Abstract
כאן אנו מתארים שיטה לבניית "injectrode" שימוש יחיד באמצעות חלקים מסחריים נגישים ובמחיר סבירים. מערכת חיטוט פותחה המאפשרת להזרקה של תרופה בעת הקלטת אותות אלקטרו מהאוכלוסייה העצבית הפגועה. שיטה זו מספקת אלטרנטיבה פשוטה וחסכונית לפתרונות מסחריים. פיפטה זכוכית שונה על ידי שילוב שלו עם מזרק ונימת כסף. Injectrode מחובר למשאבת microsyringe מסחרית עבור משלוח סמים. התוצאה היא טכניקה המספקת משוב פרמקודינמיקה בזמן אמת באמצעות אותות תאיים רבת יחידה שמקורם מהאתר של אספקת סמים. כהוכחה של מושג, הקלטנו פעילות עצבית מcolliculus מעולה שהושרו על ידי הבזקי אור בחולדות, במקביל עם משלוח של תרופות דרך injectrode. קיבולת הקלטת injectrode מאפשרת אפיון הפונקציונלי של injאתר שיקוף העדפת שליטה מדויקת הלוקליזציה של אספקת סמים. יישום של שיטה זו גם חורג הרבה מעבר למה שהפגין כאן, כבחירה של חומר כימי נטענה לתוך injectrode היא עצומה, כולל איתור סמנים לניסויים אנטומיים.
Introduction
איון של אזורים בקליפת המוח וגרעינים תת-קליפת המוח הוא חשוב בחקר יחסים פונקציונליים בין מבנים השונים במוח 2-4. הספרות האחרונה העסיקה כימית או טכניקות קריוגני פסד של פונקציה כדי ללמוד את התפקיד של מבני מוח 2,5. בהקשר לmicroinjections התרופתי, בנפחים קטנים של תרופות יכולים להינתן לאזור במוח בקצב מבוקר תוך מזעור הנזקים נלווים ל6,7 הרקמה הסובבת. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לספק אגוניסטים ספציפיים, אגוניסטים הפוך או יריבים כדי לחקור את ההשפעה של מטרות תרופתיות שונות על פעילות עצבית. יכולים להיות גם למדו אפקטים כגון על ידי מדידת שינויים בתגובות עצביות ממקומות מרוחקים, המאפשרת לחוקרים ללמוד את היחסים בין מבנים בקליפת המוח וקורטיקליים שונים.
הנה, אנחנו מדגימים את ההרכבה של מכשיר, injectrode, מסוגל boה הקלטת אותות אלקטרו ומתן כמויות קטנות של סמים במיקום היעד. אנחנו מדגימים את היכולות של מערכת זו על ידי הזרקת GABA, מעכב משותף של פעילות עצבית, בcolliculus מעולה החולדה. אזור זה הוא רגיש לגירוי חזותי, אשר אפשר לנו להשתמש בפעילות multiunit עוררה חזותי כדי לאשר לוקליזציה injectrode. ההפיכות של איון הוערכו על ידי ההתאוששות של פעילות עצבית נורמלית לאחר תום הזרקת GABA.
היכולת לעקוב אחר פעילות יחידה רבת מאתר ההזרקה מאפשרת כוונון העדין של שיעורי ההזרקה וכרכים דרושים כדי להשיג את התגובה הפרמקודינמית הרצויה. לכן, יתרון של שיטה זו הוא פוטנציאל הגבלה של נזק לרקמות שנגרמו על ידי microperfusion, מאז הכרכים היעילים הקטנים מוזרקים. הפרוטוקול המוצע מספק שיטה יעילה עלות ליצירת necessar החומרה חד פעמיy לניסויי ניהול שבו משלוח סמים והקלטת פעילות עצבית המקומית הוא רצויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית להגנה על בעלי חיים והמועצה לביקורת האתיקה של אוניברסיטת מונטריאול.
1. אסיפה של פיפטה הקלטת ההזרקה
- משוך נימים כ 7 סנטימטר ארוכות זכוכית (קוטר חיצוני 1 מ"מ) באמצעות חולץ פיפטה.
- לשבור את הקצה של הנימים ולבדוק את הצמצם תחת מיקרוסקופ אור. ודא שהקוטר הפנימי הוא בין 30 מיקרומטר עד 40 מיקרומטר.
- הכנס חוט כסף ארוך 7 סנטימטרים לתוך נימי זכוכית עם כ 1 סנטימטר הבולט מהקצה הלא המחודד של פיפטה הזכוכית.
- לכופף את החוט העודף orthogonally לנימי הזכוכית.
- החל טיפה של דבק פלסטי גמיש בפיר של מחט מזרק 30 G.
- הכנס מזרק 30 G בפיפטה הזכוכית לפי השרטוטים מוצגים באיור 1
- הוסף ציפוי שני של דבק על מנת להבטיח חותם ראוי מהצומת בין פיפטה הזכוכית והמזרק.
- השאר את פיפטה לייבוש עם הקצה פונה כלפי מעלה לכ -12 שעות על מנת להבטיח ריפוי תקין של הדבק. התוצאה המוגמרת מוצגת באיור 2.
הערה: הליך זה נעשה על ניסויים ועיקור של קצה פיפטה חריפים לא נדרשה.
2. הכנת בעלי החיים
- מניחים את החולדה בתיבת הרדמה.
- לגרום להרדמה באמצעות isoflurane 4% במשך 5 עד 10 דקות.
- מניחים את החיה על שולחן stereotaxic עם כרית חימום ובדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס. השתמש חרטום כדי לשמור על הרדמה עם isoflurane 2%. Secure ראשו של העכברוש באמצעות מוטות אוזן ובעל שיניים.
- החל טיפות משחה או עין עיניים, הכוללות% 1 אטרופין טיפות כדי לסייע בהרחבת אישון. כדי למנוע יובש, תחול ירידת הסיכהזה בערך כל 30 דקות.
- לגלח את הראש ולנקות אותו עם 10% povidone- יוד.
- להרדמה מקומית, להזריק 0.5 מיליליטר של לידוקאין 2% מתחת לקרקפת במקומות 2-3 על ידי הרמת העור והחדרת קצה המחט.
- אשר רמה נאותה של הרדמה על ידי ביצוע קמצוץ הבוהן והתבוננות חוסר התנועה. בנוסף, לפקח על קצב הלב כדי לוודא שהוא נמצא בערכים נורמלים (300 עד 400 פעימות / דקה).
- לחתוך את הקרקפת בקו ישר לאורך החציון עם להב 10 אזמל # לחשוף שני תפרי עטרה ועל sagittal.
- לחשוף את הנקודות למבדה וגבחת על ידי לחיצה בצד את הרקמה שמכסה את הגולגולת עם מרית כירורגית.
- רמת הגולגולת כך שעמדות גבחת וLambda נמצאות על אותו המישור.
- כדי להגדיר את נקודת ההתייחסות, להשתמש בהתקן stereotaxic עם שפופרת זכוכית רכובה להגדיר אותו ממש מעל גבחת. זה יהיה "אפס" ולAntero-אחורי medמדידות ial-רוחב קואורדינטות.
- הגדר את נקודת העניין על ידי הזזת stereotaxic הר לקואורדינטות הנדרשות, לציין את קואורדינטות stereotaxic ולצייר ריבוע מסביב לאזור היעד שמסמן בי craniotomy יבוצע.
- השתמש תרגיל כירורגית עם תרגיל מעוקר לאורך הכיכר המסומנת לאט בלי לחץ כדי להסיר את חומר העצם לאט. היזהר שלא לקדוח יותר מדי זמן באותו האזור, כפי שהוא יפיק חום ולגרום לנגעים בקליפת המוח.
- כאשר עצם תיחום craniotomy הפך דק מספיק, להסיר בזהירות את סעיף הגולגולת עם פינצטה כדי לחשוף את הקליפה.
- לעתים קרובות להשקות את הקליפה החשופה עם נוזל השדרה מוחין מלאכותי כדי למנוע התייבשות רקמה.
הערה: הסרת מאטר דורה היא מיותרת על העכברוש כמו הקצה של injectrode הוא יציב מספיק כדי לחדור.
3. מילוי והרכבה של מערכת ההזרקה
- מלא5-10 microsyringe μl על ידי שאיפה עם שמן מינרלים.
- מלא את המזרק עם פיפטה הזכוכית קבועה עם תמיסה של 0.5% שמיים כחולים שיקגו (CSB) וחומצת 300 מיקרומטר γ-aminobutyric (GABA) או פתרון של לידוקאין 2% עם 0.5% 9 CSB. לדלל את כל הפתרונות עם מי מלח.
- במקרה של חומר בשפע, למלא באמצעות מזרק רגיל ולהשתמש בטכניקות הזהירות הרגילות, כדי למנוע ההיווצרות של בועות אוויר.
- במקרה של חומרים יקרים יותר, להשתמש בשמן מינרלים כדי למלא את injectrode והסוכן הכימי אז יכול להיות שהוצג על ידי שאיפה. כהפרש בין צפיפות נפט ומים מינרליים הוא יחסית גבוה, חומר זה הוא מועמד טוב להזרקה של תמיסות מימיות.
הערה: צבע ניתן להוסיף כדי לאשר את ההפרדה בין שני הנוזלים.
- כדי למלא את פיפטה ההזרקה, למלא מזרק 1 מיליליטר עם הפתרון על ידי שאיפה ולאחר מכן להזריק את הפתרון לאטלפיפטה ההזרקה.
- שים לב זהיר להדלפות באזורים שצוינו באיור 1 על ידי שטיפת אזורים אלה נקיים והתבוננות דליפות על ידי הזרקת הפתרון לאט עם המזרק נוסף.
- הסר את מזרק 1 מיליליטר. כאשר עושים זאת, כדי להיות בטוח לשמור על לחץ קל על הבוכנה כך שהוואקום אינו מסיר את הפתרון מפיפטה ההזרקה.
- מלא את microsyringe עם שמן מינרלים על ידי שאיפה ולצרף אותו בחוזקה לפיפטה ההזרקה המלא, ולאחר מכן לנגב בזהירות כל פתרון עודף מinjectrode התאסף עם גזה.
- ודא שהקצה אינו חסום על ידי הזרקת נפח קטן מאוד, מספיק לראות טיפה קטנה ויוצרת בקצה של פיפטה הזכוכית.
- הר injectrode על מערכת micropump ולוודא שהוא קבוע גם.
- מקם בזהירות את קצה injectrode בקואורדינטות היעד ולהוריד את הקצה אל פני השטח של קליפת המוח.
- לאט לאט להוריד את injectrשיר הלל באמצעות המנגנון stereotaxic למבנה היעד (colliculus מעולה במקרה זה) באמצעות קואורדינטות אנטומי המתאימות.
- מכסה את הקליפה החשופה עם אגר חם כדי למנוע התייבשות רקמה.
4. הזרקה ואיון הפיך
- הגדר את משאבת microinjection להזריק 400 עד 800 NL ב 40 / הפעלת דקות ועיתונות NL להתחיל ההזרקה. שים לב ששיעור ספייק יציג ירידה בהזרקה.
הערה: בהגדרת הניסוי, פעילות עצבית התאוששה תוך שעה לאחר תום מסירת GABA. כל מכשיר מכאני מכויל ניתן להשתמש כדי להפעיל לחץ על מזרק microinjection כדי לנהל את הזריקה. - לאחר רכישת נתונים אלקטרו, להרדים בשיטה אושרה על ידי בעלי החיים האתיקה הקהילה המקומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבנייה של injectrode מתוארת באיור 1. חוט כסף (C) מוזנת לתוך פיפטה זכוכית (ד ') עם חלק מהכפוף התיל ובולט החוצה מהפתיחה. מחט 30 G (B) מצורף ואטום לפתיחת פיפטה הזכוכית עם דבק. לאחר פיפטה כבר מלאה בחומר ההזרקה, מזרק מיקרו זכוכית () מחובר למחט. חשוב שיש חותם טוב בי מזרק מיקרו מתחבר עם המחט (E) ובו חוטי הכסף שבולט מפיפטה הזכוכית (F). איור 2 מציג תצלום של מה injectrode נראה כמו אחרי שסיימתי את ההרכבה.
פעילות multiunit עוררה חזותי התקבלו בcolliculus מעולה הבא פלאש msec 300 לעין הנגדית כפי שמודגם באיור 3. לאחר ההזרקה של GABA, spiking פעילות בתגובה לגירוי הבזק דוכאה. מבחינה ויזואליתפעילות multiunit עורר חזר בדרך כלל בין 45 עד 60 דקות לאחר ההזרקה חדלה.
איור 4 ממחיש את ההתקנה של מערכת microinjection. בקר משאבת ההזרקה מאפשר למשתמש להגדיר את ההגדרות להזרקה. מחבר חשמל האביב מחבר את חוט הכסף שבולט החוצה מפיפטה הזכוכית. המחבר מביא לבמת ראש עם אלקטרודות קרקע והתייחסות ולאחר מכן מחובר למגבר. אנלוגי / דיגיטלי (A / D) ממשק משמש לרכישת נתונים אלקטרו, ודובר משמש למשלים אודיו ניטור של פעילות עצבית.
איור 1:. ייצוג סכמטי של ההרכבה injectrode מזרק מיקרו () מחובר לפיפטה הקלטת ההזרקה אשר מורכבת של שעות 30 Gמחט ypodermic (ב) הדבקה חוט כסף (ג) בתוך טפטפת זכוכית (ד '). אזורים הקיפו (E - F) אזורי שיא שעשויה להיות רגישים לדליפות.
איור 2: תמונה של פיפטה נבנתה באמצעות מחט 30 G (B), דבק עמיד למים (F), חוט כסף (C) וטפטף זכוכית (ד ').
איור 3: איור של ההשפעה המעכבת של ההזרקה של GABA (300 מיקרומטר) על פעילות יחידה רבת עוררו חזותי בcolliculus מעולה, חצים מצביעים הבזק תחילת. חשמליאותות אל סוננו באמצעות מסנן להקה עובר להגדיר בין 30 ל -3,000 הרץ.
איור 4: ייצוג סכמטי של מערכת הזרקת מיקרו המלאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצע נועד לפתור את האתגרים הנובעים משיטות איון הפיכים הנוכחיות. באופן ספציפי, הפרויקט הזה במטרה לשכלל את השיטות המשמשות לmicroinjections הכימי של חומרי ויסות פעילות עצבית, במיוחד במבני מוח עמוקים. אתגר טכני המתעוררים מסוג זה של התקנה הוא את הצורך בשני הבדיקות שcolocalized באותו המרחב מוגבל בvivo כדי להפיק הקלטות מדויקות במקום ההזרקה. בעיה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש במכשירים, כגון זו שהוצגה כאן, שמסוגל גם ההזרקה והקלטה באותו האתר. שיטות אלטרנטיביות כוללות שימוש במכשירים הבוסס על קטניות לחץ גז. כלים כאלה היו זמינים במשך שנים רבות, אבל השימוש בדחיסת ביניים מפחיתה את השליטה על שיעורי הזרקה וכרכים, שני פרמטרים שחשובים לשלוט להבטיח הפיכות. שיטות אחרות כגון הזרקת iontophoretic שלystems זמין גם, אבל דינמיקת דיפוזיה של הנוזלים שונות לעומת הזרקת בולוס, צמצום הטווח הפוטנציאלי של איון. שיטות אלה יש את היתרון של דפוס דיפוזיה כדורי בניגוד לדפוס אליפטי נצפה למיקרו-הזרקות 7. לפיכך, הבחירה של שיטת איון צריכה להיות מתוכננת בהתאם לאזור היעד ותכנון הניסוי. למרות חלופות מסחריות קיימות, הפרוטוקול המוצע מספק דרך יעילה עלות ניטור משלוח חומר התרופות, כמו גם מאפשר לרמה גבוהה של התאמה אישית. חופש כזה בצורפות של מכשיר ההזרקה מעדיף מגוון גדול של גמישות ניסיונית וכוונון להקשרי יישום ספציפיים.
בכל הקשור לפרוטוקול המוצע, השלב הקריטי הוא התהליך של מילוי פיפטה הזכוכית. יש להימנע בועות אוויר, כמו דחיסת אוויר תהפוך את הניטור של מוזרקכרכים סוררים. גם התנגדות מינימאלית מאוד צריכה להיות מורגשת כאשר דוחפים ידני נוזלי באמצעות פיפטה, המאשר זרימה חופשית במערכת. היעדר הנוזל עם הזרקה ידנית עשוי להצביע על דליפה במערכת או הכנת פיפטה שגויה וכתוצאה מקצה חסום. גם העכבה של פיפטה יש למדוד על מנת לקבל הקלטת אלקטרו הסוג הרצוי (LFP, פוטנציאלים מעוררים, פעילות רבת-יחידה, וכו '), כמו טיפים גדלים גדולים יותר יגרמו לעכבות נמוכות יותר.
אם הזריקה היא מוצלחת, בהיקף של 400 עד 800 NL של פתרון מיקרומטר GABA 300 או הפתרון לידוקאין 2% הוא מספיק כדי לבטל spiking פעילות. יש לי רעיון של ההזרקה התפשטה במרחב ובזמן, אגר יכול לשמש כדי לדמות רקמת עצבים. התפשטות ההזרקה אז ניתן להבחין בקלות עם פתרון CSB. לאחר סימולציות, זה חיוני כדי לאפיין הזרקה להפיץ היסטולוגית באמצעות oF צבעים כגון CSB, על ידי שימוש בסמי autoradiography רדיואקטיבי או באמצעות גישות חילוף חומרים כגון שליחים עקיפים כautoradiography גלוקוז למדוד הפעלה או איון של פעילות עצבית 1.
כמו כן, חשוב לשים לב שהזריקות מהירות (≥100 / דקת NL) צפוי לגרום לנגעי ביצוע הפיכות מלאים בלתי ניתנות להשגה. יתרון עיקרי של הפרוטוקול המוצע הוא הפוטנציאל של שילוב מערכת ההזרקה עם תוכנה שמשוב לשלוט בקצב ההזרקה לרמת פעילות עצבית סט. יישום כזה יאפשר לחוקרים להתמקד באיון (או ההפעלה) פרמטרים ולא על פרמטרים טכניים כגון שיעורי הזרקה או כרכים תוך אספקת הכמות הנכונה של תרופה רק ליישום נחשב. זה היה למזער עקירת בדיקה על ידי אופטימיזציה של נדרשת נפח התרופה, מאפשר שליטה בזמן רגיש יותר של אספקת הסמים, מעדיף שחזור וכלהשוואה לזווג ישירה ow של נתונים.
טכניקה זו משלבת מערכת למסירת חומר והקלטה של אותות אלקטרו. אנחנו הוכחנו את יעילותה על ידי שימוש בקיבולת ההקלטה של פיפטה שלנו כדי לאתר את colliculus מעולה תפקודי על ידי גרימת רכבות של פעילות רבת יחידת הבזק באמצעות גירויים 11. במהלך איון, פעילות רבת יחידה פחתה והתאוששה בהדרגה לאחר ההזרקה לקזז. טכניקות הפיכים איון, כגון זו שהוצגה כאן, מספקות יתרונות רבים על פני שיטות נגעים מכאניים או כימיים המספקות התאוששות 3 נעדרה או עניה. טכניקות איון הפיכים לחזק את המובהקות הסטטיסטיות של ניסויים מאז השוואות לזווג אפשריות 3, ובכך למנוע הבדלים ייחודיים. פיתחנו טכניקה יעילה וניתנת להתאמה אישית עלות המאפשרת שליטה מדויקת על משך מסירת החומר והחזקחיטוט של אזור במוח יעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
- Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
- Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
- Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
- Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
- Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
- Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
- Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
- Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).
