Abstract
Her beskriver vi en metode til konstruktion af en enkelt-brug "injectrode" ved hjælp af kommercielt tilgængelige og prismæssigt overkommelige dele. En sondering system blev udviklet, som muliggør injektion af et lægemiddel under optagelse elektrofysiologiske signaler fra den påvirkede neuronal population. Denne metode giver en enkel og økonomisk alternativ til kommercielle løsninger. Et glas pipette blev modificeret ved at kombinere det med en kanyle og en sølv filament. Den injectrode er knyttet til kommerciel mikrosprøjte pumpe til drug delivery. Dette resulterer i en teknik, der giver real-time farmakodynamik tilbagemelding gennem multi-unit ekstracellulære signaler fra anlægget af lægemiddelafgivelse. Som proof of concept, indspillede vi neuronal aktivitet fra den overlegne colliculus fremkaldt af lysglimt i rotter, samtidig med levering af lægemidler gennem injectrode. Den injectrode optagelse kapacitet tillader funktionel karakterisering af injfdeling websted begunstige præcis kontrol over lokaliseringen af lægemiddelafgivelse. Anvendelse af denne metode udvider også langt ud over, hvad der demonstreres her, som valget af kemiske stof indlæst i injectrode er enorme, herunder sporing markører for anatomiske eksperimenter.
Introduction
Inaktivering af kortikale områder og sub-kortikale kerner er vigtig i studiet af funktionelle relationer mellem forskellige hjernens strukturer 2-4. Nyere litteratur har ansat tab af funktion kemiske eller kryogene teknikker til at studere den rolle, hjernens strukturer 2,5. Med hensyn til farmakologiske mikroinjektioner, kan små volumener af medikamenter indgives i et område af hjernen med en styret hastighed og samtidig minimere de indirekte skader på det omgivende væv 6,7. Denne teknik kan anvendes til at afgive specifikke agonister, inverse agonister eller antagonister til at undersøge effekten af forskellige farmakologiske mål for neuronal aktivitet. Sådanne virkninger kan også blive undersøgt ved at måle ændringer i neuronale svar fra fjerntliggende steder, så forskerne at studere forholdet mellem forskellige kortikale og subkortikale strukturer.
Her viser vi samlingen af en enhed, injectrode, i stand til at both indspilning elektrofysiologiske signaler og levere små mængder narkotika på målet placering. Vi demonstrere mulighederne for dette system ved at injicere GABA, en fælles inhibitor af neuronal aktivitet, i rotten superior colliculus. Denne region er følsom over for visuel stimulation, som tilladt os at bruge visuelt fremkaldte multiunit aktivitet for at bekræfte injectrode lokalisering. Den reversibilitet inaktivering blev vurderet ved inddrivelse af normale neuronal aktivitet efter afslutningen af GABA injektion.
Muligheden for at overvåge flere enheder aktivitet fra injektionsstedet muliggør finjustering af injektionsrater og mængder er nødvendige for at opnå den ønskede farmakodynamiske respons. Derfor er en fordel ved denne teknik, er den potentielle begrænsning af vævsskader forårsaget af mikroperfusionskammeret, eftersom de mindste effektive mængder injiceres. Den foreslåede protokol giver en omkostningseffektiv metode til at generere den disponible hardware necessary for ledende eksperimenter, hvor drug delivery og lokale neuronal aktivitet optagelse ønskes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med de direktiver, af det canadiske Rådet for beskyttelse af dyr og den etiske gennemgang bestyrelsen for Université de Montréal.
1. Montering af Recording-injektion Pipette
- Træk en ca. 7 cm lang glaskapillar (1 mm ydre diameter) ved anvendelse af en pipette aftrækker.
- Bryde spidsen af kapillaret og tjekke åbningen under et lysmikroskop. Bekræfte, at den indre diameter er mellem 30 um til 40 um.
- Indsæt en 7 cm lang sølvtråd i glasset kapillarrør med ca. 1 cm stikker ud fra den ikke-tilspidsede ende af glasset pipette.
- Bøj det overskydende glødetråd vinkelret på glasset kapillær.
- Påfør en dråbe af fleksibelt plast klæbemiddel på skaftet af en 30 G kanyle.
- Indsæt en 30 G kanyle i glasset pipette ifølge Skema vist i figur 1
- Tilføj et andet overtræk af lim for at sikre en korrekt forsegling fra krydset mellem glasset pipetten og injektionsnålen.
- Efterlad pipetten at tørre med spidsen opad i ca. 12 timer for at sikre korrekt hærdning af limen. Det færdige resultat er vist i figur 2.
BEMÆRK: Denne procedure udføres på akutte forsøg og sterilisering af pipettespidsen er ikke påkrævet.
2. Animal Forberedelse
- Placer rotte i en anæstesi kassen.
- Narkosen anvendelse af 4% isofluran i 5 til 10 min.
- Sende dyret på et stereotaktisk bord med varmepude og rektal sonde til at opretholde en legemstemperatur på 37 ° C. Brug en næse kegle til at opretholde anæstesi med 2% isofluran. Fastgør rottens hoved ved hjælp af øre barer og tænder holder.
- Anvend oftalmologiske salve eller øjendråber, som omfatter 1% Atropin dråber at støtte i udvidelse af pupillerne. For at forhindre tørhed, gælder smørende drops ca hver 30 min.
- Barbere hovedet og rengøre den med 10% povidon-jod.
- Til lokal anæstesi injiceres 0,5 ml 2% lidocain under hovedbunden i 2-3 steder ved at løfte op i huden og indsætning af spidsen af nålen.
- Bekræft passende anæstetika ved at udføre en tå knivspids og observere den manglende bevægelse. Desuden overvåger puls at sikre, at det er inden for normale værdier (300 til 400 slag / min).
- Incise hovedbunden i en lige linje langs medianen med en # 10 skalpel for at eksponere både koronale og sagittale suturer.
- Afsløre Lambda og Bregma point ved at skubbe til side væv, der dækker kraniet med en kirurgisk spatel.
- Niveau kraniet, så Bregma og Lambda positioner er på samme plan.
- For at indstille referencepunktet, skal du bruge en stereotaktisk apparat med en monteret glasrør at sætte den lige over Bregma. Dette vil være "nul" for antero-posterior og withial-laterale målinger koordinater.
- Sæt interessepunktet ved at flytte stereotaktisk mount til de ønskede koordinater, notere stereotaksiske koordinater og tegne en firkant omkring målområdet, der markerer hvor kraniotomi vil blive udført.
- Anvend en kirurgisk bor med en steriliseret boremaskine langs den markerede firkant langsomt uden tryk til langsomt fjerne knoglemateriale. Vær forsigtig med ikke at bore for længe i det samme område, da det vil producere varme og forårsage læsioner på cortex.
- Når knoglen afgrænser kraniotomi er blevet tilstrækkeligt tyndt, forsigtigt fjerne kranie sektion med en pincet til at afsløre cortex.
- Ofte overrisle den udsatte cortex med kunstig cerebral spinalvæske at forhindre væv udtørring.
BEMÆRK: Dura mater fjernelse er unødvendigt på rotten som spidsen af injectrode er robust nok til at trænge.
3. Påfyldning og montering af indsprøjtningssystemet
- Fyld5-10 pi mikrosprøjte ved aspiration med mineralsk olie.
- Fyld kanylen med det faste glas pipette med en opløsning af 0,5% Chicago Himmelblå (CSB) og 300 uM γ-aminosmørsyre (GABA), eller en opløsning af 2% lidocain med 0,5% CSB 9. Fortynd alle løsninger med saltvand.
- I tilfælde af en rigelig stof, fyld hjælp af en almindelig injektionssprøjte og bruge de sædvanlige forholdsregler teknikker til at undgå dannelse af luftbobler.
- I tilfælde af dyrere stoffer, bruge mineralsk olie til at fylde injectrode og det kemiske middel kan derefter indføres ved aspiration. Da forskellen densitet mellem mineralolie og vand er relativt høj, dette stof er en god kandidat til injektion af vandige opløsninger.
BEMÆRK: En farvestof kan tilsættes for at bekræfte adskillelsen mellem de to væsker.
- For at fylde injektionen pipette, fylde en 1 ml sprøjte med opløsningen ved aspiration og derefter langsomt injicere opløsningenind injektionspipetten.
- Være meget opmærksom for utætheder i regioner, der er angivet i figur 1 ved pensling disse områder rene og observere lækager ved yderligere injicere opløsningen langsomt med sprøjten.
- Fjern 1 ml sprøjte. Når du gør det, skal du sørge for at holde et let tryk på stemplet, så vakuum ikke fjerner løsningen fra injektion pipette.
- Fyld mikrosprøjte med mineralolie ved aspiration og sæt det korrekt på den fyldte injektion pipette, derefter forsigtigt tørre væk enhver overskydende opløsning fra den samlede injectrode med gaze.
- Kontrollere, at spidsen ikke er blokeret ved at injicere en meget lille volumen, nok til at se en lille dråbe danner på spidsen af glasset pipette.
- Monter injectrode på mikropumpe systemet og sikre, at det er godt fast.
- Placer forsigtigt injectrode spids ved mål-koordinaterne og sænk spidsen til overfladen af cortex.
- Sænk langsomt injectrode hjælp af stereotaktisk apparat til målstrukturen (superior colliculus i dette tilfælde) under anvendelse af de korrekte anatomiske koordinater.
- Dække den udsatte cortex med varm agar for at forhindre væv udtørring.
4. Injektion og Vendbar Inaktivering
- Indstil mikroinjektion pumpe til at injicere 400 800 nl på 40 nl / min og tryk på Kør for at starte indsprøjtning. Bemærk, at spike sats vil vise reduktion under injektionen.
BEMÆRK: I forsøgsopstillingen, neurale aktivitet genvundet inden for en time efter afslutningen af GABA levering. Enhver kalibreret mekanisk anordning kan bruges til at lægge pres på den mikroinjektion sprøjten for at gennemføre injektionen. - Efter overtagelsen af elektrofysiologiske data, aflive bruge en metode, der er godkendt af den lokale Animal Ethics Fællesskabet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktionen af injectrode er illustreret i figur 1. En sølvtråd (C) tilføres i et glas pipette (D) med en del af tråden bøjet og rager ud fra åbningen. En 30 G nål (B) er fastgjort og forseglet til åbningen af glasset pipette med lim. Efter pipetten er blevet fyldt med injektionen stof, er et glas mikro sprøjte (A) fastgjort til nålen. Det er vigtigt, at der er en god forsegling, hvor mikro sprøjte forbinder med nålen (E), og hvor sølvtråd rager frem fra glaspipette (F). Figur 2 viser et fotografi af, hvad injectrode ser ud efter endt montage.
Visuelt fremkaldte multiunit aktivitet opnåedes i superior colliculus efter en 300 msek flash til den kontralaterale øje som illustreret i figur 3. Efter injektion af GABA, spiking aktivitet som respons på en flash stimulus blev undertrykt. visueltfremkaldte multiunit aktivitet typisk tilbage mellem 45 til 60 min efter injektion er ophørt.
Figur 4 illustrerer opsætning af mikroinjektion systemet. Indsprøjtningspumpen controller giver brugeren mulighed for at angive indstillingerne for injektion. En fjeder elektrisk konnektor forbinder sølv ledning, der rager frem fra glaspipette. Stikket fører til et hoved scene med jorden og reference elektroder og derefter sat i en forstærker. En analog / digital (A / D) grænseflade bruges til at erhverve de elektrofysiologiske data, og en højttaler bruges til supplerende audio overvågning af neuronal aktivitet.
Figur 1:. Skematisk afbildning af samlingen injectrode En mikro sprøjte (A) er fastgjort til optagelsen injektion pipette som består af en 30 G hypodermic nål (B) klæbet til en sølvtråd (C) inde i et glas pipette (D). Regioner kredsede (E - F) fremhæve områder, der kan være modtagelige for utætheder.
Figur 2: Et billede af den beregnede pipette anvendelse af en 30 G nål (B), vandtæt selvklæbende lim (F), en sølvtråd (C) og et glas pipette (D).
Figur 3: En illustration af den inhiberende virkning af injektionen af GABA (300 uM) på visuelt fremkaldte flere enheder aktivitet i superior colliculus, pile angiver flash debut. Electrical signaler blev filtreret under anvendelse af et båndpasfilter indstilles mellem 30 og 3.000 Hz.
Figur 4: Skematisk repræsentation af det komplette mikro-indsprøjtningssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreslåede protokol er designet til at løse de udfordringer, der følger af de nuværende reversible inaktiveringsmetoder. Specifikt giver dette projekt sigte på at forbedre de metoder, der anvendes til kemiske mikroinjektioner af stoffer modulerende neurale aktivitet, især i dybe hjernens strukturer. En teknisk udfordring på vej ud denne type opsætning er behovet for begge prober, der skal colocalized i samme begrænset rum in vivo for at udlede nøjagtige optagelser på injektionsstedet. Dette problem kan overvindes ved at anvende indretninger, som den præsenteres her, som er i stand til både injektion og optagelse på det samme sted. Alternative metoder omfatter anvendelse af enheder baseret på gas trykimpulser. Sådanne værktøjer har været tilgængelige i mange år, men anvendelsen af et sammentrykkeligt mellemliggende reducerer kontrol over injektionsrater og volumener, to parametre, som er vigtige for at kontrollere at forsikre reversibilitet. Andre metoder såsom iontoforetisk injektion systems er også tilgængelige, men de diffusion dynamik væsken er forskellige versus bolusinjektion, hvilket reducerer den potentielle vifte af inaktivering. Disse metoder har den fordel at have en sfærisk diffusion mønster i modsætning til den elliptiske mønster observeret for mikro-injektioner 7. Derfor bør valget af inaktiveringsfremgangsmåden planlægges ifølge målområdet og det eksperimentelle design. Selvom kommercielle alternativer eksisterer, giver den foreslåede protokol en omkostningseffektiv måde at overvåge farmaceutiske levering stof samt giver mulighed for en høj grad af tilpasning. Sådan frihed i crafting af injektionen enhed favoriserer en lang række eksperimentelle fleksibilitet og tuning til specifikke anvendelsesområder sammenhænge.
Med hensyn til den foreslåede protokol, det kritiske trin er processen med at fylde glaspipette. Luftbobler bør undgås, da luft komprimering vil gøre overvågningen af injiceretmængder vanskelige. En meget minimal modstand bør også mærkes ved manuel skubbe væske gennem pipetten, bekræfter fri strømning i systemet. En mangel på væske med manuel indsprøjtning kan indikere en utæthed i systemet eller forkert pipette forberedelse resulterer i en blokeret spids. Bør også måles Impedansen af pipetten for at opnå den ønskede type elektrofysiologiske optagelse (LFP, fremkaldte potentialer, multi-enhed aktivitet osv), som større tips størrelser vil resultere i lavere impedanser.
Hvis injektionen er vellykket, et volumen på 400 til 800 nl af 300 pM GABA opløsning eller 2% lidocain løsning er nok til at afskaffe spiking aktivitet. At have en idé af injektionen spredt i tid og rum, kan agar bruges til at simulere nervevæv. Udbredelsen af injektionen kan derefter let iagttages med en CSB opløsning. Efter simuleringer, er det vigtigt at karakterisere injektion spredes histologisk ved anvendelse of farvestoffer såsom CSB, ved autoradiografi hjælp radioaktivt mærkede stoffer eller ved at bruge metaboliske metoder såsom glucose autoradiografiundersøgelser som indirekte fuldmagter til at måle aktivering eller inaktivering af neurale aktivitet 1.
Det er også vigtigt at bemærke, at hurtige injektioner (≥100 nl / min) vil sandsynligvis resultere i læsioner under fuld reversibilitet uopnåelige. En stor fordel ved den foreslåede protokol er potentialet i at integrere indsprøjtningssystemet med software, der ville tilbagekoblingsudledte kontrollere injektionshastighed for et sæt neuronal aktivitetsniveau. En sådan implementering ville tillade forskerne at fokusere på inaktivering (eller aktivering) parametre snarere end på tekniske parametre såsom injektionsrater eller mængder leverer mens kun den rette mængde lægemiddel til den pågældende applikation. Dette ville minimere sonde fortrængning ved at optimere den nødvendige medicin volumen, give mulighed for mere tidsfølsomme styring af lægemiddeladministration, favorisere reproducerbarhed og alleow direkte parrede sammenligning af data.
Denne teknik kombinerer et system for stof levering og registrering af elektrofysiologiske signaler. Vi vist sin effektivitet ved hjælp af optagelse kapacitet i vores pipette til funktionelt lokalisere den overlegne colliculus ved at inducere tog af multi-enhed aktivitet under anvendelse af flash stimuli 11. Under inaktivering, multi-enhed aktivitet formindsket og gradvist genvundet efter injektion offset. Vendbare inaktivering teknikker, såsom den ene præsenteres her, giver betydelige fordele i forhold mekaniske eller kemiske læsioner teknikker, der giver fraværende eller dårligt 3 opsving. Reversible inaktivering teknikker styrke den statistiske signifikans af forsøgene siden parvise sammenligninger er mulige 3 for derved at eliminere idiosynkratiske forskelle. Vi har udviklet en omkostningseffektiv og tilpasses teknik, der giver præcis kontrol over varigheden af leveringen substans og den robusteprobning af et mål cerebral område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
- Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
- Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
- Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
- Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
- Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
- Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
- Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
- Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).
