Abstract
ここでは、商業的にアクセス可能で、手頃な価格の部品を使用して、単回使用」injectrode」を構築するための方法を説明します。プロービングシステムが影響を受けた神経細胞の集団からの電気生理学的信号を記録しながら、薬剤を注入するのを可能にするように開発されました。この方法は、商業的なソリューションに簡単かつ経済的な代替手段を提供します。ガラスピペットは、皮下注射針と銀のフィラメントと組み合わせることによって変更されました。 injectrodeは、薬物送達のための商業的なマイクロポンプに取り付けられています。これは、薬物送達の部位に由来するマルチユニットの細胞外シグナルを介してリアルタイムの薬力学フィードバックを提供する技術をもたらします。コンセプトの証明として、我々は同時にinjectrodeを介して薬物の送達と、ラットでの光の点滅によって誘発さ上丘からニューロン活動を記録しました。 injectrodeの記録容量は、INJの機能解析を可能にします薬物送達の局在を正確に制御する有利ectionサイト。 injectrodeにロードされた化学物質の選択は、解剖学的実験のためのマーカーを追跡するなど、広大であるように、この方法の適用はまた、これまでここで実証されているものを超えています。
Introduction
皮質領域および皮質下核の不活性化は、様々な脳構造2-4との間の機能の関係を研究する上で重要です。最近の文献は、脳構造2,5の役割を研究するための機能喪失化学的又は極低温技術を採用しています。周囲組織6,7の巻き添え被害を最小限に抑えながら、薬理微量注入に関しては、薬物の少量は、制御された速度で、脳の領域に投与することができます。この技術は、ニューロン活性に異なる薬理学的標的の効果を研究するために、特定のアゴニスト、インバースアゴニストまたはアンタゴニストを送達するために使用することができます。このような効果はまた、研究者が、異なる皮質および皮質下構造の間の関係を研究することができ、遠隔地からの神経応答の変化を測定することによって調べることができます。
ここでは、BOが可能な装置の組立、injectrodeを実証します電気生理学的信号を記録し、目標位置での薬物の少量を送達目。我々は、ラットの上丘では、GABA、神経活動の一般的な阻害剤を注入することによって、このシステムの能力を実証します。この領域は、私たちはinjectrodeの局在を確認するために、視覚的に誘発されたマルチユニット活動の使用を許可視覚刺激に敏感です。不活性化の可逆性は、GABA注射の終了後、通常の神経活動の回復により評価しました。
注射部位からマルチユニット活動を監視する能力は、所望の薬力学的応答を達成するのに必要な注入速度や体積の微調整を可能にします。最小の有効体積が注入されているのでしたがって、この手法の利点は、微小灌流によって引き起こされる組織損傷の制限電位です。提案されたプロトコルは、使い捨てのハードウェアnecessarを生成するためのコスト効率的な方法を提供します薬物送達およびローカルニューロンの活動記録が望まれている実験を行うためのY。
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Protocol
注：すべての手順は、動物の保護とモントリオール大学の倫理審査委員会のためのカナダ評議会の指令に従って行われました。
録音注入ピペットの1アセンブリ
- ピペットプラーを使用して、約7センチのガラスキャピラリー（1ミリメートル外径）を引き出します。
- キャピラリの先端を破壊し、光学顕微鏡下で開口部をチェックします。内径が40〜30μmの間のマイクロメートルであることを確認します。
- ガラスピペットの非テーパ状端から突出した約1cmを有するガラスキャピラリーに7センチメートル長い銀線を挿入します。
- ガラスキャピラリーに直交し、過剰なフィラメントを曲げます。
- 30 G注射針の軸に柔軟なプラスチック接着剤の液滴を適用します。
- 図1に示す回路図に従って、ガラスピペットで30 Gの皮下注射針を挿入します
- ガラスピペットと注射針との間の接合部からの適切なシールを確保するために、接着剤の第二のコーティングを追加します。
- 先端が接着剤の適切な硬化を確実にするために約12時間上に向けて乾燥するピペットを残します。完成した結果を図2に示されています。
注：この手順は、急性実験に行われ、ピペットチップの滅菌が必要とされていません。
2.動物の準備
- 麻酔ボックスにラットを配置します。
- 5〜10分間、4％イソフルランを用いて麻酔を誘導します。
- 37℃の体温を維持するために加熱パッドおよび直腸プローブと定位テーブルの上に動物を配置します。 2％イソフルランで麻酔を維持するためにノーズコーンを使用します。耳のバーや歯ホルダーを使用して、ラットの頭を固定します。
- アトロピンは、瞳孔拡張を支援するために低下1％を含む眼軟膏や点眼薬を適用します。乾燥を防ぐために、ドロップ潤滑適用約30分ごとです。
- 頭を剃る、10％ポビドンヨードを使用してクリーニングします。
- 局所麻酔のために、皮膚を持ち上げ、針の先端を挿入することにより、2-3の場所で頭皮の下で2％リドカインの0.5ミリリットルを注入。
- つま先のピンチを行い、運動の欠如を観察することにより、麻酔の適切なレベルを確認してください。また、それは正常値（300〜400拍/分）の範囲内にあることを確実にするために心拍数を監視します。
- 冠状および矢状縫合の両方を公開するために＃10手術用メスの刃を用いて正中に沿って直線状に頭皮を切開。
- 手術用スパチュラで頭蓋を覆っている組織を脇に押して、ラムダとブレグマ点を明らかにしました。
- ブレグマとラムダ位置は同一平面上にあるように、頭蓋を水平に。
- 基準点を設定するには、右のブレグマの上にそれを設定するために取り付けられたガラス管を定位デバイスを使用しています。これは、前後およびMEDのために "ゼロ"になりますIAL-横測定座標。
- 定位は、必要な座標にマウント定位座標をメモして開頭が行われる場所をマークターゲット領域の周囲に四角形を描画移動させることにより、目的のポイントを設定します。
- ゆっくりと骨材を除去するために圧力をかけずにゆっくりとマークされた正方形に沿って滅菌ドリルで外科用ドリルを使用してください。それは熱を発生し、皮質の病変の原因となるように、同じ地域に長すぎるドリルしないように注意してください。
- 開頭術を区切る骨が十分に薄くなってきた場合には、慎重に皮質を露出するようにピンセットで頭蓋セクションを削除。
- よく組織乾燥を防止するために、人工脳脊髄液で露光野を灌漑。
注：injectrodeの先端が貫通するのに十分頑丈であるように硬膜除去はラットに不必要です。
3.充填と噴射システムのマウント
- 塗りつぶし鉱物油との吸引により、5〜10μlをマイクロシリンジ。
- 0.5％シカゴスカイブルー（CSB）および300μMのγアミノ酪酸（GABA）または0.5％CSB 9で2％リドカイン溶液の溶液で固定したガラスピペットを用いて皮下注射針を埋めます。生理食塩水ですべてのソリューションを希釈します。
- 豊富な物質の場合には、定期的な注射器を用いて充填し、気泡の形成を避けるために、通常の予防的技術を使用します。
- より高価な物質の場合には、injectrodeを埋めるためにミネラルオイルを使用し、化学薬品は、次いで、吸引により導入することができます。鉱物油と水との間の密度差が比較的高いように、この物質は、水溶液の注入のための良好な候補です。
注：染料の両方の液体との間の分離を確認するために加えることができます。
- 注射ピペットを充填するために、吸引によって液で1mlシリンジを充填した後、ゆっくり溶液を注入注入ピペットに。
- クリーンこれらの領域を拭き取り、さらに注射器でゆっくり溶液を注入することによって漏れを観察することによって、図1に示した領域で漏れの細心の注意を払ってください。
- 1mlシリンジを取り外します。その際、真空注入用ピペットから溶液を除去しないように、プランジャーに光の圧力を保つようにしてください。
- 吸引によりミネラルオイルとマイクロシリンジを記入し、充填された注入ピペットにしっかりとそれを添付し、慎重にガーゼで組み立てinjectrodeから余分な溶液を乾いた布で拭き取ってください。
- 先端がガラスピペットの先端に形成小滴を参照するのに十分な非常に小さな体積を注入することによってブロックされていないことを確認します。
- マイクロポンプシステムのinjectrodeをマウントし、それが十分に固定されていることを確認してください。
- 慎重に目標座標でinjectrodeチップを配置し、皮質の表面に先端を下げます。
- ゆっくりinjectrを下げます適切な解剖学的座標を用いて、ターゲット構造（ここでは上丘）への定位固定装置を使用して頌歌。
- 組織乾燥を防ぐために、温かい寒天で露光野をカバーしています。
4.インジェクションと可逆的不活性化
- 注入を開始するには40 NL / minであり、プレスランで400〜800 NLを注入するマイクロインジェクションポンプを設定します。そのスパイク率は注入中削減が表示されます注意してください。
注：実験では、神経活動は、GABAの配信の終了後1時間以内に回復しました。任意に較正機械装置は、注入を行うためにマイクロインジェクションシリンジに圧力を適用するために使用することができます。 - 電気生理学的データを取得した後、地元の動物倫理コミュニティに承認方法を使用して安楽死させます。
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Representative Results
injectrodeの構造は、ワイヤの屈曲部とガラスピペット（D）に供給され、開口部から突出している図1の銀線（C）に示されています。 30 G針（B）が取り付けられ、接着剤でガラスピペットの開口部に封止されています。ピペット注入物質で充填された後に、ガラスマイクロシリンジ（A）は、針に取り付けられています。これは、マイクロシリンジは針（E）に接続し、銀線がガラスピペット（F）から突出するところ良好なシールが存在することが重要である。 図2は injectrodeは組み立てが完了した後にどのように見えるかの写真を示します。
視覚的に誘発されたマルチユニット活動は、図3に示すように、反対側の眼に300ミリ秒以下のフラッシュ上丘で得られた。GABAの注入時には、抑制されたフラッシュ刺激に応答して活動をスパイク。視覚的に注入が終わった後に、通常、45〜60分の間、返さマルチユニット活動を誘発。
図4は、マイクロインジェクションシステムのセットアップを示しています。噴射ポンプの制御装置は、ユーザが注射のための設定を指定することができます。春の電気コネクタは、ガラスピペットから突出する銀線を接続します。コネクタは、接地電極と参照電極とヘッドステージに導き、その後、アンプにプラグイン。アナログ/デジタル（A / D）インターフェースは、電気生理学的データを取得するために使用され、スピーカは、ニューロンの活動の補完的なオーディオ·モニタリングのために使用されます。
図1：injectrodeアセンブリの概略マイクロシリンジ（A）は、30 G、Hから成る記録注入ピペットに取り付けられています。ガラスピペット（D）内部の銀線（C）に接着ypodermic針（B）。漏れの影響を受ける可能性があるハイライト領域-領域は、（F E）を丸で囲みました。
図2：30 G針（B）、防水接着剤接着剤（F）、銀線（C）とガラスピペット（D）を用いて構築し、ピペットの写真。
図3：上丘における視覚誘発マルチユニット活動のGABA（300μM）の注入の抑制効果の図は、矢印は、フラッシュ開始を示しています 。電動アル信号30及び3,000ヘルツの間で設定バンドパスフィルターを用いて濾過しました。
図4：完全なマイクロインジェクションシステムの概略図。
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Discussion
提案されたプロトコルは、現在の可逆的不活性化の方法から生じる課題を解決するために設計されました。具体的には、このプロジェクトは、特に脳深部構造において、神経活動を調節する物質の化学的微量注入のために使用される方法を改良することを目的と。セットアップのこのタイプから出る技術的課題は、注射部位での正確な記録を得るために、in vivoで同じ限られた空間内に共局在化する両方のプローブを必要とすることです。この問題は、同じ部位に注射し、記録の両方が可能であるような、ここで提示されている1つのような装置を使用することによって克服することができます。別の方法は、ガス圧力パルスに基づく装置の使用を含みます。このようなツールは、長年にわたって利用されているが、圧縮可能な中間体の使用は、注入速度とボリューム、可逆性を保証するために制御することが重要な2つのパラメータの制御を減少させます。このようなイオン導入注入のような他の方法ystemsも利用可能であるが、液体の拡散ダイナミクスは不活性化の電位範囲を減少させる、ボーラス注入対異なります。これらの方法は、マイクロ注射7について観察された楕円形のパターンとは対照的に球状の拡散パターンを有するという利点を有します。従って、不活性化方法の選択は、標的領域と実験計画に従って計画する必要があります。商用の選択肢が存在するにもかかわらず、提案されたプロトコルは、医薬物質の送達を監視するだけでなく、高度なカスタマイズを可能にするコスト効率的な方法を提供します。噴射装置のクラフトでこのような自由度は、特定のアプリケーション·コンテキストのための実験の柔軟性とチューニングの大規模な範囲に有利です。
提案されたプロトコルに関しては、重要なステップは、ガラスピペットを充填する方法です。圧縮空気が注入の監視をレンダリングするように気泡を避けるべきです難治ボリューム。手動でシステム内の自由な流れを確認し、ピペットを介して液体を押すと非常に最小の抵抗も感じられるべきです。手動注入の液体が存在しないことは、システムまたは閉塞先端をもたらす誤ったピペットの準備に漏れている可能性があります。ピペットのインピーダンスは、所望のタイプの電気生理学的記録を得るために測定されるべき低いインピーダンスになり、より大きなチップサイズとして、（LFPを、電位、マルチユニット活動などを誘発）。
注入が成功した場合、400〜800 300μMGABA溶液NLまたは2％リドカイン溶液の量は、活動をスパイク廃止するのに十分です。空間と時間に噴射拡散の考えを持っているために、寒天は神経組織をシミュレートするために使用することができます。注射の広がりは、簡単にCSB溶液で観察することができます。シミュレーション後、Oの使用を介して組織学的に広がる噴射を特徴付けるために不可欠です放射性標識薬剤を使用して、オートラジオグラフィーによって、または神経活動1の活性化または不活性化を測定するための間接的なプロキシとして、グルコースのオートラジオグラフィーのような代謝のアプローチを使用することによって、このようなCSBのようなF染料、。
これは、高速注射（≥100NL /分）はおそらく完全な可逆性は達成不可能作る病変をもたらすことに注意することも重要です。提案されたプロトコルの主な利点は、セット神経活動レベルに対する注入速度をフィードバック制御することになるソフトウェアと噴射システムを統合する可能性です。このような実装では、研究者はパラメータの不活性化（または活性化）ではなく、考えたアプリケーションのための薬物の唯一の適切な量を提供しながら、このような注入速度やボリュームなどの技術的なパラメータに集中できるようになります。これは、薬物送達のより多くの時間に敏感な制御を可能に必要な薬剤の量を最適化することにより、プローブの変位を最小限に再現し、すべてを好むだろうデータのOWダイレクト一対比較。
この技術は、電気生理学的信号の物質送達及び記録するためのシステムを組み合わせたものです。私たちは11を刺激機能フラッシュを使用したマルチユニット活動の列車を誘導することにより、上丘を見つけるために私たちのピペットの記録容量が使用してその有効性を実証しました。不活性化の間に、マルチユニットの活性が減少し、徐々に注入オフセット後に回収します。このような、ここで提示されている1つのような可逆的不活性化技術は、存在しないか、または不良な回復3を提供する機械的または化学的病変の技術を超えるかなりの利点を提供します。一対比較は3可能であるため、可逆的不活性化技術は、それによって特異な違いを排除し、実験の統計的有意性を強化します。私たちは、物質送達と堅固なの持続時間を正確に制御することができ、コスト効率的でカスタマイズ可能な技術を開発しましたターゲット脳領域のプロービング。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
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