Abstract
Synaptic пузырьки выпустить нейротрансмиттеров на химических синапсов с помощью динамического цикла синтеза и поиска. Мониторинг синаптической активности в режиме реального времени и рассечения различные этапы экзо-эндоцитоза на уровне одного пузырька имеют решающее значение для понимания синаптические функции в норме и патологии.
Генетически кодируется рН-чувствительных датчиков, непосредственно направленные на синаптических пузырьков и полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM) обеспечивают пространственно-временным разрешением необходимую для отслеживания динамики пузырьков. Мимолетны поле, создаваемое полного внутреннего отражения может только возбудить флуорофоров, размещенные в тонком слое (<150 нм) выше стеклянной крышкой, на которой клетки придерживаться именно там, где имеют место процессы экзо-эндоцитоза. В результате высокая контрастность изображения идеально подходит для пузырьков отслеживания и количественного анализа событий слияния.
В этом протоколе, SH-SY5Y человек пeuroblastoma клетки предлагаются в качестве полезной моделью для изучения высвобождение нейромедиаторов на уровне одного пузырька по TIRFM, из-за их плоской поверхности и в присутствии дисперсных пузырьков. Способы выращивания SH-SY5Y как адгезивные клетки, а также для трансфекции их synapto-pHluorin предоставляются, а также методики для выполнения TIRFM и визуализации. Наконец, стратегия стремится выбрать, рассчитывать и анализировать события в стиле фьюжн в уровнях цельноклеточных и одного пузырька представлены.
Для проверки метода анализа процедуры визуализации и передачи данных, динамика pHluorin-меченых везикул анализироваться в рамках отдыха и стимулировали (деполяризующими концентрации калия) условия. Деполяризацию мембраны увеличивает частоту событий слитых и вызывает параллельное повышение чистого сигнала флуоресценции, записанной в целой клетки. Анализ Single-пузырек показывает изменения поведения Fusion-событий (увеличение максимальной высоты и ширины). Эти данные свидетельствуют о йв деполяризации калия не только вызывает массовое освобождение нейромедиатора, но также изменяет механизм слияния пузырьков и утилизации отходов.
При соответствующей флуоресцентного зонда, эта техника может быть использована в различных клеточных системах рассекать механизмы конститутивной и стимулированную секрецию.
Introduction
Химический синаптической передачи между нейронами является основным механизмом связи в нервной системе. Он опирается на высвобождение нейротрансмиттеров через динамический цикл слияния пузырьков и поиска в пресинаптической сайте. Многие из белков, участвующих в динамике везикулы были определены; Однако, их удельный вклад в феномен еще предстоит уточнить 1.
Наше понимание отчасти ограничена тем, что наиболее широко используемые тесты на экзо / эндоцитоза не всегда являются наиболее подходящим. Несколько исследований, связанных с слияния пузырьков и динамика полагаться на электрофизиологических методов. Эта техника обеспечивает оптимальную временное разрешение и отлично подходит для исследования начальной слияние везикул к плазматической мембране, но не в состоянии обнаружить многие из основных молекулярных событий, которые поддерживают пресинаптической функции. Электронная микроскопия, с другой стороны, обеспечивает лучшие morphologicaл описание каждой особой стадии, но в динамическом аспекте случае не может быть захвачен, потому что образцы должны быть установлены для того, чтобы анализировать.
Появление новых методов оптической записи 2,3, в сочетании с прогрессом в разработке флуоресцентного молекулярных зондов 4-6, обеспечивает визуализацию exocytic процессов в живых клетках, тем самым обеспечивая новый уровень информации о синаптической структуры и функции.
Первоначальные исследования эксплуатируемые деятельности зависит от стириловые красители (FM1-43 и связанные с ними органические красители) 7,8. Государство-оф-арт-методы визуализации использовать рН-чувствительных варианты зеленого флуоресцентного белка (GFP) (pHluorin) привязаны к просвете пузырьки белков 9. Эти датчики, как правило, выключается, когда присутствует в пузырьки из-за низкой просвета рН. После слияния с плазматической мембраной, внутренняя пузырьков подвергается нейтральной внеклеточном пространстве, рН резко возрастает, снимает протонов в зависимости от тушения pHluorin и быстро появляется флуоресцентный сигнал. Как изменения в pHluorin быстрее, чем событие слияния, путем мониторинга флуоресценции возрастает, слияния пузырьков с мембраной могут быть измерены и проанализированы. Поскольку поверхность pHluorin с метками молекулы эндоцитарных, сигнал флуоресценции затем возвращается к исходному уровню, поэтому в тот же конструкция может быть использована также для мониторинга пузырек рециркуляции 9.
В то время как пузырек с метками pH-сенсор обеспечивает визуализацию только тех пузырьки, которые действительно сливаются с плазматической мембраной, изображения с высоким пространственным и временным разрешением требуется описать в деталях этапы экзо / эндоцитических процессов. Оптический метод, который обеспечивает необходимую пространственно-временное разрешение полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM), применение флуоресцентной микроскопии 10.
"> Полное внутреннее отражение происходит на границе раздела между стеклом покровным стеклом и образцом. При светлый путь достигает стеклянной крышкой скольжения с углом падения большим, чем критический угол, свет возбуждения не передается в образце, но полностью отражается обратно. В этих условиях, затухающих световой волны формы на границе и распространяется в среде с меньшим оптической плотности (образца). Как интенсивность исчезающего поля убывает экспоненциально с расстоянием от границы (с глубиной проникновения 100 нм) только флуорофоров в непосредственной близости к покровным стеклом могут быть возбуждены в то время как еще дальше от границы нет. В клетках, трансфицированных GFP-конструкций, эта глубина соответствует белков, экспрессированных на плазматической мембране или в везикулярных структур приближается к нему. Как флуорофоры в внутрь клетки не могут быть возбуждены, фон флуоресценции сведено к минимуму, и изображение с очень высоким отношением сигнал / фон крысыIO формируется 11.Несколько характеристики делают TIRFM методом выбора для контроля везикулы динамику. Идеальный контраст и высокое отношение сигнал-шум-отношение позволяют обнаруживать очень низких сигналов, возникающих из единичных пузырьков. Чип на основе захвата изображения в каждом кадре обеспечивает временное разрешение, необходимое для обнаружения очень динамичные процессы. Наконец, минимальное воздействие клеток к свету в любой другой плоскости образца, резко снижает фототоксичность и позволяет длительное время покадровой записи 12.
Анализ данных остается наиболее сложной и важным аспектом этой техники. Самый простой способ для контроля слияния пузырьков состоит в измерении накопления репортера флуоресцирующих белков на поверхности клетки, с течением времени 13. Как синтеза увеличивается, чистое увеличение сигнала флуоресценции, а также. Тем не менее, этот метод может недооценивать процесс, особенно в больших клетках, и в состоянии покоя условий,потому что эндоцитоза и Фотообесцвечивания процессы компенсировать увеличение интенсивности флуоресценции от пузырьков экзоцитоза. Альтернативным методом является следовать каждый отдельный случай слияния 14. Этот последний метод является очень чувствительным и может раскрыть важные данные о механизмах синтеза. Тем не менее, он требует ручной выбор отдельных событий, потому что полностью автоматизированные процедуры, чтобы следовать пузырьки и зарегистрировать колебания их флуоресцентных сигналов не всегда доступны. Наблюдение динамики пузырька требуется клетки Отбор проб на высокой частоте. Это приводит к большой объем данных, которые практически не могут быть проанализированы вручную.
Предложение данной работы является оптимизация технику отображения TIRFM для мониторинга базальной и стимулированной высвобождения нейромедиаторов в нейробластомы клеточной линии SH-5YSY, и описать, шаг за шагом, процедура разработана в лаборатории для анализа данных, как на уровне целых клеток и одного пузырька.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss |
491912-9850-000 | inverted microscope |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos |
00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser |
| Laser TIRF slider | Zeiss |
423681-9901-000 | |
| 100X Objective | Zeiss |
421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging |
||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company |
||
| Software | |||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics |
spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination | |
| Excel | Microsoft |
photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. |
statistical analysis | |
References
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
- Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
- Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
- Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
- D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
- Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
- Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
- Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
