Summary
Com este estudo, apresentamos um modelo de estresse padronizado para a retina bovina superfundido isolado para o futuro teste pré-clínico terapêutico. O efeito de qualquer hipóxia (puro N 2) ou estresse glutamato (250 mM glutamato) em função da retina representado por a- e amplitudes da onda-b foi avaliado.
Abstract
Neuroprotection tem sido um forte campo de investigação na investigação oftalmológica nas últimas décadas e afeta doenças como glaucoma, oclusão vascular da retina, descolamento de retina, e retinopatia diabética. Era o objeto deste estudo a introdução de um modelo de estresse padronizado para futuro teste pré-clínico terapêutico.
Retina bovina foram preparadas e perfundido com uma solução saturada de oxigénio padrão, e o ERG foi gravado. Depois de gravar b-ondas estáveis, hipoxia (N 2) puro ou estresse glutamato (250 um glutamato) foi exercida por 45 min. Para investigar os efeitos sobre sozinho função de fotorreceptores, 1 mM aspartato foi adicionada para obter a-ondas. ERG-recuperação foi monitorada por 75 min.
Para hipoxia, uma diminuição na amplitude da onda-um de 87,0% foi observada (p <0,01) após um tempo de exposição de 45 min (36,5% de redução após o final da lavagem p = 0,03). Além disso, um decr inicialfacilidade de amplitudes de ondas de b-87.23% foi registada, que atingiu significado estatístico (p <0,01, diminuição de 25,5% no final da lavagem, p = 0,03).
Para 250 um glutamato, uma redução inicial de 7,8% de um amplitudes de ondas (p> 0,05), seguidas por uma redução de 1,9% (p> 0,05). Uma redução de 83,7% da amplitude da onda b (p <0,01) foi observado; após uma lavagem de 75 min, a redução foi de 2,3% (p = 0,62). Neste estudo, um modelo de tensão é apresentada normalizada que pode ser útil para identificar possíveis efeitos neuroprotectores no futuro.
Introduction
Neuroprotection tem sido um forte campo de investigação na investigação oftalmológica nas últimas décadas. A retina é uma rede neuronal altamente sensível que depende significativamente a oxigenação e é fortemente influenciado pelo metabolismo das suas células vizinhas. As principais patologias oculares relacionadas com a lesão das células nervosas são oclusões vasculares retinianas, glaucoma e descolamento da retina.
A oclusão da artéria retinal, como um exemplo para a oclusão vascular da retina, leva a uma perda súbita de visão devido a hipoxia da retina interna 1. Ela é freqüentemente associada com patologias vasculares gerais 2 e leva a uma perda visual persistente 1, com apenas 8% dos pacientes em recuperação da acuidade visual significativamente 1. Apesar de a fibrinólise arterial tem sido sugerida como uma opção de tratamento, o benefício não poderia ser mostrado em um ensaio clínico randomizado 3.
Glaucoma e descolamento de retinaambos têm um aumento na concentração de glutamato 4-6. O glutamato sob condições fisiológicas é encontrado como um transmissor excitatório ao longo de todo o sistema nervoso central e retina interna a 7,8. Elevados níveis de glutamato foram encontradas não só em glaucoma e descolamento de retina 5,6, mas também na retinopatia diabética proliferativa 9. Um aumento em glutamato conduz possivelmente a excitotoxicidade e, portanto, danos das células nervosas 10. Na maioria dos casos de descolamento da retina e em alguns casos de cirurgia de retinopatia diabética proliferativa na retina (vitrectomia via pars plana) são necessários. Durante a manipulação mecânica vitrectomia, luz brilhante da fibra óptica ou tensão de cisalhamento exercida por altas taxas de fluxo de soluções de irrigação durante as operações longas exercer uma pressão adicional sobre a retina 11,12.
Todas as doenças mencionadas têm em comum que a patologia está localizada ao retinuma só e representam a comunidade oftalmológica com o desafio de encontrar formas de proteger a retina como um sistema neurossensorial.
O electrorretinograma (ERG) é o método padrão para a avaliação in vivo da função de fotorreceptores (uma onda) e a função da retina interna (b-ondas). O ERG é medido por eléctrodos de prata-introduzidos na córnea e os olhos estão a ser estimulado por um aumento do nível de luz para detectar defeitos em bastonetes ou cones ou na retina interna. Diferentes defeitos na retina pode ser detectada por alterações na amplitude (a força da resposta) ou a latência (o intervalo de tempo de resposta-para) do ERG. Diferentes protocolos e métodos de medição ERG (padrão-ERG, multifocal ERG-campo ou brilhante ERG) permitem uma maior diferenciação de defeitos. A técnica da retina isolado foi introduzida recentemente, tornando-se possível avaliar os efeitos sobre a retina, sem interferências de um animal, por exemplo o estudo dereações gerais 13,14.
Foi o propósito deste estudo para avaliar e introduzir um modelo de estresse definido e padronizado para hipóxia e estresse glutamato na retina superfused isolado. Assim, nós estamos esperando para lançar as bases para futuros estudos sobre efeitos neuroprotetores de determinados agentes ou soluções de irrigação intra-oculares.
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Protocol
1. Preparação de Bovinos Olhos
- Obter bovina olhos imediatamente após o abate do animal.
- Transportar os olhos protegidos em "Sickel-solução" uma forma especial, contendo NaCl 120 mM, KCl a 2 mM, 0,1 mM de MgCl2, 0,15 mM de CaCl2, 1,5 mM de NaH 2 PO 4, 13,5 mM de Na 2 HPO 4 e 5 mM de glucose no RT.
- Realizar a preparação da retina em condições adaptadas escuro com uma luz vermelha ofuscante.
- Retire a parte anterior do olho. Executar uma ca. incisão equatorial 4 milímetros posterior ao limbo. Posteriormente remover córnea, íris, corpo ciliar e lente em uma única peça. Mantenha as retinas em Sickel-solução.
- Mecanicamente soltar os anexos vítreas para a superfície da retina e do vítreo remover da taça olho aberto.
- Depois divida o olho em quatro quadrantes e perfurar rodada áreas de ca. 7 milímetros de diâmetro usando uma trefina.
- Suavemente separar da retinado epitélio pigmentar e colocá-lo em um dispositivo de gravação dentro de uma caixa protegida da luz. O dispositivo de gravação é composto por uma manutenção de plástico com uma malha no meio; colocar a retina na malha e, em seguida, fixar com um anel de plástico directamente sobre os eléctrodos.
NOTA: O mantenedor de plástico tem dois canais para permitir um fluxo constante do meio.
2. A gravação do eletrorretinograma (ERG)
- A fim de gravar o electrorretinograma, usar dois eléctrodos de prata / prata-cloreto de cada lado da retina e perfundir a retina a uma velocidade de perfusão constante de ca. 1 ml / min e temperatura constante de 37 ° C. Use a "Sickel-solução" saturada com oxigênio.
- Antes de iniciar a medição, adaptar escuro da retina (proteger da luz durante todas as medições) e usar intervalos de estímulo de cinco min. Use um único flash xenon branco 1 Hz para a estimulação com uma intensidade definido para 6,3 mlx na superfície da retina. Uso calibrado filtros de densidade neutra e um estímulo de luz de 10 ms controlado por um temporizador, de modo a apresentar respostas óptimas.
- Para medir e processar os dados, filtrar o ERG e amplificá-lo (100 Hz filtro de alta freqüência, de 50 Hz filtro notch, 100.000 x amplificação), utilizando um RPS312RM Amplifier Grass. Tente filtrar frequências possíveis perturbadores que possam perturbar o sinal. A fim de processar os dados, use uma placa de aquisição analógico-digitais de dados em um computador desktop (PC compatível).
- Após o período de adaptação ao escuro sob perfusão constante, medir a amplitude do sinal elétrico até estáveis amplitudes b-ondas são gravadas.
NOTA: As amplitudes são consideradas estáveis se cinco medições individuais chegar a um valor médio e desviar-se menos de 10%. Um bom exemplo de medições individuais é dada na Figura 1. - Para iniciar o teste, substituir o oxigénio puro por qualquer azoto puro (número de experiências individuais, n = 5) para testar a hipóxiaou 250 um glutamato (n = 5).
- Grave as respostas elétricas a cada 5 min para 45 min.
- Após o período de testes, aspergir as retinas com padrão médio saturada com oxigênio por 75 min e olhar para as mudanças da amplitude da onda-b. Esta é a fase de lavagem. Medir a amplitude da onda-b da calha do uma onda para o pico da onda b.
- Para investigar o efeito de hipóxia ou glutamato no potencial de fotorreceptores em condições escotópicas, suprimir a onda b pela adição de 1 mM para a solução nutriente.
- Após a gravação de um potencial estável de fotorreceptores durante 30 min, realizar o procedimento como antes, expondo as retinas de 45 min para as diferentes soluções de irrigação com aspartato 1 mM. Use o mesmo período de washout (passo 2.8), como mencionado anteriormente.
Análise 3. Dados
- A fim de avaliar estatisticamente os dados, garantir uma distribuição normal para todos os dados, por exemplo, utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnovteste 15.
- Calcula-se a redução dos a- e b-amplitudes de onda em percentagens após a fase de exposição, em comparação com a última medição antes da exposição. Comparar a redução das amplitudes-ERG após 45 min - no final do período de exposição - a ERG medido antes da aplicação.
- Comparar a onda a- e b- no final da fase de lavagem para a amplitude correspondente antes de exposição a estudar a possibilidade de recuperação.
- Para a análise estatística, use o software estatístico JMP software ou software SPSS. Calcular dados ao longo como a média ± desvio padrão. Estime significado pelo teste estatístico adequado.
NOTA: Estes testes podem ser diferentes dependendo do escopo experimental. Neste cenário, use t-pareado de Student.
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Representative Results
Após 1 hora de perfusão dos preparativos da retina com solução padrão saturado de oxigênio (Figura 1A e B) ERG-amplitudes mostrou estabilização e menor variação de amplitudes entre as medidas individuais. pH, pressão osmótica, temperatura, e pO 2 (excepto para o teste de hipóxia) foram mantidas constantes em todos os testes.
Para isolar o sinal a partir do sinal de fotorreceptores da retina interna, aspartato 1 mM foi adicionado para a solução padrão para suprimir a onda-b (Figura 1A). Durante o teste do efeito de hipoxia, uma diminuição na amplitude da onda-um de 87,0% foi observada (p <0,01) após um tempo de exposição de 45 minutos. No final da lavagem, uma diminuição de 36,5% foi observado que era estatisticamente significativa (p = 0,03, Figura 2A). Além disso, uma diminuição inicial da amplitude da onda b de 87,23% foi registada, que atingiu significância estatística igualmente (p <0,01). Nesse ambiente, uma redução de 25,5%Notou-se, que foi estatisticamente significativa (p = 0,03, Figura 2B).
Após exposição com 250 um glutamato, uma média de 7,8% de redução não significativa de uma onda de amplitudes foi detectada após (p> 0,05) do intervalo de tempo definido. Isto foi seguido por uma redução não significativa de 1,9% (p> 0,05, Figura 3A). Medições individuais são apresentados na Tabela 1 e 2.
No que diz respeito a onda b, diminuiu amplitudes do ERG, 83,7% foram registadas que foram estatisticamente significativas (p <0,01, Figura 3B). No final da lavagem, uma recuperação da onda b foi observado que resulta numa redução não significativa de 2,3% após 75 minutos de perfusão com solução padrão (p = 0,62).
Figura 1: Exemplo de uma medição a partir do ERG isolado perfundido de retina de bovino (A) A-ondas é mostrado em um.o ERG do isolado perfundido retina bovina. A onda b é suprimida pela adição de aspartato 1 mM para a solução nutritiva. (B) A onda b é dominante sob condições de luz escotópicas. Um estímulo 10 ms luz a uma intensidade de luz de 6,3 mlx é usado.
Figura 2: Efeitos de hipoxia após um tempo de exposição de 45 min no (A) uma onda e a amplitude em (B) da onda b do ERG. Média de série droga representativa (n = 5). A barra horizontal acima da curva de marca o tempo de hipóxia. A linha pontilhada (A) marca a aplicação de aspartato 1 mM para desmascarar potencial de fotorreceptores. Os desvios padrão para cada série de experiências são dados directamente antes e depois da aplicação, bem como no final do ensaio. A análise estatística foi realizada no momento de pontos usando o desvio padrão (diretamente antes e depois applicatião positivo, assim como no final do ensaio): (A) Uma diminuição na amplitude da onda-um de 87,0% foi observada depois de um tempo de exposição de 45 minutos em comparação com o início do ensaio. No final do ensaio, uma diminuição significativa de 36,5% foi observada. (B) Um decréscimo significativo na amplitude da onda b de 87,23% foi registada no final do tempo de exposição. No final do ensaio, uma redução significativa de 25,5% foi observada.
Figura 3:. Efeitos de glutamato 250 uM aplicada durante 45 minutos sobre a (A), a amplitude de uma onda e a (B), a amplitude da onda b do ERG do perfundido isolado retina bovina médio da série fármaco representativo (n = 5) . A barra horizontal acima da curva de aplicação da marca de glutamato. A linha pontilhada (A) marca a aplicação de aspartato 1 mM para desmascarar potencial de fotorreceptores. Stadesvios ndard para cada série de experiências são dados directamente antes e depois da aplicação, bem como no final do ensaio. A análise estatística foi realizada nos pontos de tempo com o desvio padrão (directamente antes e depois da aplicação, bem como no final do ensaio): (A) Após o tempo de exposição de 250 um glutamato uma redução não significativa de onda amplitudes (7,8%) foi detectado. No final do ensaio, foi encontrada uma diminuição não significativa de 1,9%. (B) No que diz respeito a onda b, diminuiu significativamente as amplitudes do ERG, 83,7% foram registados. No final do ensaio, uma redução não significativa de 2,3% foi anotado.
| Time [min] | amplitude da onda-b [mV] | SD | uma onda de amplitude [mV] | SD |
| 0 | 9.2 | <td align = "right"> 0,836660027-10.4 | 1,140175425 | |
| 5 | 9.2 | 1,095445115 | -10 | 1 |
| 10 | 10 | 0 | -10.6 | 0,547722558 |
| 15 | 9.4 | 1,140175425 | -9.6 | 0,547722558 |
| 20 | 9.4 | 0,547722558 | -10 | 1 |
| 25 | 9.4 | 0,894427191 | -10.8 | 0,447213595 |
| 4.2 | 2,774887385 | -6.6 | 2.50998008 | |
| 35 | 4 | 2,449489743 | -5 | 2,236067977 |
| 40 | 3.8 | 1,788854382 | -5 | 1 |
| 45 | 3.6 | 1,341640786 | -5 | 2,121320344 |
| 50 | 2.4 | 1,140175425 | -4 | 1,870828693 |
| 55 | 2.2 | 0,836660027 | -3.4 1,140175425 | |
| 60 | 2.6 | 0,547722558 | -3.4 | 1,816590212 |
| 65 | 1,8 | 0,836660027 | -2.8 | 1,303840481 |
| 70 | 1.2 | 0,447213595 | -1.4 | 0,894427191 |
| 75 | 4.2 | 0,836660027 | -5.2 | 2,683281573 |
| 80 | 5,8 | 1,303840481 | -6 | 2,828427125 |
| 85 | 1,095445115 | -4.8 | 0,836660027 | |
| 90 | 6,8 | 1,095445115 | -6.2 | 2,387467277 |
| 95 | 7,4 | 1,816590212 | -5.6 | 2,302172887 |
| 100 | 6.4 | 0,547722558 | -6.2 | 2,863564213 |
| 105 | 6.6 | 0,894427191 | -7.2 | 2,049390153 |
| 110 | 6.2 | 1,643167673 | -6.4 | <td align = "right"> 2,966479395|
| 115 | 8,8 | 3,898717738 | -6 | 3.16227766 |
| 120 | 7,4 | 1,516575089 | -6 | 2.34520788 |
| 125 | 6,8 | 1,095445115 | -6 | 2,645751311 |
| 130 | 7 | 1 | -6.6 | 1,816590212 |
Tabela 1: Resultados do teste de Kolmogorov-Smirnov.
| Time [min] | amplitude da onda-b [mV] | SD | uma onda de amplitude [mV] SD | |
| 0 | 9,25 | 0,5 | -10 | 1 |
| 5 | 10.5 | 0,577350269 | -10 | 1 |
| 10 | 10.25 | 0,5 | -10.4 | 0,894427191 |
| 15 | 10.5 | 0,577350269 | -9.6 | 0,894427191 |
| 20 | 10 | 0,816496581 | -9.6 | 0,547722558 |
| 25 | 10.75 | 0,5 | 0,836660027 | |
| 30 | 3 | 1,825741858 | -8.4 | 2,701851217 |
| 35 | 6 | 3,559026084 | -9 | 1 |
| 40 | 5.25 | 2.62995564 | -8.4 | 2,966479395 |
| 45 | 2.75 | 2,061552813 | -9 | 1,414213562 |
| 50 | 2.75 | 0,957427108 | -8 | 0,707106781 |
| 55 | 1 | -10.2 | 1,095445115 | |
| 60 | 2.25 | 0,957427108 | -8.4 | 1,816590212 |
| 65 | 2 | 1,414213562 | -8.6 | 1,140175425 |
| 70 | 1.75 | 0,5 | -9.4 | 2,701851217 |
| 75 | 8 | 3,464101615 | -9.2 | 2.28035085 |
| 80 | 9,5 | 3,696845502 | -9 | 1 |
| 85 | 8 | 2,160246899 | -10.8 | 2.48997992 |
| 90 | 8,25 | 0,957427108 | -9.2 | 2,167948339 |
| 95 | 9,25 | 2,872281323 | -10 | 1,870828693 |
| 100 | 9.75 | 0,957427108 | -9.6 | 1,140175425 |
| 105 | 13.5 | 3,872983346 | -9.2 | 1,643167673 |
| 110 | 11.75 | -9.6 | 1,140175425 | |
| 115 | 9 | 1,825741858 | -10 | 1,870828693 |
| 120 | 11 | 3,366501646 | -9.8 | 1,303840481 |
| 125 | 11 | 2,708012802 | -10.8 | 0,447213595 |
| 130 | 10.5 | 0,577350269 | -10 | 1 |
Tabela 2: As medições representativas de hipóxia por amplitudes b-onda e amplitudes uma onda.
| Glutamato uma onda de dados | Glutamato dados b-ondas | Hipóxia dados uma onda | Hipóxia dados b-ondas | |
| D | 0,103827009 | 0.17415038 | 0,195 | 0,125 |
| p-valor | 0,928603977 | 0,375501627 | 0.250 | 0,781 |
| alfa | 0,05 | 0,05 | 0,05 | 0,05 |
Tabela 3: medições representativas de 250 glutamato M para amplitudes b-ondas e uma onda de amplitudes.
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Discussion
Neste estudo, um impacto significativo na amplitude da onda b após 45 minutos de hipoxia foi encontrado. Esta redução foi ainda significativo após a fase de washout. Um efeito semelhante sobre o potencial de fotorreceptores pode ser observada.
Os resultados são compatíveis com outros dados publicados 16 e nos dão a oportunidade de estudar possíveis efeitos neuroprotetores após hipóxia.
Depois de 45 minutos de exposição de 250 uM de glutamato, conseguimos encontrar um impacto estatisticamente significativo apenas na amplitude da onda b que era totalmente reversível no final do período de lavagem. O potencial de fotorreceptores não foi influenciada pelo 250 um glutamato. O fato de que somente a retina interna foi afetada pela hipóxia indica que as mudanças são muito sutis e que, portanto, têm um indicador muito sensível e padronizado para possível neuroproteção. Aspartato inibe especificamente a transmissão a partir do fotorreceptor para o horizonteai ou de células bipolares e assim suprime a onda b.
Esta constatação é contrária às conclusões da DG Verde e Kapousta-Bruneau NV, que descobriu que com concentrações de 250 e 500 mM glutamato sua gravação b-ondas eram mais estáveis ao longo do tempo em relação aos meios de comunicação por si só 17. Para explicar esta contradição várias diferenças nas configurações necessitam de ser tomadas em consideração: Sickel-solução foi usada neste modelo a outra publicação que se solução de Ringer.
As medições foram efectuadas com uma matriz a outra publicação com um único eléctrodo. Olhos de bovinos provenientes de matadouro foram usadas enquanto a outra publicação descreveu olhos de ratos frescos. O efeito foi reversível com uma inibição temporais em concentrações elevadas de glutamato. É conhecido que uma certa quantidade muito baixa de glutamato é necessário para uma boa manutenção do olho e que quantidades mais elevadas são tóxicos. Poderíamos supor que, aos olhos da espécie bovina a partir do slaughterhouse mais glutamato está sendo lançado em comparação com olhos preparados na hora, resultando em níveis de glutamato ser diferente do que o esperado a partir do glutamato experimentalmente acrescentou.
Medir a resposta usando uma matriz sobre toda a retina, em vez de um eletrodo, que é influenciada principalmente pelas células mais próximos, também pode levar a um tempo de sobrevivência mais tempo devido a danos mecânicos inferior. Finalmente, a composição dos meios de comunicação é crucial. Na década de 1960, o Prof. Sickel investido fortemente no desenvolvimento desta mídia especializada para essas medidas e ele foi capaz de encontrar uma mídia otimizado sem a necessidade de glutamato para uma resposta da retina estável 13,14.
O modelo descrito baseia-se em uma retina isolada em vez de um animal inteiro. Em um sistema in vivo, o olho é isolado pelo sangue-retina-barreira de outros órgãos do animal. A vantagem deste modelo é que interferindo parâmetros nos animais do estudo, tais como anestesiaou posição de eléctrodos não ocorrer, o que permite um maior grau de normalização. A padronização é um ponto crítico em experiências com animais, especialmente a respeito do olho 18.
As limitações deste método são o curto período de teste e o facto, de que não existe um modelo animal. Sabemos por experiência que amplitudes ERG permanecer estável por cerca de 8 horas, portanto, o período de testes mencionado na introdução pode ser estendido para um longo período de exposição e de acompanhamento, mas deve-se sempre considerar que quanto mais tempo um único experimento for prorrogado, o mais provável desvios padrão mais elevados irão ocorrer.
Uma desvantagem do modelo é, por conseguinte, que não há estudos a longo prazo pode ser realizado e apenas uma quantidade limitada de manipulações para a retina são possíveis. Por exemplo, no ensaio in vivo para uma extensiva manipulação e ERGs especiais como ERG multi-focal guiada por SLO como descrito no Dutescu et al.s são necessárias 19.
Este modelo pode ser facilmente utilizado para retinas humanas explantada por exemplo, a partir de olhos enucleados. Uma vez que este material sensível é complicado de obter, experimentos em retinas de bovinos são mais viável, mas deve ser interpretada tendo isso em mente.
Os passos críticos no protocolo estão transportando e preparar a retina em condições adaptadas escuros. Isto é importante para se obter as respostas máximas possíveis. Por vezes, pode demorar alguns minutos para separar cuidadosamente a retina do epitélio pigmentar subjacente. Agitação suave da retina socou para fora às vezes facilita esse processo. Ao colocar a retina no líquido, é importante colocar a retina com a retina externa sobre o líquido. Após trephanization, as bordas da retina vai dobrar ligeiramente para cima, indicando a posição da camada interna da retina.
A retina de bovino é mais semelhante à retina humana comparard para a retina do olho roedor devido a proporções vítreo-lente semelhante e uma estrutura vascular que se assemelha a um olho humano 20; assim, embora pequenos animais de laboratório tais como ratos ou ratinhos são amplamente utilizados para testar a biocompatibilidade da retina, os estudos de toxicidade realizados em tais animais são frequentemente menos aplicáveis aos seres humanos 20. A análise filogenética do gene miocilina - um gene que, na sua forma mutante provoca autossómico dominante juvenil glaucoma de ângulo aberto - mostra que o gene bovino está mais estreitamente relacionada com o gene humano do que a do rato ou do rato 21. Miocilina pode ser encontrado em células da rede trabecular, assim como na retina. Na última vez que mostrou uma boa correlação entre bovinos e ERGs humanos isolados e efeitos ERG 12.
Em nosso modelo aspartato foi empregada para desmascarar o fotorreceptor potencial P III, abolindo a onda b. Isto dá o investigador a oportunidade para se diferenciarementre os efeitos sobre a rede interna da retina e a função de fotorreceptores 22. Enquanto a onda b é um parâmetro muito mais sensível no que diz respeito à função integrada, a amplitude de uma onda é mais estável e resistente à tensão, devido ao facto de a uma onda reflecte apenas a reacção dos fotorreceptores de luz lo. Em contraste, a onda b depende de interacção célula-a-célula de diferentes células da retina e a actividade dos fotorreceptores. Ao utilizar aspartato para isolar a uma onda, é possível examinar os efeitos de manipulações sobre os fotorreceptores sozinho 23.
Neste estudo foi avaliado num modelo de toxicidade neuronal padronizado que pode ser usado para testar agentes neuroprotectores. Como uma perspectiva que vai ser interessante para correlacionar função eletrofisiológico com análise de proteínas-bioquímica ou correlacionar função com o metabolismo celular ou até mesmo a expressão do mRNA.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 120 mM NaCl | Merck Pharma, Germany | 1,064,041,000 | |
| 2 mM KCl, | Merck Pharma, Germany | 1,050,010,250 | |
| 0.1 mM MgCl2, | Merck Pharma, Germany | 58,330,250 | |
| 0.15 mM CaCl2 | Merck Pharma, Germany | 111 TA106282 | |
| 1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4 | Merck Pharma, Germany | 1,065,860,500 | |
| 5 mM glucose | Merck Pharma, Germany | 40,741,000 |
References
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