Summary
Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.
Abstract
Estabilidad de la proteína influye en muchos aspectos de la biología, y la medición de la cinética de eliminación de proteínas puede proporcionar importantes conocimientos sobre los sistemas biológicos. En experimentos FDAP, la liquidación de las proteínas dentro de los organismos vivos se puede medir. Una proteína de interés se marca con una proteína fluorescente fotoconvertible, expresada in vivo y photoconverted, y la disminución en la señal de photoconverted lo largo del tiempo se controla. Los datos se ajusta entonces con un modelo de espacio libre apropiado para determinar la vida media de la proteína. Es importante destacar que la cinética de remoción de las poblaciones de proteínas en los diferentes compartimentos del organismo pueden ser examinados por separado mediante la aplicación de máscaras compartimentales. Este enfoque ha sido utilizado para determinar la vida media intra y extracelulares de las proteínas de señalización secretadas durante el desarrollo de pez cebra. Aquí se describe un protocolo para experimentos FDAP en embriones de pez cebra. Debería ser posible utilizar FDAP para determinar la cinética de remoción decualquier proteína taggable en cualquier organismo ópticamente accesible.
Introduction
Los niveles de proteínas en células y organismos están determinadas por sus tasas de producción y el aclaramiento. Proteínas vidas medias pueden variar desde minutos a días 1-4. En muchos sistemas biológicos, la estabilización o eliminación de proteínas clave tiene efectos importantes sobre la actividad celular. Se requiere la modulación de la estabilidad de la proteína intracelular para la progresión del ciclo celular 5,6, la señalización del desarrollo 7-9, apoptosis 10, y la función normal y el mantenimiento de las neuronas 11,12. Estabilidad de la proteína extracelular afecta a la distribución y la disponibilidad de las proteínas secretadas, tales como morfógenos 13,14, dentro de un tejido.
Durante las últimas décadas, la estabilidad de proteínas principalmente se ha evaluado en cultivo celular utilizando pulsos marcaje radioactivo o experimentos de persecución cicloheximida 15. En estos experimentos de pulso-caza, las células son o bien transitoriamente expuestos a un "pulso" de amino radiactivoprecursores de ácido que se incorporan en las proteínas recién sintetizadas, o que están expuestos a la cicloheximida, que inhibe la síntesis de proteínas. Las células cultivadas se recogen a diferentes puntos de tiempo, y, o bien inmunoprecipitación seguido por autorradiografía (en los experimentos de pulso-caza radiactivos) o Western Blot (en experimentos de cicloheximida) se utiliza para cuantificar la liquidación de la proteína en el tiempo.
Ensayos de estabilidad de proteínas convencionales tienen varias deficiencias. En primer lugar, las proteínas en estos ensayos a menudo no se expresan en sus entornos endógenos, sino más bien en el cultivo de tejidos y algunas veces en las células de diferentes especies. Para las proteínas cuya estabilidad es dependiente del contexto, este enfoque es problemático. En segundo lugar, no es posible seguir el aclaramiento de proteínas en las células individuales o los organismos con el tiempo, y los datos de estos ensayos refleja un promedio de diferentes poblaciones de células en diferentes puntos de tiempo. Dado que las células individuales pueden haber comenzadocon diferentes cantidades de proteína, pudo haber tomado la etiqueta o cicloheximida radiactivo en diferentes momentos, o puede tener diferentes cinética de depuración, tales datos agregados podrían ser engañosas. Finalmente, en el caso de los experimentos de persecución cicloheximida, la adición del inhibidor de la síntesis de proteínas puede tener efectos fisiológicos no deseados que podrían alterar artificialmente estabilidad de la proteína 16-18. Estas deficiencias se pueden evitar mediante el uso de fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), una técnica que utiliza proteínas fotoconvertible para medir la eliminación de proteínas de forma dinámica en los organismos vivos 19-25 (véase la discusión de las limitaciones de la técnica FDAP).
Proteínas fotoconvertible son proteínas fluorescentes cuya excitación y de emisión propiedades cambiar después de la exposición a determinadas longitudes de onda de la luz 26. Una variante comúnmente usado es Dendra2, una proteína fotoconvertible "-verde a rojo" que tiene inicialmente excitas y emisión propiedades similares a las proteínas fluorescentes verdes, pero después de la exposición a "fotoconversión" UV iluminación -su de excitación / propiedades de emisión se vuelven similares a los de las proteínas fluorescentes rojas 23,27. Es importante destacar que, nueva proteína producida después de fotoconversión no tendrá las mismas propiedades de excitación / emisión como la proteína photoconverted, lo que permite el desacoplamiento de la producción y el despacho al fotoconversión y la observación de sólo una piscina de la proteína photoconverted. Etiquetado de proteínas de interés con proteínas fotoconvertible tanto, proporciona una manera conveniente a pulso la etiqueta proteínas en organismos vivos, ópticamente accesibles intactas.
En los ensayos de FDAP (Figura 1A), una proteína de interés se marca con una proteína fotoconvertible y se expresa en un organismo vivo (Figura 1B). La proteína de fusión se photoconverted, y la disminución en la señal photoconverted lo largo del tiempo se controla mediante fluorescenmicroscopía ce (Figura 1C). Los datos se ajusta entonces con un modelo apropiado para determinar la vida media de la proteína de fusión (Figura 1D).
El ensayo FDAP descrito aquí fue diseñado para determinar las vidas medias extracelulares de las proteínas de señalización secretadas en embriones de pez cebra durante la embriogénesis temprana 19. Sin embargo, este enfoque puede ser adaptado a cualquier organismo modelo transparente que tolera la formación de imágenes en vivo, y podría ser utilizado para monitorear la liquidación de cualquier proteína intracelular o extracelular taggable. Las variaciones de la técnica descrita aquí se han realizado en células cultivadas Drosophila 20,23 y 22 y 21 embriones de ratón.
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Protocol
1. Generación de un fotoconvertible Fusión Construir y Inyectar dechorionated embriones de pez cebra
- Generar una construcción funcional que contiene la proteína de interés fusionada a una proteína fotoconvertible de verde a rojo (ver Discusión), a continuación, utilizar la transcripción in vitro para generar cubiertas de ARNm que codifica la proteína de fusión como en Müller et al., 2012 19.
- Utilice pronasa para eliminar los chorions de aproximadamente 30 embriones de pez cebra en la etapa de una célula. Alternativamente, dechorionate manualmente embriones utilizando fórceps 28.
Nota: Los embriones deben dechorionated para la imagen posterior. Si se desea, los embriones se pueden inyectar a través del corion y dechorionated más tarde, justo antes de la imagen.- Hacer una solución de 5 mg / ml de stock de pronasa a partir de Streptomyces griseus en medio de embrión de pez cebra 19 estándar. Roca la solución suavemente a TA durante 10 min para permitir que la proteasa se disuelva. Alícuota 2 ml en tubos de microcentrífuga y congelar a -20 ° C.
- De transferencia de fase de una célula embriones a un vaso de diámetro 5 cm o placa Petri de plástico de agarosa-recubierta que contiene ~ 8 ml de medio de embrión. Añadir 2 ml de solución de pronasa Stock descongelado al plato y se incuba a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos.
- Evite la exposición de los embriones al aire o de plástico, ya que el contacto con cualquiera de los dos hará que los embriones dechorionated la rotura. Llene un vaso de vidrio de 200 ml con medio embrión. La transferencia de los embriones al vaso de precipitados por la inclinación de la placa de Petri mientras sumerge en el medio.
- Después de los embriones han depositado en el fondo del vaso de precipitados, se vierte la mayor parte del medio de embrión, luego verter medio de embrión fresco en el vaso de precipitados. El remolino suave del medio de verter en el vaso de precipitados provoca embriones pierdan sus chorions debilitados.
- Repita el paso 1.2.4.
- La transferencia de los embriones dechorionated a un plato de inyección de agarosa recubiertas con 29 utilizando una pipeta Pasteur de vidrio con una punta flameado. Llameantela punta de la pipeta evita que los bordes dentados de embriones hiriendo.
- Co-inyectar el ARNm y un 3 kDa Alexa488-dextrano conjugado 29,30 (Figura 1B; véase la discusión para sugerido ARNm y cantidades Alexa488-dextrano). Inyectar directamente en el centro de la célula (no la yema) para asegurar una distribución uniforme de ARNm y colorante fluorescente una vez que comienza la escisión.
Nota: La señal Alexa488 se utilizará durante el análisis de datos para generar máscaras compartimentales con el fin de distinguir entre la fluorescencia intracelular y extracelular. - Transferencia de embriones inyectados a un pozo de agarosa recubiertas de 1-2% de un plato de seis pocillos de plástico llena de medio de embrión. Incubar en la oscuridad a 28 ° C hasta que los embriones han alcanzado esfera última etapa 31 (aproximadamente después de la fecundación 5 h). Compruebe embriones cada uno a 2 horas bajo un microscopio estereoscópico y eliminar los residuos generados por los embriones que han muerto.
2. Montaje embriones de pez cebra para Photoconversion e Imagen en un microscopio confocal invertido
- Utilice un estereomicroscopio para identificar cuatro y cincuenta y nueve embriones sanos, y utilizar una pipeta Pasteur de vidrio con una punta de flameado para eliminarlos de la placa.
- Expulsar suavemente los embriones en un tubo de microcentrífuga que contiene ~ 1 ml de derretida 1% agarosa de bajo punto de fusión en medio de embrión de 1x Danieau (ver Lista de Materiales) (Figura 2A).
Nota: Agarosa debe tener una temperatura entre 40 y 42 ° C; temperaturas más altas podrían dañar los embriones. - Dibujar los embriones de nuevo en la pipeta junto con algunos de agarosa. Expulsar suavemente la agarosa y embriones en el cristal de la cubierta de un plato de fondo de vidrio (Figura 2B). Asegúrese de que el espesor de la cubierta de vidrio es compatible con el objetivo en el microscopio confocal.
- Re-utilizar la pipeta de vidrio si se desea. Para limpiar la agarosa residual de la pipeta y evitar la obstrucción, de forma rápida medio embrión pipeta hacia arriba y abajo.Colocar un tubo de 15 ml lleno de ~ 5 ml de medio de embrión junto al estereomicroscopio para este propósito.
- Utilice una sonda de metal para colocar los embriones de modo que el polo animal (blastodermo) se enfrenta a la cubierta de vidrio. Trabaje con rapidez ya que la agarosa se solidificará en 20-30 segundos. Utilice el microscopio estereoscópico para supervisar las posiciones de los embriones y reajustar si es necesario hasta que la agarosa se endurece.
- Repetir los pasos 2.1 a 2.4 hasta que se ha montado el número deseado de embriones.
Nota: En un experimento típico, cuatro gotas de agarosa que contienen cuatro o cinco embriones cada una caben fácilmente en la cubierta de vidrio. Alrededor de 16 embriones se pueden obtener imágenes durante un solo experimento ideales (Figura 2C). - Cuando la agarosa se ha solidificado, llenar el plato de fondo de vidrio con medio embrión de 1x Danieau.
3. Photoconverting y medición de la disminución de la señal Photoconverted
Uno de los objetivos 25X o 40X agua is apropiado para el tamaño y el índice de refracción de embriones de pez cebra. Es mejor utilizar aceite de inmersión con el mismo índice de refracción que el agua en lugar de agua real es, ya que el agua se evaporará durante el curso del experimento de cinco horas. Asegúrese de que el aceite de inmersión está diseñado para ser utilizado con un agua (no aceite) objetivo.
- Colocar una gota grande de aceite de inmersión en el objetivo de garantizar que la película de aceite entre el objetivo y la cubierta de vidrio no se romperá como la etapa se mueve a diferentes posiciones embrión durante la formación de imágenes. Coloque de forma segura el plato con fondo de cristal en el escenario para que el plato no se mueva cuando el escenario se mueve. Si es posible, utilice una etapa se calienta a 28 ° C, la temperatura óptima para el desarrollo del pez cebra.
- Definir la posición de cada embrión en el paquete de software del microscopio confocal. Ajuste la profundidad z para cada embrión, y tratar de apuntar a más o menos el mismo plano en cada embrión.
Nota: Sobre 30 micras desde el polo animal es un irprofundidad desde ya que en esta profundidad la capa envolvente del embrión se puede evitar, área de imagen se maximiza, y dispersión de la luz es mínimo. Una sola rebanada óptico con un espesor de ~ 3,3 micras proporciona datos suficientes; no hay necesidad de adquirir una pila z (véase la sección 5). - Recoger dos señales durante el experimento: la señal de "verde" de la Alexa488-dextrano conjugado que se utilizará durante el análisis de datos para aislar extracelular e intracelular de fluorescencia y la señal de "red" de la proteína de fusión después de que se photoconverted.
- Excite Alexa488 utilizando un láser de 488 nm, y recoger la fluorescencia emitida entre ~ 500 y 540 nm. Nota: Después de fotoconversión, muchos de verde a rojo proteínas fotoconvertible (por ejemplo, Dendra2) puede ser excitado con un láser de 543 nm y emiten fluorescencia entre ~ 550 y 650 nm. Ajuste según sea necesario en función de la proteína fotoconvertible utilizado.
- Adquirir "pre-fotoconversión"Las imágenes, y configurar el software del microscopio confocal de imagen cada una de las posiciones previamente definidas (desde el paso 3.2) con las condiciones de imagen apropiadas cada 10 o 20 minutos para un curso de tiempo de cinco horas (ver sección 5 y Discusión).
- Para photoconvert la proteína de fusión, cambiar a un objetivo de 10X y exponer grupos de embriones a la luz UV de una lámpara de arco de mercurio con un filtro de ~ 300-400 nm de excitación en la salida 100% durante 2 min. Cambiar el enfoque a lo largo del eje z para promover fotoconversión uniforme (véase la Sección 5). Asegúrese de que el aceite de inmersión no gotee sobre el objetivo 10x durante fotoconversión.
Nota: El cambio de enfoque durante fotoconversión podría ser automatizado con el fin de evitar la variabilidad entre los experimentadores. - Cambie de nuevo al objetivo 25X o 40X inmediatamente después fotoconversión. Asegúrese de que las posiciones previamente definidas desde el paso 3.2 siguen siendo precisa. Si el plato se desplazó durante photoconversión, vuelva a definir las posiciones de los embriones.
- Inicie el programa creado en el paso 3.4 y permite imágenes de continuar durante 5 horas. Tenga en cuenta el tiempo transcurrido entre fotoconversión y el inicio de formación de imágenes para cada embrión.
- Comprobar de vez en cuando en el experimento. Controle el nivel de medio de Danieau y añadir más si es necesario. Reinicie el software si se ha estancado.
- Con el fin de determinar los valores de fluorescencia de fondo que se utilizará durante el análisis de datos para estimar la asíntota de un modelo exponencial decreciente, incluir algunos embriones que han sido inyectados con Alexa488-dextrano pero no mRNA en el experimento. Para determinar el ruido del instrumento, que también se utiliza durante el análisis posterior de los datos, adquirir una imagen en ausencia de una muestra.
4. El análisis de los datos mediante PyFDAP
- Inspeccione visualmente el tiempo de los conjuntos de datos curso de cada embrión. Deseche los conjuntos de datos a partir de embriones que murieron durante imaging, que cambió de manera significativa, que tienen muy bajos niveles de señal photoconverted, o que contienen regiones de células con aspecto inusual y han dejado de moverse y dividiendo (típico de embriones heridos o enfermos).
Nota: En ocasiones, las burbujas en el aceite de inmersión u otros artefactos aparecerán en una o dos imágenes en un conjunto de datos de otra forma utilizable. Nota alguna de las imágenes que contienen artefactos; que serán descartados después, y los puntos de tiempo restante desde un conjunto de datos tales todavía pueden ser analizados. - Utilice el paquete de software PyFDAP basado en Python para analizar los datos FDAP. PyFDAP calcula vidas medias mediante la determinación de la intensidad media de fluorescencia roja intracelular y extracelular en cada imagen y ajuste de los datos con una función exponencialmente decreciente 56 (Figura 3).
- Descarga PyFDAP (ver Lista de Materiales).
- Uso PyFDAP para separar la señal intracelular y extracelular photoconverted (Figura 3A, B). Nosotrose la señal Alexa488, que es estrictamente intracelular, para crear una máscara de intracelular. Aplique esta mascarilla para la imagen del canal rojo correspondiente para evitar píxeles intracelulares de ser considerado en el cálculo de la intensidad media extracelular. Para medir la intensidad media intracelular, invertir la máscara.
- En PyFDAP, mostrar las imágenes enmascaradas generados en el paso 4.2.2. Inspeccione visualmente estas imágenes y descarte los conjuntos de datos en la que las máscaras no distinguen con precisión intracelular desde el espacio extracelular (esto debe ser raro; en cuenta que las membranas celulares se incluyen en imágenes en las que el espacio extracelular se ha enmascarados, pero podrían ser eliminados por alterar el umbral algoritmo o mediante la introducción de una máscara de membrana (por ejemplo, usando la membrana PPC)). También deseche cualquier imágenes individuales que contienen artefactos (por ejemplo, las burbujas en el aceite de inmersión) identificados en el paso 4.1.
- Utilice PyFDAP para calcular la media intensidad de fluorescencia extracelulares e intracelulares para each imagen. PyFDAP calcula los promedios sumando las intensidades de los píxeles que caen fuera de la máscara y dividiendo por el número total de píxeles sumadas.
- Coloque los datos de fluorescencia (Figura 3C) con la siguiente función exponencial:
donde t es el tiempo post-fotoconversión, c (t) es la intensidad a un valor dado de t, c 0 es la intensidad en t = 0, k es la constante de velocidad de eliminación, e y 0 es la asíntota que la función se acerca como fluorescencia disminuye (Figura 1D). y 0 puede ser limitado basado en las mediciones en el paso 3.8 19. - Utilice PyFDAP para calcular la vida media de la proteína extracelular e intracelular (τ) de las constantes de velocidad de aclaramiento (k) utilizando la siguiente relación:
5. Los experimentos de control para evaluar Photobleaching, inadvertida Fotoconversión y Fotoconversión Uniformidad
- Fotoblanqueo Evaluación
Nota: Photobleaching podría causar una disminución en la intensidad de fluorescencia de artefactos que refleja las propiedades blanqueadoras de la proteína fluorescente, además de la eliminación de la proteína de interés.- Para evaluar la posible fotoblanqueo, realizar una serie de experimentos FDAP con intervalos de 10 minutos entre imágenes y un segundo grupo con 20 min intervalos entre las imágenes (Figura 4). Analizar los datos de ambos conjuntos de experimentos utilizando PyFDAP como se describe en la Sección 4.
- Comparar la vida media de los 10 y 20 experimentos de intervalo min. Media más larga vida de 20 min experimentos de intervalo indican fotoblanqueo significativo. Si las vidas medias de ambos experimentos son idénticos, Fotosobleaching no es una preocupación significativa.
- Por otra parte, evaluar fotoblanqueo mediante la adquisición de una serie de ~ 30 imágenes inmediatamente después fotoconversión. Una disminución significativa en la intensidad de fluorescencia indica photobleaching significativo.
- Si se detecta fotoblanqueo, utilizar la potencia del láser inferior, disminuir el tiempo de formación de imágenes, o considerar el uso de una proteína fotoconvertible más fotoestable 32.
- Evaluación de fotoconversión inadvertida.
Nota: se puede Dendra2 photoconverted usando 488 nm iluminación 27. Cuando Alexa488 emocionante con el láser de 488 nm tal como se describe en el paso 3.3.1, fotoconversión inadvertida y por lo tanto un aumento de artefactos en la vida media aparente de la proteína de interés es posible. Sin embargo, nosotros y otros 33 hemos encontrado que 488 nm iluminación es un método ineficiente de fotoconversión en embriones de pez cebra.- Utilice el experimento de control se describe en el paso 5.1.1 para detectar fotoconversión inadvertida. Comparar la vida media de los 10 y 20 experimentos de intervalo min. Vidas medias más cortas de 20 minutos de intervalo experimentos indican fotoconversión involuntaria significativa. Si las vidas medias de ambos experimentos son idénticos, fotoconversión inadvertida no es una preocupación significativa.
- Si se detecta fotoconversión inadvertida, utilice una fuente de láser de 488 nm inferior y los tiempos de imagen más cortos para evitar inadvertidamente photoconverting Dendra2.
- Evaluación de la homogeneidad fotoconversión.
Nota: Si fotoconversión está sesgado hacia el polo animal del embrión, la disminución de la fluorescencia se verá influenciada por difusión proteína o el movimiento celular en planos más profundos (Figura 5A).- Para determinar si fotoconversión es uniforme, expresar una proteína secretada fotoconvertible (para los experimentos con proteínas de fusión extracelulares) o una proteína citoplasmática fotoconvertible (para los experimentos con proteínas de fusión intracelulares). Photoconvert como de costumbre, tgallina adquieren un z-pila que abarca la mayor parte del blastodermo cada 20 min durante 80 min.
- Si fotoconversión está sesgada hacia el polo animal, la intensidad de fluorescencia en planos más profundos aumentará con el tiempo debido a la difusión o movimiento de las células (Figura 5B). Si se detecta fotoconversión no uniforme, se centran más en los embriones durante fotoconversión.
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Representative Results
FDAP se ha utilizado para determinar la vida media de las proteínas de señalización extracelular en embriones de pez cebra 19. Una de estas proteínas, estrabismo, induce la expresión de genes mesendodermal durante la embriogénesis 34. Estrabismo-Dendra2 activa la expresión de genes mesendodermal en niveles similares a untagged Estrabismo, como se demuestra por QRT-PCR y en ensayos de hibridación in situ 19. Los embriones se co-inyectados con Alexa488-dextrano y ARNm que codifica Squint-Dendra2 y se sometió al ensayo FDAP. Una disminución en la intensidad de la señal extracelular photoconverted lo largo del tiempo es evidente (Figura 4A). Perfiles de intensidad extracelulares de 23 embriones fueron generados usando PyFDAP. Los datos resultantes se ajustó en PyFDAP con un modelo de cinética de depuración de primer orden, y una constante de velocidad k aclaramiento promedio de 1,00 x 10 -4 / seg, que corresponde a un τ vida media promedio de 116 min, se determinó. Perfil de intensidad similaress y de tasa de aclaramiento de las constantes se obtuvieron cuando los intervalos entre las imágenes eran 10 o 20 min, lo que sugiere que photobleaching o inadvertida fotoconversión no contribuyó significativamente a los cambios de intensidad (Figura 4B).
Figura 1. Fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP) resumen. (A) de flujo de trabajo de un experimento FDAP. (B) La inyección de ARNm y un tinte fluorescente en un embrión de pez cebra en la etapa de una célula. La proteína se produce a partir del ARNm como el embrión se desarrolla durante aproximadamente 5 horas antes de la formación de imágenes. El tinte etiquetas de células (círculos verdes). (C) La proteína de fusión se photoconverted utilizando un pulso de UV, y la disminución en la intensidad de la señal de photoconverted lo largo del tiempo se controla. (D) Los datos están equipados con un exponencialmente decreciente función para obtener las constantes de velocidad aclaramiento (k) y la vida media (τ). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Montaje embriones de pez cebra para experimentos FDAP. (A) embriones de pez cebra (blastoderm = blanco, yema = negro) se transfieren de medio de embrión (azul) en agarosa derretida (amarillo). (B) Los embriones y agarosa se colocan en el cristal de la cubierta de un plato de fondo de vidrio. Los embriones se colocan entonces manualmente de modo que el polo animal se enfrenta a la cubierta de vidrio. Se muestra una sección transversal de un plato de fondo de vidrio. (C) Esquema general de un plato de fondo de vidrio con varias gotas de agarosa que contenían cuatro embriones cada uno (ver mirando hacia abajo en el plato).w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de los datos usando PyFDAP. (A) PyFDAP utiliza el algoritmo de umbral Otsu 35 para generar máscaras intra y extracelulares de la señal intracelular Alexa488 (verde). (B) Señal Photoconverted (rojo) de un embrión que expresa una proteína de fusión Dendra2 secretada (Estrabismo-Dendra2 19). Promedio de las intensidades de fluorescencia extra e intracelulares se calcularon utilizando las máscaras mostradas en (A). El espacio exterior del embrión fue excluido de estos cálculos descartando píxeles fuera del círculo amarillo. (C) PyFDAP captura de pantalla que muestra los datos de intensidad extracelulares de un experimento FDAP (cir negroculos) equipado con una función exponencial decreciente (línea roja discontinua). La vida media de extracelular está indicada por la flecha roja. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Los resultados representativos FDAP. (A) Un embrión representante expresar secretada Estrabismo-Dendra2 justo antes fotoconversión (a la izquierda) y el 27, 87 y 287 minutos después de la fotoconversión. (B) Para controlar para photobleaching y fotoconversión accidental (véase la Sección 5), se realizaron experimentos con intervalos de 10 o 20 min (datos de Müller et al., 2012 19). En PyFDAP, se generaron perfiles de intensidad extracelulares, equipados con funciones exponencialmente decrecientes, y normalizado por subtracr la c equipada y 0 el valor de cada punto de datos y dividiendo por el amueblada c 0 valor. Los datos de la 10 min (negro, n = 11) y 20 min (azul, n = 12) experimentos de intervalo se promediaron, respectivamente. Las barras de error indican la desviación estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Evaluación de la homogeneidad de fotoconversión. (A) fotoconversión no uniforme de una proteína extracelular puede conducir a una vida media aparente erróneamente corto si la proteína photoconverted difunde en planos más profundos en el tiempo. (B) Para determinar si fotoconversión es uniforme, un z-pila que cubre la mayor parte del blastodermo se adquiere en varios puntos de tiempo post-photoconversde iones. La intensidad de fluorescencia se incrementará en planos más profundos con el tiempo si fotoconversión era no uniforme (tenga en cuenta que la dispersión de luz provoca planos más profundos a aparecer menos brillante que los planos superiores). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El éxito de un experimento FDAP se basa en la generación de una proteína de fusión fotoconvertible funcional. Etiquetado de una proteína puede afectar a su actividad biológica y / o propiedades biofísicas, incluyendo su localización, la solubilidad y la estabilidad 36-41. Estar preparado para probar la actividad de varias construcciones de fusión diferentes con el fin de encontrar uno que es activo. Hemos encontrado que el cambio de la posición de la proteína fotoconvertible relación a la proteína de interés o utilizando enlazadores más largos (por ejemplo, usando la secuencia de aminoácidos LGDPPVAT 19) puede mejorar la actividad de la proteína de fusión. En el caso de las proteínas de señalización, la actividad de la proteína de fusión puede determinarse ensayando su capacidad para inducir la expresión de genes diana 19. QRT-PCR o hibridación in situ proporcionan buenas lecturas de expresión del gen diana 19. Tenga en cuenta que el protocolo descrito aquí está diseñado para determinar la estabilidad de las proteínasa principios del embrión de pez cebra y requeriría la modificación para evaluar la estabilidad de proteínas en otros contextos.
La proteína fotoconvertible de verde a rojo Dendra2 27 ha sido utilizado con éxito en experimentos de pez cebra FDAP 19 (Figura 4), pero otras opciones están disponibles 26,42. Para evitar posibles artefactos debido a la agregación de la proteína de fusión, elija una proteína fotoconvertible monomérica. Fotoactivable proteínas también pueden usarse en ensayos de FDAP 20-22,26.
Antes de realizar un experimento FDAP, es necesario optimizar varios aspectos del protocolo. Inyectar diferentes cantidades de ARNm para determinar la cantidad más baja que proporciona señal utilizable después fotoconversión; ~ 50 pg ARNm es una buena cantidad de partida. Con el fin de generar máscaras compartimentales significativas (Figura 3), la señal Alexa488 debe ser lo suficientemente brillante como paracompetir contra la señal de la proteína de fusión no photoconverted que se produce constantemente a partir del ARNm inyectado; inyectar entre 0,2 y 4 ng de Alexa488-dextrano para encontrar la cantidad óptima de colorante fluorescente. Encuentra las condiciones óptimas de imagen después de la conversión y el uso de las mismas condiciones para todos los experimentos con una construcción dada. Utilice una buena imagen cuantitativa practica 43, y elija un rango dinámico adecuado para evitar píxeles saturados en el canal rojo. Determine el intervalo de imagen adecuada para cada proteína de fusión. Las proteínas con vidas medias muy cortas pueden requerir formación de imágenes más frecuentes durante un período de tiempo total más corto. Establecer la técnica fotoconversión óptima basada en el organismo y la proteína fotoconvertible utilizado. Se describe un método fotoconversión robusto utilizando una lámpara de arco de mercurio en el paso 3.5, pero Dendra2 también podemos ser photoconverted con un láser de 405 nm 33 o 488 27.
Uno limitation de este protocolo FDAP es que se requiere la sobreexpresión de la proteína de interés. La sobreexpresión podría afectar a la estabilidad de proteínas, por ejemplo, a través de la expresión anormal de otros genes que modifican cinética de depuración de la proteína 14,44. Si la proteína de interés es una molécula de señalización, considerar la realización de experimentos en presencia de un inhibidor de la señalización para determinar si el bloqueo de la expresión de genes diana afecta a la estabilidad de proteínas. En el futuro, puede ser posible generar embriones transgénicos que expresan fusiones fotoconvertible bajo el control de elementos de expresión endógenos 45-50. Si los embriones transgénicos producen señal suficiente, experimentos FDAP en un contexto no sobreexpresión son concebibles, tal vez usando microscopía de luz hojas de observar disminución de la fluorescencia en todo el embrión 51.
Posibles aplicaciones adicionales de FDAP incluyen la investigación del Tha mecanismost regulan estabilidad de la proteína mediante el examen de los efectos de diferentes perturbaciones (por ejemplo, la expresión de las proteasas putativas) o modificaciones de la proteína (por ejemplo, fosforilación) sobre la estabilidad. Por ejemplo, los factores que controlan la estabilidad extracelular de estrabismo son actualmente desconocidos. Muchas señales de desarrollo secretadas son internalizados por las células de 52-55, que podrían contribuir a la liquidación de estrabismo y otros ligandos del espacio extracelular. Experimentos FDAP en que la internalización se bloquea podría proporcionar información sobre los mecanismos que controlan la eliminación de proteínas extracelulares.
En contraste con los ensayos convencionales para medir la estabilidad de la proteína 15, FDAP ofrece una alternativa basada en microscopía en el que la eliminación de proteínas se puede controlar a través del tiempo dentro de los organismos vivos. Métodos similares se han utilizado para controlar eliminación de proteínas en sistemas de modelos distintos de embriones de pez cebra 2023. Este protocolo FDAP tiene el potencial de ser adaptado para determinar la vida media de cualquier proteína taggable en los sistemas biológicos en imágenes en vivo es factible.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos a revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Jeffrey Farrell, James Gagnon, y Jennifer Bergmann para comentarios sobre el manuscrito. KWR fue apoyada por el Programa de Becas de la Fundación Nacional de Ciencia de Posgrado de Investigación durante el desarrollo del ensayo FDAP. Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH para AFS y por becas de la Fundación Alemana de Investigación (Programa de Emmy Noether), la Sociedad Max Planck, y el Programa de Human Frontier Science (Premio de carrera) a PM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Life Technologies | AM1340 | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | |
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage |
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use |
| Glass Pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos |
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 |
| 15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium | BD Falcon | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | |
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25X or 40X water objective | Objective for imaging | ||
| 10X air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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