Gleichzeitige Elektrophysiologische Aufzeichnung und Micro-Injektionen von Hemmstoffe im Gehirn von Nagetieren

Abstract

Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Konstruktion unter Verwendung kommerziell zugängliche und preiswerte Teile einer Einweg- "Elektrodenpillen". Ein Prüfsystem entwickelt, das für die Injektion eines Arzneimittels ermöglicht, während der Aufzeichnung von elektrophysiologischen Signalen aus dem betroffenen Neuronenpopulation. Dieses Verfahren stellt eine einfache und kostengünstige Alternative zu kommerziellen Lösungen. Eine Glaspipette wurde durch die Kombination mit einer Injektionsnadel und einem Silberdraht modifiziert. Die Elektrodenpillen auf Handels Mikrodosierspritzenpumpe zur Arzneimittelabgabe beigefügt. Dies führt zu einem Verfahren, das Echtzeit-Rückkopplung liefert Pharmakodynamik durch Multi-unit extrazelluläre Signale von der Stelle der Arzneimittelzuführung Ursprung. Als proof of concept verzeichneten wir neuronale Aktivität aus dem Colliculus superior durch Lichtblitze bei Ratten hervorgerufen, die gleichzeitig mit der Lieferung von Arzneimitteln durch die Elektrodenpillen. Die Elektrodenpillen Aufzeichnungskapazität ermöglicht die funktionelle Charakterisierung des injection Seite begünstigt eine genaue Kontrolle über die Lokalisation der Arzneimittelabgabe. Die Anwendung dieses Verfahrens erstreckt sich auch weit über das, was hier gezeigt, wie die Wahl der chemischen Substanz in die Elektrodenpillen geladen ist riesig, darunter Verfolgung Marker für anatomischen Experimenten.

Introduction

Die Inaktivierung des kortikalen Bereichen subkortikalen Kerne in der Studie von funktionalen Beziehungen zwischen verschiedenen Gehirnstrukturen ^2-4 wichtig. Jüngsten Literatur loss-of-function chemische oder Kryo-Techniken eingesetzt, um die Rolle von Hirnstrukturen ^2,5 studieren. Hinsichtlich pharmakologischer Mikroinjektionen, kleine Volumina von Medikamenten können in einer Gehirnregion mit einer kontrollierten Geschwindigkeit unter Minimierung der Kollateralschäden an das umgebende Gewebe ^6,7, verabreicht werden. Diese Technik kann verwendet werden, um spezifische Agonisten, inverse Agonisten oder Antagonisten zu liefern, um die Wirkung verschiedener pharmakologischer Ziele auf neuronale Aktivität zu untersuchen. Solche Effekte können auch durch Messen von Veränderungen in der neuronalen Antworten von fernen Standorten ermöglicht es Forschern, die Beziehungen zwischen verschiedenen kortikalen und subkortikalen Strukturen untersuchen sucht werden.

Hierbei ist die Anordnung einer Vorrichtung, die Elektrodenpillen, fähig bo zeigen wir,th Aufzeichnen elektrophysiologischer Signale und Verteilen kleiner Mengen von Arzneimitteln an der Zielposition. Wir zeigen die Fähigkeiten dieses Systems durch Einspritzen von GABA, einen gemeinsamen Inhibitor der neuronalen Aktivität im Ratten Colliculus superior. Diese Region ist empfindlich auf visuelle Stimulation, die uns visuell evozierten Aktivität verwenden, um Mehrfach-Elektrodenpillen Lokalisierung zu bestätigen erlaubt. Die Reversibilität der Inaktivierung wurde durch die Wiederherstellung der normalen neuronalen Aktivität nach dem Ende des GABA Injektion beurteilt.

Die Fähigkeit, von der Injektionsstelle zu überwachen Multi-Unit-Aktivität ermöglicht die Feinabstimmung der Injektionsraten und Volumina, um die gewünschte pharmakodynamische Reaktion zu erzielen. Daher ist es ein Vorteil dieser Technik das Potential Begrenzung der Gewebeschädigung durch Mikroperfusionskammer verursacht, da die kleinste wirksame Mengen injiziert werden. Das vorgeschlagene Protokoll bietet eine kosteneffiziente Methode zur Erzeugung des Einweg Hardware notweny für die Durchführung von Experimenten, in denen Arzneimittelabgabe und lokale neuronale Aktivität Aufzeichnung erwünscht ist.

Protocol

HINWEIS: Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council zum Schutz der Tiere und der Ethik-Review Board der Université de Montréal durchgeführt.

1. Montage der Recording-Injektionspipette

1. Ziehen Sie einen ca. 7 cm lange Glaskapillare (1 mm Außendurchmesser) mit einer Pipette Abzieher.
2. Brechen Sie die Spitze der Kapillare und überprüfen Sie die Öffnung unter einem Lichtmikroskop. Zu bestätigen, dass der Innendurchmesser zwischen 30 um bis 40 um.
3. Legen Sie eine 7 cm lange Silberdraht in das Glaskapillare mit ca. 1 cm aus dem nicht-verjüngte Ende des Glaspipette herausragen.
4. Biegen Sie die überschüssige Faden orthogonal zur Glaskapillare.
5. Anwenden eines Tröpfchens aus flexiblem Kunststoffkleber auf der Welle einer 30 G Injektionsnadel.
6. Legen Sie eine 30 G Injektionsnadel in der Glaspipette nach den Schaltplänen in Abbildung 1 dargestellt
7. Fügen Sie eine zweite Beschichtung aus Klebstoff, um eine ordnungsgemäße Abdichtung der Verbindungsstelle zwischen der Glaspipette und der Injektionsnadel zu gewährleisten.
8. Lassen Sie die Pipette mit der Spitze nach oben für etwa 12 Stunden, um eine ordnungsgemäße Aushärtung des Klebers sicherzustellen trocknen. Das fertige Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt.

Hinweis: Dieses Verfahren ist auf akuten Experimenten und Sterilisation der Pipettierspitze durchgeführt wird, nicht erforderlich.

2. Vorbereitung der Tiere

1. Legen Sie die Ratte in einer Anästhesie-Box.
2. Induzieren Anästhesie unter Verwendung von 4% Isofluran für 5 bis 10 min.
3. Legen Sie das Tier auf einem stereotaktischen Tisch mit Heizkissen und rektale Sonde, um eine Körpertemperatur von 37 ° C zu halten. Verwenden Sie einen Nasenkegel auf die Anästhesie mit 2% Isofluran erhalten. Sichere Kopf der Ratte mit Ohr Bars und Zahnhalter.
4. Bewerben Augensalbe oder Augentropfen, die 1% Atropin fällt auf in Pupillenerweiterung zu unterstützen sind. Bis zur Trockenheit zu verhindern, gelten Schmier Tropfens etwa alle 30 Minuten.
5. Rasur den Kopf und reinigen Sie es mit 10% Povidon-Iod.
6. Zur Lokalanästhesie, injizieren 0,5 ml 2% Lidocain unter der Kopfhaut in 2-3 Standorten durch Anheben der Haut und dem Einlegen der Spitze der Nadel.
7. Bestätigen angemessene Gabe von Betäubungsmitteln durch Ausführen einer Zehe Prise und Beobachten der Mangel an Bewegung. Darüber hinaus ist die Herzrate, um sicherzustellen, daß sie innerhalb normaler Werte (300 bis 400 Schläge / min) ist.
8. Einzuschneiden die Kopfhaut in einer geraden Linie entlang der Mittel mit einem # 10 Skalpell, um sowohl die koronalen und sagittalen Nähten aussetzen.
9. Decke die Lambda und Bregma Punkte, indem beiseite das Gewebe, das Abdecken wird den Schädel mit einem chirurgischen Spachtel.
10. Pegel den Schädel, so daß Bregma und Lambda-Positionen sind auf der gleichen Ebene.
11. Um den Referenzpunkt gesetzt, verwenden Sie einen stereotaktischen Gerät mit einem Glasrohr montiert, um es direkt über Bregma gesetzt. Dies wird die "Null" für die von vorne nach hinten und medial-lateral Messungen koordiniert.
12. Stellen Sie den Punkt von Interesse, indem Sie den stereotaktischen Halterung auf die erforderlichen Koordinaten, beachten Sie die stereotaktischen Koordinaten und zeichnen Sie ein Quadrat um den Zielbereich, der markiert, wo die Kraniotomie durchgeführt.
13. Verwenden Sie einen chirurgischen Bohrer mit einem sterilisierten Bohrer entlang der markierten Quadrat langsam ohne Druck langsam entfernen Sie das Knochenmaterial. Seien Sie vorsichtig, zu lange in der gleichen Gegend nicht zu bohren, da es die Wärme erzeugen und verursachen Läsionen auf der Rinde.
14. Wenn die Knochen des Schädel Abgrenzung ausreichend dünn werden, entfernen Sie vorsichtig den Hirnschnitt mit einer Pinzette, um die Rinde aus.
15. Häufig bewässern den freiliegenden Kortex mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit zu Gewebeaustrocknung zu verhindern.
    HINWEIS: Dura mater Entfernung unnötig ist an der Ratte als die Spitze des Elektrodenpillen ist robust genug, um zu durchdringen.

3. Füllen und Montage des Einspritzsystems

1. Füllen Sie das5-10 & mgr; l-Mikrospritze durch Aspiration mit Mineralöl.
2. Füllen Sie die Injektionsnadel mit der festen Glaspipette mit einer Lösung von 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) und 300 & mgr; M γ-Aminobuttersäure (GABA) oder einer Lösung von 2% Lidocain mit 0,5% CSB ^9. Verdünnen Sie alle Lösungen mit Kochsalzlösung.
   1. Im Fall von einer reichlichen Stoff, füllen Sie mit einem normalen Spritze und verwenden Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen Techniken, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
   2. Im Fall teurer Substanzen zu verwenden, Mineralöl, um die Elektrodenpillen zu füllen und das chemische Mittel können dann durch Absaugen eingeführt werden. Da der Dichteunterschied zwischen Erdöl und Wasser ist relativ hoch, diese Substanz ist ein guter Kandidat für die Injektion von wässrigen Lösungen.
      HINWEIS: Ein Farbstoff zugegeben werden, um die Trennung zwischen den beiden Flüssigkeiten zu bestätigen.
3. Um die Injektionspipette füllen, füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit der Lösung durch Absaugen und dann langsam zu injizieren die Lösungin die Injektionspipette.
4. Achten Sie sorgfältig auf Lecks in Regionen in 1 durch Abtupfen diese Bereiche sauber und Beobachten Leckagen durch weiteres Einspritzen der Lösung langsam mit der Spritze angezeigt.
5. Entfernen Sie die 1-ml-Spritze. Dabei ist, lesen Sie leichten Druck auf den Kolben zu halten, so dass das Vakuum nicht die Lösung aus der Injektionspipette entfernen.
6. Füllen Sie den Mikrospritze mit Mineralöl durch Aspiration und befestigen Sie sie fest auf die gefüllte Injektionspipette, dann vorsichtig Wischen Sie überschüssige Lösung aus der montierten Elektrodenpillen mit Gaze.
7. Sicherzustellen, dass die Spitze nicht durch die Injektion ein sehr kleines Volumen, genug, um einen kleinen Tropfen bilden sich an der Spitze der Glaspipette siehe blockiert.
8. Montieren Sie den Elektrodenpillen auf dem Mikrosystem und sicherzustellen, dass sie gut befestigt.
9. Vorsichtig Position der Elektrodenpillen Spitze an den Zielkoordinaten und senken Sie die Spitze an die Oberfläche der Hirnrinde.
10. Langsam senken die injectrode mit dem Zielgerät an die Zielstruktur (superior colliculus in diesem Fall) mit den entsprechenden anatomischen Koordinaten.
11. Decken Sie die freiliegenden Kortex mit warmen Agar zu Gewebeaustrocknung zu verhindern.

4. Injection und reversible Inaktivierung

1. Stellen Sie die Mikroinjektionspumpe bei 40 nl / min, und drücken Sie Run injizieren 400 bis 800 nl, um die Injektion zu starten. Beachten Sie, dass Spike-Rate wird Reduktion während der Injektion zu zeigen.
   HINWEIS: In der Versuchsanordnung, die neuronale Aktivität innerhalb einer Stunde gewonnen nach dem Ende des GABA Lieferung. Jede kalibrierte mechanische Vorrichtung verwendet werden, um Druck auf die Mikroinjektionsspritze, um das Einspritzen durchzuführen anzuwenden.
2. Nach dem Erwerb der elektrophysiologischen Daten, einschläfern mit einem von der örtlichen Tierethik Gemeinschaft zugelassenen Methode.

Representative Results

Der Aufbau des Elektrodenpillen ist in Abbildung 1 Ein Silberdraht (C) dargestellt ist, in einer Glaspipette (D) mit einem Teil der gebogenen Draht zugeführt und aus der Öffnung herausragt. A 30 G-Nadel (B) befestigt ist und an der Öffnung der Glaspipette mit Klebstoff abgedichtet. Nachdem die Pipette mit der Injektionssubstanz gefüllt worden ist, wird ein Glasmikrospritze (A) an der Nadel befestigt ist. Es ist wichtig, dass es eine gute Abdichtung, wenn die Mikrospritze verbunden mit der Nadel (E), und wo der Silberdraht steht von der Glaspipette (F), Fig. 2 zeigt eine Photographie, was die Elektrodenpillen aussieht nach Abschluss der Montage auf.

Visuell evozierten Mehrfach-Aktivität wurden in den Colliculus superior nach einem 300 ms Blitz an die gegenüberliegende Auge, wie in 3 dargestellt erhalten wird. Nach der Injektion von GABA, Spikeaktivität in Reaktion auf eine Flash-Stimulus wurde unterdrückt. visuellevozierte Mehrfach-Aktivität in der Regel zwischen 45 bis 60 min nach der Injektion wieder aufgehört hat.

Figur 4 zeigt den Aufbau des Mikroinjektionssystem. Die Einspritzpumpe Steuerung ermöglicht es dem Benutzer, die Einstellung für Injektions angeben. Eine Feder elektrischen Verbinder verbindet den Silberdraht, der von der Glaspipette vorsteht. Der Stecker führt zu einer Kopfstufe mit Boden und Referenzelektroden und dann in einen Verstärker angeschlossen ist. Ein Analog / Digital (A / D) Schnittstelle verwendet wird, um die elektrophysiologische Daten zu erhalten, und einen Lautsprecher für Audioüberwachung komplementären neuronaler Aktivität verwendet.

Abb. 1: Schematische Darstellung der Elektrodenpillen Anordnung ein Mikrospritze (A) auf das Aufzeichnungs-Injektionspipette, die aus einer 30 G h bestehen befestigtypodermic Adel (B) zu einem Silberdraht (C) in einer Glaspipette (D) haftet. Regionen eingekreist (E - F) hellen Bereichen, die anfällig für Lecks sein können.

Abbildung 2: Ein Foto des aufgebauten Pipette mit einer 30 G-Nadel (B), wasserdicht Klebstoff Leim (F), ein Silberdraht (C) und einer Glaspipette (D).

Figur 3: Eine Darstellung der inhibitorischen Wirkung der Injektion von GABA (300 um) auf visuell evozierten Mehreinheiten-Aktivität im Colliculus superior zeigen Pfeile Flash Beginn. Elektrischal-Signale wurden mit einem Bandpassfilter zwischen 30 und 3000 Hz gefiltert.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der gesamten Mikroinjektionssystem.

Discussion

Das vorgeschlagene Protokoll wurde entwickelt, um die Herausforderungen, die sich aus aktuellen reversible Inaktivierung Methoden zu lösen. Genauer gesagt, dieses Projekt auf die Verfeinerung der für chemische Mikroinjektionen von Stoffen Modulation neuronaler Aktivität, vor allem in tiefen Hirnstrukturen verwendeten Verfahren ab. Eine technische Herausforderung, die aus dieser Art von Setup ist die Notwendigkeit für beide Sonden in der gleichen begrenzten Raum in vivo, um eine präzise Aufnahmen an der Injektionsstelle abzuleiten kolokalisiert werden. Dieses Problem kann durch Verwendung von Vorrichtungen, wie zum Beispiel die hier vorgestellt, die in der Lage sowohl Einspritzung und Aufzeichnung an der gleichen Stelle sind überwunden werden. Alternative Verfahren schließen die Verwendung von Vorrichtungen auf Basis von Gasdruckimpulsen. Solche Werkzeuge sind seit vielen Jahren zur Verfügung stehen, aber die Verwendung eines komprimierbaren Zwischen reduziert die Kontrolle über Injektionsraten und Volumina, zwei Parameter, die wichtig sind, um zu steuern, um Reversibilität zu versichern. Andere Verfahren wie Spritz iontophoretischen systems sind ebenfalls erhältlich, aber die Diffusions Dynamik der flüssigen verschiedenen gegen Bolusinjektion, die Verringerung der Potentialbereich der Inaktivierung. Diese Verfahren haben den Vorteil, mit einer sphärischen Streumuster, im Gegensatz zu der für die Mikroinjektionen ⁷ beobachtet elliptischen Musters. Daher sollte die Auswahl der Inaktivierungsverfahren nach der Zielregion und dem experimentellen Design geplant werden. Auch wenn kommerzielle Alternativen gibt, bietet das vorgeschlagene Protokoll eine kosteneffiziente Art und Weise der Überwachung der Arzneistoffabgabe sowie die Möglichkeit für ein hohes Maß an Anpassung. Eine solche Freiheit in der Handwerks der Injektionsvorrichtung begünstigt eine große Auswahl an experimentellen Flexibilität und Tuning für bestimmte Anwendungskontexte.

Im Hinblick auf die vorgeschlagene Protokoll ist der kritische Schritt beim Einfüllen der Glaspipette. Luftblasen sind zu vermeiden, da Luftkompression wird die Überwachung der injizierten renderVolumen unlösbar. Eine sehr minimalen Widerstand sollte auch beim manuellen Schieben Flüssigkeit durch die Pipette, bestätigt freien Fluss des Systems zu spüren sein. Eine Abwesenheit von Flüssigkeit mit manueller Injektion kann auf eine Leckage im System oder falsche Pipetten Herstellung, was zu einer Spitze behindert. Die Impedanz der Pipette sollte auch, um die gewünschte Art elektrophysiologischen Aufzeichnung zu erhalten, gemessen werden (LFP, evozierte Potenziale, Multi-Unit-Aktivität, etc.), da größere Tipps Größen wird in niedriger Impedanzen führen.

Wenn die Injektion erfolgreich ist, ist ein Volumen von 400 bis 800 nl der 300 & mgr; M GABA Lösung oder 2% Lidocain-Lösung genügend abzuschaffen Spikeaktivität. Um eine Vorstellung von der Injektion in Raum und Zeit verteilt haben, können Agar verwendet, um Nervengewebe zu simulieren. Die Ausbreitung der Injektion kann dann leicht mit einem CSB-Lösung beobachtet werden. Nach Simulationen, ist es wichtig, Injektion histologisch verbreiten durch den Einsatz o kennzeichnenf-Farbstoffe, wie CSB, durch Autoradiographie unter Verwendung von radioaktiv markierten Arzneimitteln oder durch Verwendung von Stoffwechsel Ansätze wie Glucose Autoradiographie als indirekte Vertretung zur Aktivierung oder Inaktivierung der Nervenaktivität ¹ zu messen.

Es ist auch wichtig zu beachten, dass schnelle Injektionen (≥100 nl / min) wird wahrscheinlich in Läsionen der vollen Umkehrbarkeit unerreichbar führen. Ein wesentlicher Vorteil des vorgeschlagenen Protokolls ist das Potential der Integration des Einspritzsystems mit Software, die Feedback-Kontrolle würde die Einspritzrate für eine Gruppe neuronaler Aktivität. Eine solche Implementierung würde Forschern ermöglichen, auf die Inaktivierung (oder Aktivierung) Parameter und nicht auf technische Parameter wie Einspritzraten oder Volumina und liefert nur die richtige Menge an Medikament für die betrachtete Anwendung konzentrieren. Dies würde Sonde Verschiebung durch die Optimierung der erforderlichen Medikamentenvolumen gering zu halten, ermöglichen eine zeitkritische Steuerung der Arzneimittelabgabe, begünstigen Reproduzierbarkeit und alleow Direktpaarweisen Vergleich von Daten.

Diese Technik kombiniert ein System zur Substanzabgabe und Aufzeichnung von elektrophysiologischen Signalen. Wir haben gezeigt, seine Wirksamkeit unter Verwendung der Aufnahmekapazität unserer Pipetten funktionell suchen Sie den Colliculus superior durch Induktion Züge von Multi-Unit-Aktivität unter Verwendung von Flash-Reize ^11. Während der Inaktivierung, Multi-Unit-Aktivität vermindert und erholte sich allmählich nach der Injektion gegenüber. Reversible Inaktivierung Techniken, wie das hier vorge bieten erhebliche Vorteile gegenüber mechanischen oder chemischen Schädigungen Techniken, abwesend oder schlechte Erholung ³ bereitzustellen. Reversible Inaktivierung Techniken verstärken die statistische Signifikanz der Experimente, da Paarvergleiche möglich ^3, dadurch spezifische Unterschiede eliminiert. Wir haben eine kostengünstige und anpassbare Technik, die eine genaue Kontrolle über die Dauer des Substanzabgabe und robust lässt entwickeltenSondieren einer Zielhirnbereich.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection pump (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Injection console (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton syringe	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	Syringes between 5 and 10 μl used
Flexible plastic adhesive	Lepage	393915	The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry.
Glass pipettes	WPI	#TW100F-4	Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.	782500	Bare 0.010”