Summary
مع هذه الدراسة، ونحن نقدم نموذجا الإجهاد موحد لشبكية العين الأبقار superfused معزولة للاختبار العلاجي قبل السريرية في المستقبل. تم تقييم تأثير إما نقص الأكسجة (النقي N 2) أو الإجهاد الغلوتامات (250 ميكرومتر الغلوتامات) على وظيفة الشبكية التي يمثلها أ وسعة ب الموجة.
Abstract
وكانت العصبية حقل قوي من التحقيق في الأبحاث لطب العيون في العقود الماضية، ويؤثر على أمراض مثل الزرق، وانسداد الأوعية الدموية في شبكية العين، انفصال الشبكية، واعتلال الشبكية السكري. وكان الهدف من هذه الدراسة إلى تقديم نموذج موحد لاختبار الإجهاد العلاجي قبل السريرية في المستقبل.
تم إعداد شبكية العين الأبقار ومع perfused حل الأكسجين المشبعة المعيار، وتم تسجيل ERG. بعد تسجيل مستقرة ب-الأمواج، نقص الأكسجة (N النقي 2) أو الإجهاد الغلوتامات (250 ميكرون الغلوتامات) تم بذلها لمدة 45 دقيقة. للتحقيق في الآثار المترتبة على وظيفة مبصرة وحدها، أضيف 1 ملم اسبارتاتي للحصول على موجات. تم رصد أرج استرداد لمدة 75 دقيقة.
لنقص الأكسجين، لوحظ وجود انخفاض في الموجة سعة 87.0٪ (P <0.01) بعد وقت المعرض من 45 دقيقة (انخفاض بنسبة 36.5٪ بعد نهاية تبييض ع = 0.03). بالإضافة إلى ذلك، decr الأوليسهولة في سعة ب-موجة وسجلت 87.23٪، التي وصلت إلى دلالة إحصائية (P <0.01، بانخفاض قدره 25.5٪ في نهاية الغسل، ص = 0.03).
ل 250 ميكرون الغلوتامات، تخفيض 7.8٪ الأولي من سعة في الموجة (P> 0.05)، يليه انخفاض قدرها 1.9٪ (P> 0.05). والحد من 83.7٪ من سعة الموجة ب (P <0.01) لوحظ. بعد فشل 75 دقيقة كان انخفاض 2.3٪ (ع = 0.62). في هذه الدراسة، يتم تقديم نموذج موحد الإجهاد التي قد تكون مفيدة لتحديد آثار اعصاب محتملة في المستقبل.
Introduction
وكانت العصبية حقل قوي من التحقيق في الأبحاث لطب العيون في العقود الماضية. شبكية العين هي شبكة الخلايا العصبية الحساسة للغاية التي تعتمد بشكل كبير على الأوكسجين وتتأثر بشدة عملية التمثيل الغذائي للخلايا المحيطة بها. أمراض العين الرئيسية المتعلقة تلف الخلايا العصبية هي انسداد الأوعية الدموية في شبكية العين، والزرق، وانفصال الشبكية.
في شبكية العين انسداد الشريان، كمثال لشبكية العين انسداد الأوعية الدموية، ويؤدي إلى فقدان مفاجئ للرؤية بسبب نقص الأكسجين في شبكية العين الداخلية 1. وغالبا ما تترافق مع أمراض الأوعية الدموية العامة (2) ويؤدي إلى فقدان البصر المستمرة 1، مع 8٪ فقط من المرضى يتعافى حدة البصر بشكل ملحوظ 1. وعلى الرغم من انحلال الفيبرين الشرياني وقد اقترح كخيار العلاج، لا يمكن أن تظهر فائدة في تجربة سريرية عشوائية 3.
الزرق وانفصال الشبكيةعلى حد سواء وزيادة في تركيز الصوديوم 4-6. واجه الغلوتامات في ظل الظروف الفسيولوجية باعتبارها مثير الارسال في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي كله، وشبكية العين 7،8 الداخلي. تم العثور على مستويات مرتفعة الغلوتامات ليس فقط في الزرق وانفصال الشبكية 5،6 ولكن أيضا في اعتلال الشبكية السكري التكاثري 9. زيادة في الغلوتامات ربما يؤدي إلى التحفيز الزائدة، وبالتالي تلف الخلايا العصبية 10. في معظم حالات انفصال الشبكية، وفي بعض الحالات من التكاثري جراحة اعتلال الشبكية السكري على الشبكية (الجزء المسطح استئصال الزجاجية) ضرورية. خلال الجزء المسطح استئصال الزجاجية التلاعب الميكانيكية، والضوء الساطع من الألياف البصرية أو إجهاد القص التي كتبها معدلات تدفق عالية من حلول الري المبذولة خلال عمليات طويلة تمارس إجهادا إضافيا على شبكية العين 11،12.
جميع الأمراض المذكورة تشترك في أن علم الأمراض المترجمة إلى ريتينوحده، وتشكل المجتمع بأمراض في العيون مع التحدي لايجاد سبل لحماية شبكية العين كنظام العصبي الحسي.
في مخطط كهربية الشبكية (أرج) هو الطريقة المعيارية لتقييم وظيفة في الجسم الحي مستقبلة للضوء (أ-موجة) وظيفة من وظائف شبكية العين الداخلية (ب الموجة). يتم قياس أرج كل أقطاب الفضة التي أدخلت على القرنية ويتم تحفيز العينين عن طريق زيادة مستوى الضوء للكشف عن عيوب في قضبان أو الأقماع أو في شبكية العين الداخلية. يمكن الكشف عن عيوب مختلفة في شبكية العين بسبب التغيرات في السعة (قوة الاستجابة) أو الكمون (للاستجابة الفاصل الزمني إلى) من أرج. أرج البروتوكول وقياس أساليب مختلفة (نمط أرج، متعددة البؤر-ERG أو حقل مشرق أرج) تسمح بالمزيد من التمايز من العيوب. تم إدخال تقنية شبكية العين معزولة في الآونة الأخيرة، مما يجعل من الممكن لتقييم الآثار على شبكية العين دون تدخلات من مثل حيوان الدراسةردود الفعل العامة 13،14.
وكان الغرض من هذه الدراسة لتقييم وتقديم نموذج الإجهاد محددة وموحدة لنقص الأكسجة والإجهاد الغلوتامات على شبكية العين معزولة superfused. وبالتالي، فإننا نأمل أن وضع الأسس للدراسات المستقبلية على آثار اعصاب من بعض وكلاء أو حلول الري داخل العين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الأبقار عيون
- الحصول على عيون البقر مباشرة بعد ذبح الحيوان.
- نقل وجهة نظر محمية في "Sickel-حل" وسيلة خاص يحتوي على 120 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 0.1 ملي MgCl 2، 0.15 ملي CaCl 2، 1.5 ملي ناه 2 PO 4، 13.5 ملي نا 2 هبو 4 و 5 ملي الجلوكوز في RT.
- أداء إعداد الشبكية في ظل ظروف الظلام تكييفها مع ضوء أحمر خافت.
- إزالة الجزء الأمامي من العين. إجراء شق كاليفورنيا. الاستوائي 4 مم الخلفي لحوف. بعد ذلك إزالة القرنية، القزحية والجسم الهدبي والعدسة في قطعة واحدة. الحفاظ على شبكية العين في Sickel-حل.
- ميكانيكيا تخفيف المرفقات زجاجي على سطح الشبكية وإزالة الجسم الزجاجي من كأس العين مفتوحة.
- بعد ذلك تقسيم العين إلى أربعة أجزاء ولكمة من الجولة مناطق من كاليفورنيا. 7 مم باستخدام منقب.
- فصل بلطف شبكية العينمن الظهارة الصبغية ووضعه على جهاز تسجيل داخل علبة محمية من الضوء. يتكون جهاز التسجيل من معيل البلاستيك مع شبكة في الوسط، وضع شبكية العين على شبكة ومن ثم اصلاحها مع حلقة بلاستيكية مباشرة على الأقطاب الكهربائية.
ملاحظة: إن معيل البلاستيك لديها قناتين للسماح لتدفق مستمر من المتوسط.
2. تسجيل في مخطط كهربية الشبكية (أرج)
- من أجل تسجيل مخطط كهربية الشبكية، واستخدام قطبين الفضة / الفضة كلوريد على جانبي شبكية العين ويروي شبكية العين في سرعة ثابتة نضح من كاليفورنيا. 1 مل / دقيقة ودرجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية. استخدام "Sickel-حل" مشبع بالأكسجين.
- قبل البدء في القياس، التكيف مع الظلام شبكية العين (حمايته من الضوء خلال جميع القياسات) واستخدام فترات التحفيز من خمس دقائق. استخدام 1 هرتز واحد أبيض فلاش زينون لتحفيز مع كثافة المقرر أن 6.3 MLX على سطح الشبكية. استخدام معايرة مرشحات الكثافة محايدة وحافزا خفيفة من 10 μsec التي يسيطر عليها جهاز توقيت من أجل الحصول على الاستجابات المثلى.
- لقياس ومعالجة البيانات، تصفية أرج وتضخيمها (100 هرتز تمريرة عالية التصفية، 50 هرتز مرشح الشق، 100،000 س التضخيم) باستخدام العشب RPS312RM مكبر للصوت. محاولة لتصفية الترددات المزعجة المحتملة التي قد تعكر صفو الإشارة. من أجل معالجة البيانات، واستخدام لوحة اكتساب التناظرية إلى الرقمية البيانات على جهاز كمبيوتر سطح المكتب (PC متوافق).
- بعد فترة التكيف السوداء تحت نضح المستمر، وقياس سعة من الإشارة الكهربائية حتى يتم تسجيل مستقرة سعة ب الموجة.
تعتبر مدى التردد مستقرة إذا خمسة قياسات واحدة تصل قيمة المتوسط وتنحرف أقل من 10٪: ملاحظة. ويرد مثال جيد على قياسات واحدة في الشكل 1. - لبدء الاختبار، ويحل محل الأكسجين النقي من قبل أي من النيتروجين النقي (عدد من التجارب واحدة، ن = 5) لاختبار لنقص الأكسجةأو 250 ميكرون الغلوتامات (ن = 5).
- تسجيل الاستجابات الكهربائية كل 5 دقائق لمدة 45 دقيقة.
- بعد فترة الاختبار، ويروي شبكية العين مع المتوسط القياسي مشبع بالأكسجين لمدة 75 دقيقة وإلقاء نظرة على التغييرات من السعة ب الموجة. وهذه هي المرحلة من الاخفاق. قياس السعة ب-موجة من الحوض الصغير من على الموجة إلى ذروة ب الموجة.
- لدراسة تأثير نقص الأكسجين أو الغلوتامات على إمكانية مستقبلة للضوء في ظل ظروف ظلامية، قمع ب الموجة بإضافة 1 ملم إلى المحلول المغذي.
- بعد أن سجل إمكانات مبصرة مستقرة لمدة 30 دقيقة، تنفيذ الإجراء كما كان من قبل، ويعرض شبكية العين 45 دقيقة إلى حلول الري المختلفة مع 1 ملم اسبارتاتي. استخدام نفس الفترة تبييض (خطوة 2.8) كما ذكر في وقت سابق.
تحليل 3. البيانات
- من أجل تقييم البيانات إحصائيا، وضمان التوزيع الطبيعي لجميع البيانات، على سبيل المثال باستخدام كولموغوروف سميرنوف-اختبار 15.
- حساب الحد من أ ب الموجة سعة في النسب المئوية بعد مرحلة التعرض بالمقارنة مع قياس الأخير قبل المعرض. قارن الحد من ERG-سعة بعد 45 دقيقة - في نهاية فترة المعرض - إلى ERG قياس قبل التطبيق.
- مقارنة موجة أ- وب- في نهاية مرحلة من الاخفاق إلى السعة المقابلة قبل المعرض لدراسة انتعاش محتمل.
- للتحليل الإحصائي، استخدام البرنامج أحزاب اللقاء المشترك البرامج الإحصائية SPSS أو البرامج. حساب البيانات في جميع أنحاء كما يعني ± الانحراف المعياري. تقدير أهمية من قبل الاختبار الإحصائي المناسب.
ملاحظة: هذه الاختبارات قد تكون مختلفة اعتمادا على نطاق تجريبي. في هذا الإعداد، استخدم تقرن اختبار t الطالب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد 1 ساعة من نضح من الاستعدادات الشبكية مع المشبعة بالأكسجين حل القياسية (الشكل 1A و B) أظهرت ERG-سعة الاستقرار والتباين أقل من سعة بين القياسات واحدة. درجة الحموضة، والضغط الاسموزي، ودرجة الحرارة، وص 2 (باستثناء اختبار نقص الأكسجة) وظلت ثابتة لجميع الاختبارات.
لعزل إشارة مستقبلة للضوء من شبكية العين إشارة الداخلية، وأضيف 1 ملم اسبارتاتي إلى حل القياسي لقمع ب الموجة (الشكل 1A). خلال اختبار تأثير نقص الأكسجين، لوحظ وجود انخفاض في الموجة سعة 87.0٪ (P <0.01) بعد وقت المعرض من 45 دقيقة. في نهاية الغسل، لوحظ وجود انخفاض 36.5٪ التي كانت ذات دلالة إحصائية (ع = 0.03، الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك، تم تسجيل انخفاضا الأولي في سعة ب-موجة من 87.23٪، وهذا دلالة إحصائية وصلت حد سواء (P <0.01). في هذا الإعداد انخفاض قدرها 25.5٪ولوحظ، التي كانت ذات دلالة إحصائية (ع = 0.03، الشكل 2B).
بعد المعرض مع 250 ميكرون الغلوتامات، والحد غير مهم 7.8٪ من تم الكشف عن سعة بعد (P> 0.05) الفاصل الزمني تعريف الموجة. وأعقب ذلك انخفاض غير ملحوظ من 1.9٪ (P> 0.05، الشكل 3A). وأظهرت قياسات واحدة في الجدول رقم 1 و 2.
وفيما يتعلق ب الموجة، وانخفاض سعة من أرج من قبل سجلت 83.7٪ التي كانت ذات دلالة إحصائية (P <0.01، الشكل 3B). في نهاية الغسل، لوحظ انتعاش ب الموجة مما أدى إلى انخفاض غير ملحوظ من 2.3٪ في الدقيقة 75 من نضح مع الحل القياسي (ع = 0.62).
الشكل 1: مثال لقياس أرج من معزولة perfused لشبكية العين البقري (A) ويظهر على الموجة في.وأرج من معزولة perfused لشبكية العين البقري. وقمعت ب الموجة بإضافة 1 ملم اسبارتاتي إلى المحلول المغذي. (ب) ب الموجة هو المهيمن في ظل ظروف الإضاءة ظلامية. ويستخدم التحفيز 10 مللي ضوء في شدة الضوء من 6.3 MLX.
الشكل 2: آثار نقص الأكسجة بعد وقت التعرض لل 45 دقيقة على (A) والموجة وعلى (B) ب الموجة اتساع أرج. متوسط سلسلة المخدرات التمثيلية (ن = 5). شريط أفقي فوق منحنى هذه هي المرة نقص الأكسجة. خط منقط (A) يمثل تطبيق اسبارتاتي 1 ملم لكشف إمكانات مبصرة. يتم إعطاء الانحرافات المعيارية لكل سلسلة من التجارب مباشرة قبل وبعد التطبيق، وكذلك في نهاية المحاكمة. تم إجراء التحليل الإحصائي على نقاط الوقت باستخدام الانحراف المعياري (مباشرة قبل وبعد تطبيق وايون وكذلك في نهاية المحاكمة): (A) انخفاض في ولوحظ اتساع 87.0٪ بعد وقت المعرض من 45 دقيقة مقارنة مع بداية المحاكمة الموجة. في نهاية المحاكمة، لوحظ انخفاض ملحوظ من 36.5٪. وسجلت (ب) انخفاض كبير في سعة ب-موجة من 87.23٪ في نهاية الوقت المعرض. في نهاية المحاكمة، لوحظ وجود انخفاض كبير في 25.5٪.
الرقم 3: آثار الغلوتامات 250 ميكرومتر تطبيقها لمدة 45 دقيقة على (A) على موجة السعة و(B) ب الموجة اتساع أرج من معزولة perfused لالبقري الشبكية متوسط من سلسلة المخدرات التمثيلية (ن = 5) . شريط أفقي فوق منحنى يمثل تطبيق الغلوتامات. خط منقط (A) يمثل تطبيق اسبارتاتي 1 ملم لكشف إمكانات مبصرة. ستايتم إعطاء الانحرافات ndard لكل سلسلة من التجارب مباشرة قبل وبعد التطبيق، وكذلك في نهاية المحاكمة. تم إجراء التحليل الإحصائي في نقاط الوقت مع الانحراف المعياري (مباشرة قبل وبعد التطبيق، وكذلك في نهاية المحاكمة): (A) وبعد وقت التعرض لل 250 ميكرون الغلوتامات انخفاضا غير هام من الموجة تم الكشف عن سعة (7.8٪). في نهاية المحاكمة، تم العثور على تخفيض غير كبير من 1.9٪. (B) وفيما يتعلق ب الموجة، انخفضت بشكل ملحوظ سعة من أرج من 83.7٪ تم تسجيلها. في نهاية المحاكمة، لوحظ وجود انخفاض غير ملحوظ من 2.3٪.
| الوقت [دقيقة] | ب-موجة السعة [μV] | SD | على الموجة السعة [μV] | SD |
| 0 | 9.2 | <TD محاذاة = "الحق"> 0.836660027-10.4 | 1.140175425 | |
| 5 | 9.2 | 1.095445115 | -10 | 1 |
| 10 | 10 | 0 | -10.6 | 0.547722558 |
| 15 | 9.4 | 1.140175425 | -9.6 | 0.547722558 |
| 20 | 9.4 | 0.547722558 | -10 | 1 |
| 25 | 9.4 | 0.894427191 | -10.8 | 0.447213595 |
| 4.2 | 2.774887385 | -6.6 | 2.50998008 | |
| 35 | 4 | 2.449489743 | -5 | 2.236067977 |
| 40 | 3.8 | 1.788854382 | -5 | 1 |
| 45 | 3.6 | 1.341640786 | -5 | 2.121320344 |
| 50 | 2.4 | 1.140175425 | -4 | 1.870828693 |
| 55 | 2.2 | 0.836660027 | -3.4 1.140175425 | |
| 60 | 2.6 | 0.547722558 | -3.4 | 1.816590212 |
| 65 | 1.8 | 0.836660027 | -2.8 | 1.303840481 |
| 70 | 1.2 | 0.447213595 | -1.4 | 0.894427191 |
| 75 | 4.2 | 0.836660027 | -5.2 | 2.683281573 |
| 80 | 5.8 | 1.303840481 | -6 | 2.828427125 |
| 85 | 1.095445115 | -4.8 | 0.836660027 | |
| 90 | 6.8 | 1.095445115 | -6.2 | 2.387467277 |
| 95 | 7.4 | 1.816590212 | -5.6 | 2.302172887 |
| 100 | 6.4 | 0.547722558 | -6.2 | 2.863564213 |
| 105 | 6.6 | 0.894427191 | -7.2 | 2.049390153 |
| 110 | 6.2 | 1.643167673 | -6.4 | <TD محاذاة = "الحق"> 2.966479395|
| 115 | 8.8 | 3.898717738 | -6 | 3.16227766 |
| 120 | 7.4 | 1.516575089 | -6 | 2.34520788 |
| 125 | 6.8 | 1.095445115 | -6 | 2.645751311 |
| 130 | 7 | 1 | -6.6 | 1.816590212 |
الجدول 1: نتائج كولموغوروف-سميرنوف.
| الوقت [دقيقة] | ب-موجة السعة [μV] | SD | على الموجة السعة [μV] SD | |
| 0 | 9.25 | 0.5 | -10 | 1 |
| 5 | 10.5 | 0.577350269 | -10 | 1 |
| 10 | 10.25 | 0.5 | -10.4 | 0.894427191 |
| 15 | 10.5 | 0.577350269 | -9.6 | 0.894427191 |
| 20 | 10 | 0.816496581 | -9.6 | 0.547722558 |
| 25 | 10.75 | 0.5 | 0.836660027 | |
| 30 | 3 | 1.825741858 | -8.4 | 2.701851217 |
| 35 | 6 | 3.559026084 | -9 | 1 |
| 40 | 5.25 | 2.62995564 | -8.4 | 2.966479395 |
| 45 | 2.75 | 2.061552813 | -9 | 1.414213562 |
| 50 | 2.75 | 0.957427108 | -8 | 0.707106781 |
| 55 | 1 | -10.2 | 1.095445115 | |
| 60 | 2.25 | 0.957427108 | -8.4 | 1.816590212 |
| 65 | 2 | 1.414213562 | -8.6 | 1.140175425 |
| 70 | 1.75 | 0.5 | -9.4 | 2.701851217 |
| 75 | 8 | 3.464101615 | -9.2 | 2.28035085 |
| 80 | 9.5 | 3.696845502 | -9 | 1 |
| 85 | 8 | 2.160246899 | -10.8 | 2.48997992 |
| 90 | 8.25 | 0.957427108 | -9.2 | 2.167948339 |
| 95 | 9.25 | 2.872281323 | -10 | 1.870828693 |
| 100 | 9.75 | 0.957427108 | -9.6 | 1.140175425 |
| 105 | 13.5 | 3.872983346 | -9.2 | 1.643167673 |
| 110 | 11.75 | -9.6 | 1.140175425 | |
| 115 | 9 | 1.825741858 | -10 | 1.870828693 |
| 120 | 11 | 3.366501646 | -9.8 | 1.303840481 |
| 125 | 11 | 2.708012802 | -10.8 | 0.447213595 |
| 130 | 10.5 | 0.577350269 | -10 | 1 |
الجدول 2: القياسات التمثيلية لنقص الأكسجة لسعة ب الموجة وسعة في الموجة.
| الغلوتامات على الموجة البيانات | الغلوتامات البيانات ب الموجة | نقص الأكسجة البيانات على الموجة | نقص الأكسجة البيانات ب الموجة | |
| D | 0.103827009 | 0.17415038 | 0.195 | 0.125 |
| ف القيمة | 0.928603977 | 0.375501627 | 0.250 | 0.781 |
| ألفا | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
الجدول 3: القياسات التمثيلية ل 250 ميكرومتر الغلوتامات لسعة ب الموجة والموجة سعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، تم العثور على تأثير كبير على السعة ب-موجة بعد 45 دقيقة من نقص الأكسجة. لا يزال هذا انخفاض كبير بعد مرحلة الغسل. ويمكن ملاحظة تأثير مماثل على إمكانية مبصرة.
معتمدة النتائج وفقا لبيانات أخرى نشرت 16 وتعطينا الفرصة لدراسة الآثار المحتملة اعصاب بعد نقص الأكسجين.
بعد 45 دقيقة المعرض من 250 ميكرومتر الغلوتامات، لم نجد لها تأثير كبير إحصائيا فقط على السعة ب الموجة التي كانت عكسها تماما في نهاية الفترة فشل. لم تتأثر القدرة مستقبلة للضوء بنسبة 250 ميكرومتر الغلوتامات. حقيقة أن فقط الشبكية الداخلية وتتأثر نقص الأكسجة يشير إلى أن التغييرات الطفيفة جدا وأننا، بالتالي، لديها مؤشر حساس جدا وموحد لالممكنة العصبية. اسبارتاتي يمنع على وجه التحديد انتقال من مبصرة لهوريزونتالقاعدة أو خلايا القطبين وبالتالي يقمع ب الموجة.
هذه النتيجة تتناقض مع نتائج الخضراء DG وKapousta-برونو NV، الذين وجدوا أنه مع تركيزات 250 و 500 ملم الغلوتامات من تسجيل ب موجات كانت أكثر استقرارا مع مرور الوقت بالمقارنة مع وسائل الإعلام وحدها 17. لتفسير هذا التناقض تحتاج العديد من الاختلافات في إعدادات أن تؤخذ بعين الاعتبار: كان يستخدم Sickel-الحل في هذا النموذج نشر أخرى قارع الأجراس-حل.
أجريت قياسات مع مجموعة نشر آخر مع القطب واحد. واستخدمت عيون البقر من المسلخ بينما وصف غيرها من المنشورات عيون الفئران الطازجة. وكان تأثير عكسها مع تثبيط الزمني في تركيزات الصوديوم عالية. ومن المعروف ان بعض كمية قليلة جدا من الصوديوم ضروري لصيانة جيدة من العين وأن كميات أعلى سامة. يمكننا أن نفترض أن في عيون البقر من SLaughterhouse أكثر هو أن يطلق سراحه الغلوتامات مقارنة العينين الطازجة مما أدى إلى مستويات الغلوتامات يجري المختلفة مما كان متوقعا من الغلوتامات وأضاف تجريبيا.
قياس استجابة باستخدام مجموعة على شبكية العين بأكملها بدلا من القطب، الذي يتأثر بصورة رئيسية من قبل أقرب الخلايا، قد يؤدي أيضا إلى وقت أطول بقاء بسبب الأضرار الميكانيكية أقل. وأخيرا، وتكوين وسائل الإعلام أمر بالغ الأهمية. في 1960s، البروفيسور Sickel استثمرت بكثافة في تطوير هذه الوسائط متخصص لهذه القياسات وكان قادرا على العثور على وسائل الإعلام الأمثل دون الحاجة الغلوتامات للاستجابة شبكية العين مستقرة 13،14.
ويعتمد النموذج الذي وصفها على شبكية العين معزولة بدلا من حيوان كله. في نظام في الجسم الحي، يتم عزل العين عن طريق الدم-شبكية العين من العوائق من الأجهزة الأخرى من الحيوان. وميزة هذا النموذج هو أن التدخل المعلمات في الحيوانات الدراسة، مثل التخديرأو موقف من الأقطاب الكهربائية لا تحدث، والذي يسمح درجة أعلى من التوحيد. التوحيد هو نقطة حرجة في التجارب على الحيوانات، وخاصة فيما يتعلق العين 18.
القيود المفروضة على هذه الطريقة هي فترة اختبار قصيرة والواقع، أنه ليس من نموذج حيواني. ونحن نعرف من التجربة أن سعة أرج لا تزال مستقرة لمدة 8 ساعات، وبالتالي فإن فترة الاختبار المذكورة في مقدمة ويمكن تمديد إلى المعرض أطول وفترة المتابعة، ولكن ينبغي للمرء أن ينظر دائما إلى أن تجربة واحدة أطول تم تمديده، و الأرجح الانحرافات المعيارية أعلى سيحدث.
عيوب هذا النموذج هو، بالتالي، أن هناك دراسات على المدى الطويل يمكن أن يؤديها وفقط كمية محدودة من التلاعب في شبكية العين ممكنة. للتلاعب واسعة النطاق وERGs خاصة مثل ERG متعدد البؤري تسترشد SLO كما هو موضح في Dutescu وآخرون التجربة على سبيل المثال، في الجسم الحيالصورة ضرورية 19.
يمكن بسهولة هذا النموذج أن تستخدم لشبكية العين البشرية explanted مثلا من عيون منزوعة النواة. منذ معقد هذه المواد الحساسة الحصول عليها، تجارب على شبكية العين الأبقار هي أكثر جدوى ولكن ينبغي تفسيرها أخذ ذلك في الاعتبار.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول وتنقل وتستعد شبكية العين في ظل ظروف تكييفها المظلمة. وهذا أمر مهم للحصول على الردود المحتملة القصوى. ويمكن في بعض الأحيان تأخذ دقائق قليلة لفصل بلطف الشبكية من الظهارة الصبغية الأساسية. اهتزاز لطيف من شبكية العين لكمات من يسهل أحيانا هذه العملية. في حين وضع شبكية العين على النت، من المهم وضع شبكية العين مع شبكية العين الخارجي على الشبكة. بعد trephanization، فإن حواف الشبكية ينحني قليلا مما يدل صعودا موقف طبقة الشبكية الداخلية.
شبكية العين البقري هو أكثر مماثلة لشبكية العين البشرية قارند إلى شبكية العين القوارض بسبب وجود نسبة زجاجي عدسة مماثلة وبنية الأوعية الدموية مشابهة لما واحد من العين البشرية 20؛ وبالتالي، على الرغم من حيوانات المختبر الصغيرة مثل الفئران أو الفئران وتستخدم على نطاق واسع لاختبار توافق مع الحياة في شبكية العين، ودراسات السمية التي أجريت على هذه الحيوانات غالبا ما تكون أقل تنطبق على البشر 20. ويظهر أن الجينات الأبقار وأكثر ارتباطا الجين البشري من ذلك من الفئران أو الماوس 21 - تحليل النشوء والتطور من الجين myocilin - الجين الذي في شكله تحور يتسبب مرض وراثي جسمي الأحداث مفتوح الزاوية الزرق. Myocilin يمكن العثور عليها في خلايا الشبكة التربيقية، وكذلك في شبكية العين. في الماضي أظهرنا وجود علاقة جيدة بين الأبقار وERGs معزولة الإنسان والآثار أرج 12.
في نموذجنا كان يعمل اسبارتاتي لكشف مبصرة المحتملة P III بإلغاء ب الموجة. وهذا يعطي المحقق الفرصة للتميزبين التأثيرات على الشبكة الشبكية الداخلية وظيفة مبصرة 22. بينما ب الموجة هي معلمة أكثر حساسية بكثير فيما يتعلق وظيفة متكاملة، واتساع في الموجة هي أكثر استقرارا وأكثر مقاومة للإجهاد، يرجع ذلك إلى حقيقة أن لموجة يعكس فقط رد فعل من المستقبلات الضوئية للضوء ذلك. في المقابل، فإن ب الموجة تعتمد على التفاعل خلية الى خلية من خلايا الشبكية المختلفة ونشاط المستقبلات الضوئية. باستخدام اسبارتاتي لعزل على الموجة فمن الممكن لدراسة تأثير التلاعب على المستقبلات الضوئية وحدها 23.
في هذه الدراسة تم تقييم وموحد نموذج سمية الخلايا العصبية التي يمكن استخدامها لاختبار وكلاء اعصاب. باعتبارها التوقعات فإنه سوف يكون من المثير للاهتمام أن ترتبط وظيفة الكهربية مع تحليل البروتين الكيمياء الحيوية أو لربط وظيفة مع الأيض الخلوي أو حتى التعبير مرنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germany | 1,064,041,000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germany | 1,050,010,250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germany | 58,330,250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germany | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germany | 1,065,860,500 | |
| 5 mM glucose | Merck Pharma, Germany | 40,741,000 |
References
- Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
- Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. Hypertension-related eye disorders). Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).
- Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
- Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
- Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
- Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
- Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
- Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
- Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
- Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
- Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
- Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
- Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
- Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
- Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
- Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
- Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
- Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).
