte celler eller organismer over tid, og dataene fra disse analysene reflekterer et gjennomsnitt av forskjellige populasjoner av celler ved forskjellige tidspunkter. Siden individuelle celler kan ha startetmed forskjellige mengder protein, kan ha tatt opp radioaktivt etikett eller cykloheksimid til forskjellige tider, eller kan ha ulike klareringskinetikk, slike aggregerte data kan være misvisende. Endelig, i tilfellet med cykloheksimid chase eksperimenter, kan tilsetningen av proteinsynteseinhibitor ha uønskede fysiologiske effekter som kunstig kunne forandre proteinstabilitet 16-18. Disse mangler kan unngås ved å bruke fluorescens Råte Etter Photoconversion (FDAP), en teknikk som utnytter photoconvertible proteiner for å måle protein klaring dynamisk i levende organismer 19-25 (se diskusjon for begrensninger av FDAP teknikk).

Photoconvertible proteiner er fluorescerende proteiner som eksitasjon og utslipps egenskaper endre seg etter eksponering for bestemte bølgelengder av lys 26. En vanlig brukt variant er Dendra2, en "grønn-til-rød" photoconvertible protein som i utgangspunktet har exsitering og utslipps egenskaper som ligner på grønne fluorescerende proteiner, men etter eksponering for UV lys-"photoconversion"-dens eksitasjon / emisjonsegenskapene blir lik de røde fluorescerende proteiner 23,27. Viktigere, vil nytt protein som produseres etter photoconversion ikke har de samme eksitasjon / emisjonsegenskaper som photoconverted protein, tillater frakobling av produksjon og klaring ved photoconversion og observasjon av bare en pool av photoconverted protein. Tagging proteiner av interesse med photoconvertible proteiner gir dermed en praktisk måte å pulsere-label proteiner i intakte, optisk tilgjengelige levende organismer.

I FDAP analyser (Figur 1a), er et protein av interesse merket med en photoconvertible protein og uttrykkes i en levende organisme (figur 1B). Fusjonsproteinet photoconverted, og nedgangen i photoconverted signal over tid overvåkes av fluorescence mikroskopi (figur 1C). Dataene blir deretter utstyrt med en egnet modell for å bestemme halveringstiden til fusjonsproteinet (figur 1D).

Den FDAP analysen beskrevet her er designet for å bestemme de ekstracellulære halveringstider på utskilles signalanlegg proteiner i sebrafisk embryo under tidlig embryogenese 19. Imidlertid kan denne tilnærmingen tilpasses enhver gjennomsiktig modell organisme som tåler direkte avbildning, og kan brukes til å overvåke clearance av noen taggable intracellulært eller ekstracellulært protein. Variasjoner av teknikken beskrevet her er utført i dyrkede celler 20,23 og Drosophila 22 og mus 21 embryoer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generere en Photoconvertible Fusion Konstruer og Injisering Dechorionated Sebrafisk embryo

  1. Generere en funksjonell konstruksjon inneholdende proteinet av interesse fusjonert til en grønn-til-rød photoconvertible protein (se Diskusjon), og deretter bruke in vitro transkripsjon for å generere avkortet mRNA som koder for fusjonsproteinet som i Muller et al., 2012 19.
  2. Bruk pronase for å fjerne chorions fra ca 30 sebrafisk embryoer ved en-cellestadiet. Alternativt manuelt dechorionate embryoer ved hjelp av pinsett 28.
    Merk: Embryoet må dechorionated for senere bildebehandling. Om ønskelig, kan embryoer injiseres gjennom chorion og dechorionated senere, like før bildebehandling.
    1. Lag en 5 mg / ml stamløsning av pronase fra Streptomyces griseus i standard sebrafisk embryo medium 19. Rock løsningen forsiktig ved romtemperatur i 10 min for å tillate protease for å oppløse. Delmengde 2 ml inn mikrosentrifugerør og fryse ved -20 ° C.
    2. Overføre ett-celle scene embryoer til en 5 cm diameter glass eller agarose-belagt plast petriskål som inneholder ~ 8 ml embryo medium. Tilsett 2 ml tint pronase stamløsning til parabolen, og inkuberes ved romtemperatur i 5 til 10 min.
    3. Unngå å utsette embryoer til luft eller plast, som kontakt med enten vil føre dechorionated embryoer til å sprekke. Fyll et 200 ml begerglass med embryo medium. Overfør embryoene til begeret ved å vippe petriskål mens å senke den i medium.
    4. Etter embryoene ha lagt seg på bunnen av begerglasset, helle ut det meste av embryoet medium, deretter helle friskt medium embryo i begerglasset. Det milde virvlende av mediet strømme inn begeret fører embryoer til å miste sine svekket chorions.
    5. Gjenta trinn 1.2.4.
  3. Overfør dechorionated embryo til en agarose-belagt injeksjon tallerken 29 ved hjelp av et glass Pasteur pipette med en flammet tips. Flamingpipettespissen hindrer skarpe kanter fra såret embryoer.
  4. Co-injisere mRNA og en 3 kDa Alexa488-dekstran konjugat 29,30 (figur 1B, se diskusjon for foreslått mRNA og Alexa488-dekstran mengder). Injisere direkte i midten av cellen (ikke eggeplomme) for å sikre jevn fordeling av mRNA og fluorescerende fargestoff når spaltning begynner.
    Merk: Alexa488 signal vil bli brukt under dataanalyse for å generere kompartment masker for å skille mellom intracellulært og ekstracellulært fluorescens.
  5. Overfør injisert embryo til en 1-2% agarose-belagt godt av en seks-brønns plast tallerken fylt med embryo medium. Inkuberes i mørke ved 28 ° C inntil embryoer har nådd slutten sfære stadium 31 (ca. 5 timer etter befruktning). Sjekk embryoer hver og en til to timer under en stereomikroskop og fjerne eventuelle rester generert av embryoer som har dødd.

2. Montering Sebrafisk embryoer for Photoconversion og bildebehandling på en Inverted konfokalmikroskop

  1. Bruk en stereomikroskop for å identifisere ett til fem friske fostre, og bruke et glass Pasteur pipette med en flammet tips for å fjerne dem fra fatet.
  2. Forsiktig mate embryoene inn en mikro tube inneholder ~ 1 ml smeltet 1% lavt smeltepunkt agarose i 1x Danieau sin embryo medium (se Materials List) (Figur 2A).
    Merk: Agarose bør ha en temperatur mellom 40 og 42 ° C; høyere temperaturer kan skade fostre.
  3. Tegn embryoene tilbake inn i pipetten sammen med noen agarose. Forsiktig løse ut agarose og embryoer på dekselet glass en glassbunn fatet (figur 2B). Sørge for at tykkelsen av dekkglasset er forenlig med det formål på det konfokale mikroskop.
    1. Re-bruker glass pipette hvis ønskelig. For å rense rest agarose ut av pipetten og hindre tilstopping, raskt pipette embryo medium opp og ned.Plassere et 15 ml rør fylt med ~ 5 ml embryo medium ved siden av stereomikroskop for dette formål.
  4. Bruke et metall probe for å posisjonere embryoene, slik at dyret pol (blastoderm) vender mot dekkglass. Arbeide raskt siden agarosen vil stivne i 20-30 sek. Bruk stereo å overvåke embryoer posisjoner og juster som nødvendig til agarose stivner.
  5. Gjenta trinn 2,1-2,4 til ønsket antall av embryoer er montert.
    Merk: I et typisk eksperiment, vil fire agarose dråper som inneholder fire eller fem befruktede egg hver passe lett på coveret glass. Om 16 embryoer kan avbildes i løpet av en enkelt ideell eksperiment (Figur 2C).
  6. Når agarosen har stivnet, fylle glassbunn tallerken med 1x Danieau sin embryo medium.

3. Photoconverting og Måle Reduksjon av Photoconverted Signal

En 25X eller 40X vann objektiv jegs passende for størrelsen og brytningsindeks sebrafisk embryoer. Det er best å bruke nedsenking olje med samme brytningsindeks som vann i stedet for selve vannet, siden vannet vil fordampe i løpet av en fem timers eksperimentet. Sikre at nedsenking olje er utformet for å brukes sammen med en vann (ikke olje) objektiv.

  1. Plasser en stor dråpe nedsenking olje på målet å sikre at oljefilmen mellom objektiv og dekkglass ikke vil bryte så scenen flyttes til ulike embryo stillinger under bildebehandling. Sikkert plassere glassbunn fatet på scenen slik at retten ikke vil skifte når scenen beveger seg. Hvis mulig, bruk en oppvarmet scenen ved 28 ° C, optimal temperatur for sebrafisk utvikling.
  2. Definere hver embryo posisjon i konfokal mikroskop programvare pakken. Juster z-dybde for hvert embryo, og forsøk på å målrette omtrent det samme plan i hvert embryo.
    Merk: Om 30 mikrometer fra dyre pol er en good dybde siden på denne dybden av omsluttende lag av embryoet kan unngås, er bildeområdet maksimert, og lysspredning er minimal. En enkelt optisk skive med en tykkelse av ~ 3,3 um gir tilstrekkelige data; det er ikke nødvendig å skaffe seg en z-stack (se avsnitt 5).
  3. Samle to signaler under eksperimentet: den "grønne" signalet fra Alexa488-dekstran-konjugat som vil bli brukt under dataanalyse for å isolere ekstracellulær og intracellulær fluorescens-og "rød" signalet fra fusjonsproteinet etter at den er photoconverted.
    1. Excite Alexa488 ved hjelp av en 488 nm laser, og samle slippes fluorescens mellom ~ 500 og 540 nm. Merk: Etter photoconversion, mange grønn-til-rød photoconvertible proteiner (f.eks Dendra2) kan være glade med en 543 nm laser og avgir fluorescens mellom ~ 550 og 650 nm. Justere etter behov basert på photoconvertible protein brukt.
  4. Erverve "pre-photoconversion"Bilder og konfigurere konfokal mikroskop programvare til bilde hver av de tidligere definerte stillinger (fra trinn 3.2) med de aktuelle bildeforhold hver 10 eller 20 min for en fem timers tid kurs (se kapittel 5 og Diskusjon).
  5. For å photoconvert fusjonsproteinet, bytte til et 10X objektiv og eksponere grupper av embryoer for UV-lys fra en kvikksølvlampe med en bue ~ 300-400 nm eksitasjon filter ved 100% effekt i 2 min. Skifte fokus langs z-aksen for å fremme ensartet photoconversion (se avsnitt 5). Kontroller at nedsenking olje ikke drypper på 10x objektiv under photoconversion.
    Merk: Den forskyvning av fokus under photoconversion kan automatiseres for å unngå variasjon blant forskere.
  6. Bytte tilbake til 25X eller 40X objektiv umiddelbart etter photoconversion. Sørg for at de tidligere definerte stillinger fra trinn 3.2 er fortsatt nøyaktig. Hvis parabolen forskjøvet under photoconversion, re-definere posisjoner av embryoer.
    1. Start programmet ble opprettet i trinn 3.4 og la bilde å fortsette i fem timer. Oppmerksom på tiden som har gått mellom photoconversion og starten av bildebehandling for hvert embryo.
  7. Av og til sjekk på eksperimentet. Overvåke nivået av Danieau medium og tilsett mer om nødvendig. Start programvaren hvis det har stoppet opp.
  8. For å bestemme de bakgrunnsfluorescens verdier som vil bli brukt under dataanalyse for å estimere asymptoten til en eksponentielt avtagende modell, omfatter enkelte embryoer som har blitt injisert med Alexa488-dekstran, men ikke mRNA i forsøket. For å fastslå instrumentstøy, noe som også vil bli brukt i løpet av etterfølgende dataanalyse, skaffe et bilde i fravær av en prøve.

4. Analysere data ved hjelp PyFDAP

  1. Inspiser Tidsforløpet datasett fra hvert embryo. Kast datasett fra embryoer som døde i løpet av imaging, som endret seg betydelig, som har svært lave nivåer av photoconverted signal, eller som inneholder regioner av celler som ser uvanlig og har sluttet å flytte og dele (typisk for skadde eller syke embryo).
    Merk: Av og til bobler i nedsenking olje eller andre gjenstander vil vises i ett eller to bilder i en ellers brukbare datasett. Oppmerksom på eventuelle bilder som inneholder gjenstander; de vil bli forkastet senere, og de resterende tidspunkter fra et slikt datasett kan fremdeles bli analysert.
  2. Bruk Python-baserte programvarepakke PyFDAP å analysere FDAP data. PyFDAP beregner halveringstider ved å bestemme den gjennomsnittlige intracellulære og ekstracellulære rød fluorescens-intensiteten i hvert bilde og å tilpasse dataene med en eksponentielt avtagende funksjon 56 (figur 3).
    1. Last ned PyFDAP (se Materialer List).
    2. Bruk PyFDAP å skille intracellulære og ekstracellulære photoconverted signal (figur 3A, B). OssE er Alexa488 signal, som er strengt intracellulært, for å skape en intracellulær maske. Bruk denne masken til tilsvarende røde kanalen bildet for å forhindre intracellulære piksler fra å bli tatt med i beregningen gjennomsnittlig ekstracellulære intensitet. Å måle gjennomsnittlig intracellulær intensitet, invertere masken.
    3. I PyFDAP, vise de maskerte bilder generert i trinn 4.2.2. Inspiser disse bildene og kast datasett der masker ikke nøyaktig skiller intracellulær fra ekstracellulære rom (dette bør være sjeldne, oppmerksom på at cellemembraner er inkludert i bilder hvor ekstracellulære rom har blitt maskert, men de kunne bli fjernet ved å endre terskel algoritme eller ved å innføre en membran maske (f.eks, ved hjelp av membran-CFP)). Også forkaste eventuelle enkeltbilder som inneholder artefakter (f.eks, bobler i nedsenking olje) identifiserte i trinn 4.1.
    4. Bruk PyFDAP å beregne gjennomsnittlig ekstracellulære og intracellulære fluorescensintensiteter for each bilde. PyFDAP beregner disse gjennomsnitt ved å summere intensiteter av piksler som faller utenfor masken og dele av det totale antall piksler summert.
    5. Monter fluorescens data (Figur 3C) med følgende eksponentiell funksjon:

      hvor t er tiden etter photoconversion, c (t) er intensiteten ved en gitt verdi av t, c 0 er intensiteten ved t = 0, k er hastighetskonstanten klaringen, og y er 0 asymptoten at funksjonen nærmer som fluorescens avtar (figur 1D). y 0 kan være begrenset basert på målingene i trinn 3.8 19.
    6. Bruk PyFDAP å beregne ekstracellulære og intracellulære protein halveringstid (τ) fra klaring hastighetskonstanter (k) ved hjelp av følgende forhold:

5. Kontroll Forsøk å vurdere fotobleking, Utilsiktet Photoconversion, og Photoconversion Uniformity

  1. Vurdere fotobleking
    Merk: fotobleking kan føre til en kunstig reduksjon i fluorescensintensitet som reflekterer bleke egenskapene til det fluorescerende protein i tillegg til klaring av proteinet av interesse.
    1. Å vurdere mulig fotobleking, utføre ett sett med FDAP eksperimenter med 10 min intervaller mellom bildebehandling og et ekstra sett med 20 min intervaller mellom avbildning (figur 4). Analysere data fra begge sett av eksperimenter med PyFDAP som beskrevet i punkt 4.
    2. Sammenligne halveringstider fra 10 til 20 min intervall eksperimenter. Lengre halveringstider fra 20 min intervall eksperimenter indikere sterk fotobleking. Dersom halveringstider fra begge forsøk er identiske, Photobleaching er ikke et vesentlig problem.
    3. Alternativt vurdere fotobleking ved å anskaffe en serie av ~ 30 bilder umiddelbart etter photoconversion. En signifikant reduksjon i fluorescensintensitet indikerer signifikant fotobleking.
    4. Hvis det oppdages fotobleking, bruke lavere laser makt, redusere bilde tid, eller vurdere å bruke en mer fotostabile photoconvertible protein 32.
  2. Vurdere utilsiktet photoconversion.
    Merk: Dendra2 kan photoconverted bruker 488 nm belysning 27. Når spennende Alexa488 med 488 nm laser som beskrevet i trinn 3.3.1, utilsiktet photoconversion og derfor en kunstig økning av den tilsynelatende halveringstiden for proteinet av interesse er mulig. Men vi og andre 33 har funnet ut at 488 nm belysning er en ineffektiv metode for photoconversion i sebrafisk embryoer.
    1. Bruk av kontrollforsøk som er beskrevet i trinn 5.1.1 å detektere utilsiktet photoconversion. Sammenligne halveringstider fra 10 til 20 min intervall eksperimenter. Kortere halveringstider fra 20 min intervall forsøk tyder på betydelig utilsiktet photoconversion. Dersom halveringstider fra begge forsøk er identiske, er utilsiktet photoconversion ikke en vesentlig bekymring.
    2. Hvis det oppdages utilsiktet photoconversion, bruker en lavere 488 nm laser makt og kortere bilde ganger for å unngå utilsiktet photoconverting Dendra2.
  3. Vurdere photoconversion ensartethet.
    Merk: Hvis photoconversion er forspent mot dyret pol av embryoet, vil reduksjonen i fluorescens blir påvirket av protein diffusjon eller cellebevegelse inn i dypere plan (figur 5a).
    1. Å avgjøre om photoconversion er uniform, uttrykker en utskilt photoconvertible protein (for eksperimenter med ekstracellulære fusjonsproteiner) eller en cytoplasma photoconvertible protein (for eksperimenter med intracellulære fusjonsproteiner). Photoconvert som vanlig, thøne erverve en z-stack som omfatter det meste av blastoderm hvert 20 min for 80 min.
    2. Hvis photoconversion er forspent mot dyret pol, vil fluorescens-intensiteten på dypere plan øke over tid på grunn av diffusjon eller cellebevegelse (figur 5B). Hvis det oppdages ikke-uniform photoconversion, fokusere dypere inn i embryoer under photoconversion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FDAP har blitt brukt til å bestemme halveringstider på ekstracellulære signalproteiner i sebrafisk embryo 19. En av disse proteinene, myse, induserer uttrykk for mesendodermal gener under embryogenese 34. Myse-Dendra2 aktiverer uttrykk for mesendodermal gener på nivåer tilsvarende ukodet myse, som demonstrert av QRT-PCR og in situ hybridiseringsanalyser 19. Embryoene ble ko-injisert med Alexa488-dekstran og mRNA som koder for myse-Dendra2 og underkastet FDAP analysen. En reduksjon i den ekstracellulære photoconverted signalintensitet over tid er tydelig (figur 4A). Ekstracellulære intensitet profiler fra 23 embryoer ble generert ved hjelp PyFDAP. De resulterende data ble montert i PyFDAP med en første ordens kinetikk klaring modell, og en midlere klaring hastighetskonstanten k på 1,00 x 10 -4 / sek, tilsvarende en gjennomsnittlig halveringstid τ av 116 minutter, ble bestemt. Lignende intensitet profils og klaring hastighetskonstanter ble oppnådd når intervallene mellom bildebehandling var 10 eller 20 min, noe som tyder på at fotobleking eller utilsiktet photoconversion ikke bidra vesentlig til intensitetsendringer (Figur 4B).

Figur 1
Figur 1. Fluorescens Decay Etter Photoconversion (FDAP) oversikt. (A) Arbeidsflyt av en FDAP eksperiment. (B) Injeksjon av mRNA, og et fluorescerende fargestoff i en sebrafisk embryo i en celle-stadiet. Proteinet fremstilles fra mRNA som embryoet utvikles i løpet av ca. 5 timer før avbildning. Fargestoffet etiketter celler (grønne sirkler). (C) Et fusjonsprotein er photoconverted ved hjelp av en UV-puls, og den minskning i intensiteten av photoconverted signal over tid blir overvåket. (D) Dataene er utstyrt med en eksponentielt avtagende funksjon for å innhente klarering hastighetskonstanter (k) og halveringstid (τ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Monteringssebrafisk embryoer for FDAP eksperimenter. (A) sebrafisk embryo (blastoderm = hvit, eggeplomme = svart) overføres fra embryo medium (blå) inn smeltet agarose (gul). (B) Embryoet og agarose er plassert på dekselet glass med glassbunn parabolen. Embryoene blir deretter manuelt plassert slik at dyret polflater dekkglasset. Et tverrsnitt av en glassbunn parabolen er vist. (C) Skjematisk oversikt over et glass-bottom tallerken med flere agarose dråper som inneholder fire embryoer hver (view ser ned i formen).w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Dataanalyse ved hjelp PyFDAP. (A) PyFDAP bruker Otsu thresholding algoritmen 35 å generere intra- og ekstracellulære masker fra den intracellulære Alexa488 signal (grønn). (B) Photoconverted signal (rød) fra et embryo som uttrykker en utskilt Dendra2 fusjonsprotein (Myse-Dendra2 19). Gjennomsnittlig ekstra- og intracellulære fluorescens-intensitetene ble beregnet ved hjelp av de masker som er vist i (A). Plassen utenfor embryo ble ekskludert fra disse beregningene ved å forkaste piksler utenfor den gule sirkelen. (C) PyFDAP skjermbilde som viser ekstracellulære intensitet data fra en FDAP eksperiment (svart CIRcles) utstyrt med en eksponentielt avtagende funksjon (rød stiplet linje). Den ekstracellulære halveringstid indikeres med rød pil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Representant FDAP resultater. (A) En representant embryo uttrykker utskilt myse-Dendra2 like før photoconversion (helt til venstre) og 27, 87, og 287 min post-photoconversion. (B) For å kontrollere for fotobleking og utilsiktet photoconversion (se avsnitt 5), ble eksperimenter med 10 eller 20 min intervaller utført (data fra Müller et al., 2012 19). I PyFDAP ble ekstracellulære belastningsprofiler generert, utstyrt med eksponentielt avtagende funksjoner, og normalisert ved subtracting montert på y 0 verdi fra hvert datapunkt og dividere med montert c 0 verdi. Data fra 10 min (svart, n = 11) og 20 min (blå, n = 12) intervall eksperimenter ble så gjennomsnittsberegnet, respektivt. Feilfelt angir standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Vurdering av photoconversion ensartethet. (A) Ikke-uniform photoconversion av et ekstracellulært protein kan føre til en feilaktig kort tilsynelatende halveringstid hvis photoconverted proteinet diffunderer inn i dypere plan over tid. (B) For å finne ut om photoconversion er uniform, en z-stabel som dekker det meste av blastoderm er kjøpt til flere tidspunkter post-photoconversion. Fluorescens intensitet vil øke i dypere plan over tid hvis photoconversion var non-uniform (merk at lysspredning fører dypere plan å vises dimmer enn høyere plan). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Suksessen til en FDAP eksperiment er avhengig av dannelsen av en funksjonell photoconvertible fusjonsprotein. Tagging et protein kan påvirke sin biologiske aktivitet og / eller biofysiske egenskaper, herunder dets lokalisering, oppløselighet, og stabilitet 36-41. Vær forberedt på å teste aktiviteten av flere ulike fusjonskonstruksjoner for å finne en som er aktiv. Vi har funnet at å endre posisjonen av photoconvertible protein i forhold til proteinet av interesse, eller ved å bruke lengre kopiere (for eksempel ved hjelp av aminosyresekvensen LGDPPVAT 19) kan øke aktiviteten av fusjonsproteinet. I tilfelle av signaleringsproteiner, kan aktiviteten av fusjonsproteinet bli bestemt ved å teste dets evne til å indusere ekspresjon av målgener 19. QRT-PCR eller in situ hybridisering gir gode avlesninger av target genuttrykk 19. Legg merke til at protokollen beskrevet her, er utformet for å bestemme stabiliteten av proteineri tidlig sebrafisk embryo og ville kreve modifikasjon for å vurdere protein stabilitet i andre sammenhenger.

Den grønne-til-rød photoconvertible protein Dendra2 27 har vært brukt med hell i sebrafisk FDAP eksperimenter 19 (figur 4), men andre alternativer er tilgjengelige 26,42. For å unngå potensielle gjenstander på grunn av aggregering av fusjonsproteinet, velge en monomerisk photoconvertible protein. Photoactivatible proteiner kan også brukes i FDAP analysene 20-22,26.

Før du utfører en FDAP eksperiment, flere aspekter av protokollen må være optimalisert. Injisere ulike mengder av mRNA å bestemme det laveste beløpet som gir brukbar signal etter photoconversion; ~ 50 pg mRNA er en god startbeløp. For å generere menings compartment masker (figur 3), må Alexa488 signalet være sterke nok til åkonkurrere mot signalet fra den ikke-photoconverted fusjonsprotein som er i stadig produseres fra den injiserte mRNA; injisere mellom 0,2 og 4 ng Alexa488-dekstran for å finne den optimale mengden av fluorescerende fargestoff. Finne de optimale post-konverteringsbildeforhold og bruke de samme vilkår for alle eksperimenter med en gitt konstruksjon. Bruk god kvantitativ bilde praktiserer 43, og velge en passende dynamisk område for å unngå mettet piksler i den røde kanalen. Bestemme den riktige bildeintervall for hvert fusjonsprotein. Proteiner med meget kort halveringstid kan kreve hyppigere avbildning over en kortere total tidsperiode. Etablere den optimale photoconversion teknikk basert på organismen og photoconvertible protein anvendes. Vi beskriver en robust photoconversion metode med en kvikksølv arc lampe i trinn 3.5, men Dendra2 kan også photoconverted med en 405 33 eller 488 nm laser 27.

En libegrensning, med denne FDAP protokollen er at overekspresjon av proteinet av interesse er nødvendig. Overekspresjon kan påvirke proteinstabilitet, for eksempel, ved unormal ekspresjon av andre gener som endrer proteinets klareringskinetikk 14,44. Hvis proteinet av interesse er et signalmolekyl, vurdere å utføre eksperimenter i nærvær av en signale inhibitor for å bestemme om å blokkere ekspresjon av målgener påvirker proteinstabilitet. I fremtiden kan det være mulig å generere transgene embryoer som uttrykker photoconvertible fusjoner under kontroll av endogene ekspresjon elementer 45-50. Dersom transgene embryoer frembringe tilstrekkelig signal, FDAP eksperimenter i et ikke-overekspresjon sammenheng er tenkelig, kanskje ved hjelp av lys-mikroskopi ark for å observere fluorescensen reduksjon i hele embryoet 51.

Mulige videre anvendelser av FDAP inkluderer undersøker mekanismer that regulere protein stabilitet ved å undersøke effekten av ulike forstyrrelser (f.eks uttrykk for antatte proteaser) eller protein modifikasjoner (f.eks fosforylering) på stabilitet. For eksempel, de faktorene som styrer den ekstracellulære stabilitet av myse er foreløpig ukjent. Mange skilles utviklings signalene blir internalisert av celler 52-55, noe som kan bidra til rydding av myse og andre ligander fra det ekstracellulære rom. FDAP eksperimenter der intern blokkert kan gi informasjon om mekanismene som styrer ekstracellulært protein klaring.

I motsetning til konvensjonelle analyser for måling av proteinstabilitet 15, FDAP tilbyr et mikroskopi-basert alternativ hvor klaringen av proteiner kan overvåkes over tid i levende organismer. Lignende metoder har blitt brukt til å overvåke protein klaring i modellsystemer andre enn sebrafisk embryo 20-23. Denne FDAP protokollen har potensiale til å bli innrettet til å bestemme halveringstiden for en hvilken som helst taggable protein i biologiske systemer hvor levende avbildning er gjennomførbart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Jeffrey Farrell, James Gagnon, og Jennifer Bergmann for kommentarer til manuskriptet. KWR ble støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under utviklingen av den FDAP analysen. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH til AFS og med tilskudd fra det tyske Research Foundation (Emmy Noether Program), Max Planck Society, og Human Frontier Science Program (Career Development Award) til PM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Life Technologies AM1340 To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa Life Technologies D34682 Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish BD Falcon Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus Sigma P5147 Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass Petri dish For embryo dechorionation
200 ml glass beaker For embryo dechorionation
Microinjection apparatus For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 16520-100 For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette Kimble Chase (via Fisher) 63A53WT For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium BD Falcon For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals 
25X or 40X water objective Objective for imaging
10X air objective Objective for photoconversion
Immersion oil Immersion oil with the same refractive index as water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
  3. Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O'Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
  4. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  5. Parry, D. H., O'Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
  6. Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
  7. Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
  8. MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
  9. Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
  10. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  11. Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
  12. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  13. Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
  14. Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
  15. Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
  16. Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
  17. Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
  18. Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
  19. Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
  20. Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
  21. Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
  22. Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
  23. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  24. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
  25. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
  26. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  27. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  28. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  30. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  31. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
  32. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  33. Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
  34. Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
  35. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
  36. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
  37. Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
  38. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
  39. Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
  40. Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
  41. Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
  42. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  44. Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
  45. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  46. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  47. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
  48. Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
  49. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  50. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  51. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
  52. Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
  53. Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
  54. Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
  55. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
  56. Bläßle, A., Müller, P. PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, forthcoming (2014).

Tags

Developmental Biology fluorescens Decay Etter Photoconversion (FDAP) protein stabilitet clearance rate konfokal mikroskopi photoconvertible protein Dendra2 embryo sebrafisk
Måling Protein Stabilitet på Living Sebrafisk embryo med fluoresens Decay Etter Photoconversion (FDAP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, K. W., Bläßle, A., … More

Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP). J. Vis. Exp. (95), e52266, doi:10.3791/52266 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter