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Neuroscience

Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

Published: July 7, 2015 doi: 10.3791/52271

Abstract

Qui si descrive un metodo per la costruzione di un mono-uso "injectrode" utilizzando parti commercialmente accessibili e convenienti. Un sistema di ispezione è stato sviluppato che consente l'iniezione di un farmaco durante la registrazione di segnali elettrofisiologici dalla popolazione neuronale colpita. Questo metodo fornisce una semplice ed economica alternativa alle soluzioni commerciali. Una pipetta di vetro è stato modificato combinandolo con un ago ipodermico e un filamento d'argento. Il injectrode è collegato a pompa Microsiringa commerciale per la somministrazione di farmaci. Ciò si traduce in una tecnica che fornisce feedback farmacodinamica tempo reale attraverso segnali extracellulari più unità provenienti dal sito di somministrazione di farmaci. Come un proof of concept, abbiamo registrato l'attività neuronale del collicolo superiore suscitata da lampi di luce nei ratti, in concomitanza con la consegna di farmaci attraverso il injectrode. La capacità di registrazione injectrode permette la caratterizzazione funzionale del injsito ezione favorendo un controllo preciso sulla localizzazione del drug delivery. L'applicazione di questo metodo si estende anche ben oltre ciò che è dimostrato qui, come la scelta di sostanza chimica caricato nel injectrode è vasta, tra cui tracciare i marcatori per esperimenti anatomici.

Introduction

L'inattivazione di aree corticali e nuclei sottocorticali è importante nello studio delle relazioni funzionali tra varie strutture cerebrali 2-4. La letteratura recente ha impiegato tecniche criogeniche chimica perdita-di-funzione o per studiare il ruolo delle strutture cerebrali 2,5. Per quanto riguarda microiniezioni farmacologiche, piccoli volumi di farmaci possono essere somministrati in una regione del cervello ad una velocità controllata, riducendo al minimo i danni collaterali al 6,7 tessuto circostante. Questa tecnica può essere usata per fornire agonisti specifici, agonisti inversi o antagonisti per studiare l'effetto di differenti bersagli farmacologici sulla attività neuronale. Tali effetti possono essere studiati da cambiamenti nelle risposte neuronali provenienti da località lontane misura, consentendo ai ricercatori di studiare i rapporti tra diverse strutture corticali e subcorticali.

Qui, dimostriamo l'assemblaggio di un dispositivo, il injectrode, capace di both registrazione di segnali elettrofisiologici e consegna di piccole quantità di droga nel luogo di destinazione. Dimostriamo le capacità di questo sistema iniettando GABA, un inibitore comune di attività neuronale, nel ratto collicolo superiore. Questa regione è sensibile alla stimolazione visiva, che ci ha permesso di utilizzare l'attività multiunit evocata visivamente per confermare la localizzazione injectrode. La reversibilità della inattivazione è stata valutata dalla ripresa della normale attività neuronale dopo la fine dell'iniezione GABA.

La possibilità di monitorare l'attività multi-unit dal sito di iniezione consente la messa a punto dei tassi di iniezione e volumi necessari per ottenere la risposta farmacodinamica desiderato. Pertanto, un vantaggio di questa tecnica è il potenziale limitazione di danni ai tessuti causati da microperfusione, poiché i volumi efficaci piccoli vengono iniettati. Il protocollo proposto fornisce un metodo efficiente di costo per la generazione del necessar hardware monousoy per esperimenti che conducono in cui si desidera la consegna della droga e la registrazione dell'attività neuronale locale.

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Protocol

NOTA: Tutte le procedure sono state eseguite in conformità alle direttive del Consiglio canadese per la protezione degli animali e la revisione consiglio Etico della Université de Montréal.

1. Assemblea della pipetta registrazione iniezione

  1. Estrarre un capillare di vetro di circa 7 cm di lunghezza (diametro esterno 1 mm) con un estrattore pipetta.
  2. Rompere la punta del capillare e controllare l'apertura al microscopio ottico. Verificare che il diametro interno è compreso tra 30 micron a 40 micron.
  3. Inserire un lungo filo Silver 7 cm nel capillare di vetro con circa 1 cm sporgenti dall'estremità non rastremata della pipetta di vetro.
  4. Piegare il filamento eccesso ortogonalmente al capillare di vetro.
  5. Applicare una goccia di adesivo plastica flessibile sull'albero di un ago ipodermico 30 G.
  6. Inserire un ago ipodermico 30 G nella pipetta di vetro secondo gli schemi presentati nella figura 1
  7. Aggiungere un secondo strato di colla per garantire un'adeguata tenuta dalla giunzione tra la pipetta di vetro e l'ago ipodermico.
  8. Lasciare la pipetta asciugare con la punta rivolta verso l'alto per circa 12 ore per garantire il corretto indurimento della colla. Il risultato finale è mostrato in Figura 2.

NOTA: Questa procedura viene eseguita su esperimenti acute e la sterilizzazione del puntale non è necessaria.

2. Preparazione degli animali

  1. Posizionare il topo in una scatola di anestesia.
  2. Indurre l'anestesia con il 4% isoflurano per 5 a 10 min.
  3. Posto l'animale su un tavolo stereotassico con il rilievo di riscaldamento e sonda rettale per mantenere una temperatura corporea di 37 ° C. Utilizzare un cono per mantenere l'anestesia con il 2% isoflurano. Fissare la testa del topo con le orecchie bar e titolare denti.
  4. Applicare unguento oftalmico o collirio, che includono 1% Atropina scende a facilitare la dilatazione della pupilla. Per prevenire la secchezza, applicare goccia lubrificantes circa ogni 30 min.
  5. Shave testa e pulirlo con 10% iodopovidone.
  6. Per anestesia locale, iniettare 0,5 ml di 2% lidocaina sotto il cuoio capelluto in 2-3 posizioni sollevando la pelle ed inserendo la punta dell'ago.
  7. Conferma adeguato livello di anestesia eseguendo un pizzico piedi e osservando la mancanza di movimento. Inoltre, monitorare la frequenza cardiaca per garantire che sia entro valori normali (da 300 a 400 battiti / min).
  8. Incidere il cuoio capelluto in una linea retta lungo la mediana con una lama di 10 # bisturi per esporre entrambe le suture coronale e sagittale.
  9. Rivela i punti di Lambda e Bregma spingendo da parte del tessuto che copre il cranio con una spatola chirurgico.
  10. Livellare il cranio in modo che le posizioni bregma e lambda sono sullo stesso piano.
  11. Per impostare il punto di riferimento, utilizzare un dispositivo stereotassico con un tubo di vetro montato impostarla proprio sopra Bregma. Questo sarà il "zero" antero-posteriore e medcoordina le misure ial-laterali.
  12. Impostare il punto di interesse spostando il stereotassico di montaggio alle coordinate richieste, annotare le coordinate stereotassica e disegnare un quadrato intorno alla zona di destinazione che segna dove verrà eseguita la craniotomia.
  13. Utilizzare un trapano chirurgico con un trapano sterilizzato lungo la piazza marcata lentamente senza pressione per rimuovere lentamente il materiale osseo. Fare attenzione a non forare troppo a lungo nella stessa zona, in quanto la produzione di calore e causare lesioni della corteccia.
  14. Quando l'osso che delimita la craniotomia è diventata sufficientemente sottile, rimuovere con attenzione la sezione del cranio con le pinzette per esporre la corteccia.
  15. Irrigare Spesso la corteccia esposta con liquido cerebro-spinale artificiale per evitare l'essiccamento dei tessuti.
    NOTA: la rimozione mater Dura è inutile per il ratto come la punta di un injectrode è abbastanza robusto da penetrare.

3. Riempimento e montaggio del sistema di iniezione

  1. Riempire il5-10 microlitri microsiringa da aspirazione con olio minerale.
  2. Riempire il ago ipodermico con la pipetta di vetro fissa con una soluzione di 0,5% Chicago Sky Blu (CSB) e acido 300 pM γ-amminobutirrico (GABA), o una soluzione di 2% lidocaina con 0,5% CSB 9. Diluire tutte le soluzioni con soluzione salina.
    1. Nel caso di una sostanza abbondante, riempire con una siringa regolare e utilizzare le usuali tecniche precauzionali per evitare la formazione di bolle d'aria.
    2. Nel caso di sostanze più costose, utilizzare olio minerale per riempire il injectrode e l'agente chimico può quindi essere introdotto tramite aspirazione. Poiché la differenza di densità tra l'olio minerale e l'acqua è relativamente elevata, questa sostanza è un buon candidato per l'iniezione di soluzioni acquose.
      NOTA: Un colorante può essere aggiunto per confermare la separazione tra i due liquidi.
  3. Per riempire la pipetta di iniezione, riempire una siringa da 1 ml con la soluzione per aspirazione e poi iniettare lentamente la soluzionenella pipetta di iniezione.
  4. Prestare attenzione per perdite in regioni indicate in figura 1 con tampone queste aree pulite e osservando perdite iniettando ulteriormente la soluzione lentamente con la siringa.
  5. Rimuovere la siringa da 1 ml. Nel fare così, essere sicuri di mantenere una leggera pressione sullo stantuffo in modo che il vuoto non rimuove la soluzione dalla pipetta iniezione.
  6. Riempire la microsiringa con olio minerale tramite aspirazione e fissarlo saldamente alla pipetta di iniezione riempita, poi pulire attentamente tutta la soluzione in eccesso dalla injectrode assemblato con una garza.
  7. Verificare che la punta non è bloccato iniettando un volume molto piccolo, abbastanza per vedere una piccola goccia formando sulla punta della pipetta di vetro.
  8. Montare il injectrode sul sistema micropompa e assicurarsi che sia ben fissata.
  9. Posizionare accuratamente la punta injectrode alle coordinate di destinazione e abbassare la punta alla superficie della corteccia.
  10. Abbassare lentamente il injectrODE usando l'apparato stereotassico alla struttura di destinazione (collicolo superiore in questo caso) utilizzando gli appositi coordinate anatomiche.
  11. Coprire la corteccia esposta con agar calda per prevenire l'essiccamento dei tessuti.

4. Iniezione e inattivazione reversibile

  1. Impostare la pompa microiniezione di iniettare 400-800 nl a 40 nl / min e premere Esegui per avviare l'iniezione. Si noti che il tasso di picco mostrerà riduzione durante l'iniezione.
    NOTA: Nel setup sperimentale, l'attività neurale recuperato nel giro di un'ora dopo la fine della consegna GABA. Qualsiasi dispositivo meccanico tarato può essere usato per applicare pressione sulla siringa microiniezione per condurre l'iniezione.
  2. Dopo l'acquisizione dei dati elettrofisiologici, eutanasia con un metodo approvato dalla locale Comunità etico degli animali.

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Representative Results

La costruzione del injectrode è illustrato in Figura 1. Un filo d'argento (C) viene alimentato in una pipetta di vetro (D) con la porzione di filo e piegata sporge fuori dall'apertura. Un ago 30 G (B) viene fissato e sigillato all'apertura della pipetta di vetro con colla. Dopo la pipetta è stata riempita con la sostanza di iniezione, una siringa di vetro micro (A) è collegata all'ago. È importante che vi sia una buona tenuta in cui il micro siringa collega con l'ago (E) e dove il filo d'argento sporge dalla pipetta di vetro (F). La Figura 2 mostra una fotografia di ciò che il injectrode assomiglia montaggio avvenuto.

Attività multiunità Visivamente evocata sono stati ottenuti nel collicolo superiore segue un lampo msec 300 ad occhio controlaterale come illustrato nella figura 3. Dopo l'iniezione di GABA, spiking attività in risposta ad uno stimolo istantaneo è stato soppresso. visivamentel'attività dell'unità multipla evocata tipicamente rinviato tra 45 a 60 minuti dopo l'iniezione è cessata.

La figura 4 illustra la configurazione del sistema di microiniezione. Il controller pompa di iniezione consente all'utente di specificare le impostazioni per l'iniezione. Un connettore elettrico molla collega il filo d'argento che sporge dalla pipetta di vetro. Il connettore porta ad uno stadio testa con elettrodi di massa e di riferimento e quindi inserito in un amplificatore. Un convertitore analogico / digitale interfaccia (A / D) viene utilizzato per acquisire i dati elettrofisiologici, e un altoparlante è utilizzato per il monitoraggio audio complementare di attività neuronale.

Figura 1
Figura 1:. Rappresentazione schematica del complesso injectrode Un micro siringa (A) è attaccato alla pipetta di registrazione-iniezione che consistono di un G 30 hago ypodermic (B) aderito a un filo d'argento (C) all'interno di una pipetta di vetro (D). Regioni cerchiato (E - F) aree di luce che potrebbero essere suscettibili di perdite.

Figura 2
Figura 2: Una foto della pipetta costruito usando un ago 30 G (B), la colla adesivo impermeabile (F), un filo d'argento (C) e una pipetta di vetro (D).

Figura 3
Figura 3: Un esempio dell'effetto inibitorio di iniezione del GABA (300 micron) sul evocata visivamente attività multi-unit nel collicolo superiore, frecce indicano il flash esordio. Elettricosegnali al sono filtrati utilizzando un filtro passa-banda impostata fra 30 e 3.000 Hz.

Figura 4
Figura 4: Rappresentazione schematica del sistema di micro-iniezione completa.

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Discussion

Il protocollo proposto è stato progettato per risolvere le sfide poste dagli attuali metodi di inattivazione reversibile. In particolare, questo progetto mira a perfezionare i metodi utilizzati per microiniezioni chimiche delle sostanze che modulano l'attività neurale, in particolare nelle strutture cerebrali profonde. Una sfida tecnica emergente da questo tipo di configurazione è la necessità per entrambe le sonde da colocalized nello stesso spazio ristretto in vivo al fine di derivare registrazioni precise al sito di iniezione. Questo problema può essere superato utilizzando dispositivi, come quello qui presentato, che sono capaci di iniezione e registrazione nello stesso sito. Metodi alternativi includono l'uso di dispositivi a base di impulsi di pressione del gas. Tali strumenti sono stati disponibili per molti anni, ma l'uso di un intermedio comprimibile riduce il controllo sui prezzi e volumi di iniezione, due parametri che sono importanti per controllare per assicurare la reversibilità. Altri metodi come l'iniezione iontoforetico systems sono inoltre disponibili, ma le dinamiche di diffusione del liquido sono diverse rispetto a iniezione in bolo, riducendo il potenziale gamma di inattivazione. Questi metodi hanno il vantaggio di avere un modello di diffusione sferica in contrapposizione al modello ellittica osservato per microiniezioni 7. Quindi, la scelta del metodo di inattivazione deve essere progettato secondo la regione bersaglio e il disegno sperimentale. Anche se esistono alternative commerciali, il protocollo proposto fornisce una maniera conveniente di monitorare il rilascio del principio attivo farmaceutico e consentendo un elevato grado di personalizzazione. Tale libertà nella lavorazione del dispositivo di iniezione favorisce una vasta gamma di flessibilità sperimentale e sintonizzazione per specifici contesti applicativi.

Per quanto riguarda il protocollo proposto, il passaggio fondamentale è il processo di riempimento della pipetta di vetro. Le bolle d'aria devono essere evitati, come la compressione dell'aria renderà il monitoraggio dei iniettatovolumi intrattabili. Una resistenza molto minima dovrebbe essere sentito quando si spinge manualmente liquido attraverso la pipetta, confermando libero flusso nel sistema. L'assenza di liquido con iniezione manuale può indicare una perdita nel sistema o nella preparazione pipetta errato causando una punta ostruito. L'impedenza della pipetta deve essere misurato per ottenere la registrazione elettrofisiologica tipo desiderato (LFP, potenziali evocati, l'attività più unità, etc.), come le punte più grandi formati provocheranno impedenze inferiori.

Se l'iniezione è successo, un volume di 400 a 800 nl della soluzione 300 mM GABA o la soluzione di lidocaina 2% è sufficiente a sopprimere spiking attività. Per avere un'idea della iniezione diffuse nello spazio e nel tempo, agar può essere utilizzato per simulare il tessuto nervoso. La diffusione di iniezione può essere facilmente osservata con una soluzione CSB. Dopo simulazioni, è essenziale per caratterizzare iniezione diffondere istologicamente attraverso l'uso of coloranti come il CSB, di autoradiografia usando le droghe radioattivi o utilizzando approcci metaboliche come autoradiografia glucosio deleghe come indirette per misurare l'attivazione o inattivazione di attività neurale 1.

E 'anche importante notare che le iniezioni veloci (≥100 nl / min) probabilmente porterà a lesioni che fanno piena reversibilità irraggiungibile. Un importante vantaggio del protocollo proposto è il potenziale di integrare il sistema di iniezione con software che retroazione controllare la velocità di iniezione per un set livello di attività neuronale. Tale implementazione consentirebbe ricercatori di concentrarsi sulla inattivazione (o attivazione) parametri piuttosto che su parametri tecnici quali tassi di iniezione o volumi mentre l'erogazione di sola la giusta quantità di farmaco per l'applicazione considerata. Ciò ridurrebbe al minimo spostamento della sonda ottimizzando il volume farmaco necessario, consentire un maggiore controllo time-sensitive del drug delivery, favorire riproducibilità e tuttiow confronto diretto-abbinato dei dati.

Questa tecnica combina un sistema di rilascio del principio attivo e la registrazione di segnali elettrofisiologici. Abbiamo dimostrato la sua efficacia, utilizzando la capacità di registrazione della nostra pipetta per individuare funzionalmente collicolo superiore inducendo i treni di attività multi-unità utilizzando il flash stimoli 11. Durante l'inattivazione, attività multi-unit diminuita e gradualmente recuperato dopo compensato iniezione. Tecniche di inattivazione reversibili, come quello qui presentato, forniscono notevoli vantaggi rispetto lesioni meccaniche o chimiche tecniche che consentono il recupero assente o scarsa 3. Tecniche di inattivazione reversibili rafforzano la significatività statistica degli esperimenti da confronti a coppie sono possibili 3, eliminando così le differenze idiosincratiche. Abbiamo sviluppato una tecnica efficiente e personalizzabile costo che permette un controllo preciso sulla durata del rilascio del principio attivo e il robustoprobing di un'area cerebrale destinazione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Injection pump (UltraMicroPump III) WPI #UMP3
Injection console (Micro4 Controller) WPI #SYS-MICRO4
Hamilton syringe Hamliton (80301) 701LT 10 µL SYR Syringes between 5 and 10 μl used
Flexible plastic adhesive Lepage 393915 The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry.
Glass pipettes WPI #TW100F-4 Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used
720 Needle Pipette Puller Kopf 720
Silver wire A-M Systems, Inc. 782500 Bare 0.010”

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References

  1. Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
  2. Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
  3. Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
  4. Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
  5. Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
  6. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
  7. Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
  8. Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
  9. Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
  10. Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
  11. Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).

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Neuroscienze Numero 101 registrazioni extracellulari lesioni virtuali inattivazione reversibile GABA lidocaina microiniezione
Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore
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Lai, J., Legault, M. A., Thomas, S., More

Lai, J., Legault, M. A., Thomas, S., Casanova, C. Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (101), e52271, doi:10.3791/52271 (2015).

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