Samtidig elektrofysiologiska inspelning och Micro-injektioner av hämmande medel i Gnagare Brain

Abstract

Här beskriver vi en metod för konstruktion av en engångsbruk "injectrode" med användning av kommersiellt tillgängliga och billiga delar. En sondering Systemet utvecklades som tillåter injektion av ett läkemedel under inspelning elektrofysiologiska signaler från den drabbade neuronala befolkningen. Denna metod ger ett enkelt och ekonomiskt alternativ till kommersiella lösningar. En glaspipett modifierades genom att kombinera den med en hypodermisk nål och en silverfilament. Den injectrode är kopplad till kommersiella mikropump för drug delivery. Detta resulterar i en teknik som tillhandahåller realtid farmakodynamik feedback genom flera enheter extracellulära signaler, som härrör från platsen för läkemedelstillförsel. Som ett proof of concept, spelade vi nervaktivitet från den överlägsna colliculi som framkallas av ljusblixtar i råttor, samtidigt med leverans av läkemedel genom injectrode. Den injectrode inspelningskapacitet tillåter den funktionella karakteriseringen av injektion webbplats gynnar exakt kontroll över lokalisering av läkemedelsavgivning. Tillämpning av denna metod sträcker sig även långt utöver vad som visats här, eftersom valet av kemiskt ämne laddas i injectrode är stora, inklusive spåra markörer för anatomiska experiment.

Introduction

Den inaktivering av kortikala områden och subkortikala kärnor är viktigt i studien av funktionella relationer mellan olika hjärnstrukturer ^2-4. Senaste litteraturen har sysselsatt förlust av funktions kemiska eller kryogena tekniker för att studera betydelsen av hjärnstrukturer ^2,5. Med avseende på farmakologiska microinjections, kan små volymer av läkemedel administreras i en hjärnregion med en kontrollerad hastighet samtidigt minimera den indirekta skadan på omgivande vävnad ^6,7. Denna teknik kan användas för att avge specifika agonister, omvända agonister eller antagonister för att studera effekten av olika farmakologiska mål för neuronal aktivitet. Sådana effekter kan också studeras genom att mäta förändringar i neuronala svar från avlägsna platser, där forskarna att studera sambanden mellan olika kortikala och subkortikala strukturer.

Här visar vi monteringen av en anordning, den injectrode, med förmåga att på both inspelning elektrofysiologiska signaler och leverera små mängder narkotika vid målplatsen. Vi visar funktionerna i systemet genom att injicera GABA, en gemensam hämmare av neuronal aktivitet i råtta överlägsna colliculi. Denna region är känslig för visuell stimulans, som tillät oss att använda visuellt framkallade storförpackning aktivitet för att bekräfta injectrode lokalisering. Den reversibilitet inaktive bedömdes genom återvinning av normala nervaktivitet efter utgången av GABA injektion.

Förmågan att övervaka flera enheter aktivitet från injektionsstället tillåter finjustering av injektionstakt och volymer som behövs för att uppnå den önskade farmakodynamiska svaret. Därför är en fördel med denna teknik potential begränsande av vävnadsskada orsakad av mikroperfusionskammaren, eftersom de minsta effektiva volymer injiceras. Den föreslagna protokollet ger en kostnadseffektiv metod för att generera engångs hårdvara Necessäry för ledande experiment där drug delivery och lokal nervaktivitet inspelning önskas.

Protocol

OBS: Alla förfaranden genomfördes i enlighet med direktiven i den kanadensiska rådet för skydd av djur och etikprövningsnämnden i Université de Montréal.

1. Montering av Recording-injektionspipetten

1. Dra en ca 7 cm lång glaskapillär (1 mm ytterdiameter) under användning av en pipett avdragare.
2. Bryt spetsen på kapillären och kontrollera öppningen under ett ljusmikroskop. Kontrollera att innerdiametern är mellan 30 | j, m till 40 | im.
3. Sätt i ett 7 cm långt silvertråd i glaset kapillär med ca 1 cm som skjuter ut från den icke-avsmalnande änden av glaspipett.
4. Böj överskottet tråden vinkelrätt mot glaset kapillär.
5. Applicera en droppe av flexibel plast adhesiv på axeln till en 30 G injektionsnål.
6. Sätt i en 30 G injektionsnål i glaspipett enligt schemat som presenteras i Figur 1
7. Lägg till en andra beläggning av lim för att säkerställa en korrekt tätning från förbindelsen mellan glaspipett och injektionsnålen.
8. Låt pipetten torka med spetsen riktad uppåt i ca 12 h för att säkerställa korrekt härdning av limmet. Det färdiga resultatet visas i Figur 2.

OBS: Detta förfarande görs på akuta experiment och sterilisering av pipettspetsen är inte nödvändig.

2. Animal Förberedelse

1. Placera råttan i en anestesilåda.
2. Inducera anestesi med användning av 4% isofluran under 5 till 10 min.
3. Placera djuret på en stereotaxisk bord med värmedyna och rektal sond för att upprätthålla en kroppstemperatur på 37 ° C. Använd en noskon att upprätthålla anestesi med 2% isofluran. Säkra råttans huvudet med örat barer och tänder hållare.
4. Applicera oftalmologiska salva eller ögondroppar, som omfattar 1% Atropin droppar för att underlätta elev utvidgning. För att förhindra torrhet, applicera smörj droppes ungefär var 30 min.
5. Raka huvudet och rengör den med 10% povidon-jod.
6. För lokal anestesi, injicera 0,5 ml av 2% lidokain under hårbotten i 2-3 platser genom att lyfta upp huden och sticka in spetsen av nålen.
7. Bekräfta tillräcklig bedövning genom att utföra en tå nypa och observera avsaknaden av rörelser. Dessutom övervakar hjärtfrekvensen för att säkerställa att den ligger inom normala värden (300 till 400 slag / min).
8. Incise hårbotten i en rak linje längs medianen med en # 10 skalpellblad för att exponera både de koronala och sagittala suturer.
9. Avslöja Lambda och Bregma poäng genom att trycka undan den vävnad som täcker kraniet med en kirurgisk spatel.
10. Nivå kraniet så att Bregma och Lambda positioner på samma plan.
11. För att ställa in referenspunkten, använder en stereotaktisk anordning med en monterad glasrör att ställa in den precis ovanför Bregma. Detta kommer att vara "noll" för antero-posterior och Medial-laterala mätningar koordinater.
12. Ange plats av intresse genom att flytta stereotaktisk montera de nödvändiga koordinaterna, notera stereotaktiska koordinaterna och rita en fyrkant runt målområdet som markerar var kraniotomi kommer att utföras.
13. Använd en kirurgisk borr med en steriliserad borr längs den markerade torget långsamt utan tryck för att sakta ut benmaterial. Var noga med att inte borra för länge i samma område, eftersom det kommer att producera värme och orsaka skador på hjärnbarken.
14. När benet som avgränsar kraniotomi har blivit tillräckligt tunn, försiktigt bort hjärn avsnittet med pincett för att exponera cortex.
15. Ofta vattna den exponerade cortex med artificiell cerebrospinalvätska att förhindra vävnads uttorkning.
    OBS: Dura mater avlägsnande är onödigt på råtta som spets injectrode är robust nog för att tränga igenom.

3. Fyllning och montering av insprutningssystemet

1. Fyll5-10 ul mikro genom aspiration med mineralolja.
2. Fyll kanylen med den fasta glaspipett med en lösning av 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) och 300 | iM γ-aminosmörsyra (GABA) eller en lösning av 2% lidokain med 0,5% CSB ^9. Späd alla lösningar med saltlösning.
   1. I fallet med en riklig ämne, fyll på med en vanlig spruta och använda de vanliga försiktighetsåtgärder tekniker för att undvika bildandet av luftbubblor.
   2. I fallet med mer dyrbara substanser, använd mineralolja för att fylla injectrode och det kemiska medlet kan sedan införas genom aspiration. Eftersom skillnaden i densitet mellan mineralolja och vatten är relativt hög, är denna substans en god kandidat för insprutning av vattenlösningar.
      OBS: Ett färgämne kan tillsättas för att bekräfta separationen mellan de båda vätskorna.
3. För att fylla injektionspipetten, fylla en 1 ml spruta med lösningen genom aspiration och sedan långsamt injicera lösningenin i injektionspipetten.
4. Var uppmärksam för läckor i regioner som anges i figur 1 genom att badda dessa områden rena och observera läckage av ytterligare injicera lösningen långsamt med sprutan.
5. Ta 1 ml sprutan. När du gör det, se till att hålla ett lätt tryck på kolven så att vakuumet inte bort lösningen från injektionspipetten.
6. Fyll mikro med mineralolja genom aspiration och fäst det ordentligt den fyllda injektionspipetten, torka sedan försiktigt bort eventuellt överskott av lösning från den monterade injectrode med gasbinda.
7. Verifiera att spetsen inte är blockerad av insprutning av en mycket liten volym, tillräckligt för att visa en liten droppbildnings vid spetsen av glaspipett.
8. Montera injectrode på mikrosystemet och se till att den är väl fast.
9. Sätt försiktigt injectrode spets vid målgrupp koordinaterna och sänk spetsen till ytan av cortex.
10. Långsamt sänka injectrode använda stereotaxic apparater till målstrukturen (superior coUiculus i detta fall) med användning av lämpliga anatomiska koordinater.
11. Täck den exponerade cortex med varm agar för att förhindra vävnads uttorkning.

4. Injektion och reversibel inaktive

1. Ställ mikroinjektion pumpen att injicera 400 till 800 nl vid 40 nl / min och tryck på Kör för att starta injektionen. Observera att spik hastighet visar minskning under injektionen.
   OBS: I experimentuppställning, återvunna neural aktivitet inom en timme efter slutet av GABA leverans. Alla kalibrerad mekanisk anordning kan användas för att utöva påtryckningar på mikroinjektion spruta för att utföra injektionen.
2. Efter förvärvet av elektrofysiologiska data avliva med hjälp av en metod som godkänts av den lokala Animal Ethics gemenskapen.

Representative Results

Konstruktionen av injectrode illustreras i Figur 1. En silvertråd (C) matas in i en glaspipett (D) med en del av tråden böjs och skjuter ut från öppningen. En 30 G-nål (B) är fäst och tätad mot öppning av glaspipett med lim. Efter det att pipetten har fyllts med injektionssubstansen, är en glasmikrospruta (A) som är fäst vid nålen. Det är viktigt att det finns en bra tätning där mikrospruta ansluter med nålen (E) och där silvertråden sticker ut från glaspipett (F). Fig 2 visar ett fotografi av vad injectrode ser ut efter avslutad montering.

Visuellt framkallade storförpackning aktivitet erhölls i superior coUiculus efter en 300 msek flash till det kontralaterala ögat såsom visas i fig 3. Efter injektionen av GABA, spiking aktivitet som svar på en flash stimulans undertrycktes. visuelltframkallade storförpackning aktivitet vanligtvis tillbaka mellan 45 till 60 minuter efter injektion har upphört.

Figur 4 visar installationen av mikroinjektion systemet. Injektionspumpstyrning gör det möjligt för användaren att ange inställningar för injektion. En fjäder elektriskt anslutningsdon förbinder silvertråd som sticker ut från glaspipett. Kontakten leder till en huvudet scenen med mark- och referenselektroderna och sedan ansluts till en förstärkare. En analog / digital (A / D) gränssnitt används för att förvärva elektrofysiologiska data och en högtalare används för kompletterande ljud övervakning av nervaktivitet.

Figur 1:. Schematisk representation av injectrode aggregatet A mikrospruta (A) är fäst vid inspelningen-injektionspipetten som består av en 30 G Hypodermic nål (B) vidhäftad till en silvertråd (C) inuti en glaspipett (D). Regioner cirklade (E - F) belysa områden som kan vara känsliga för läckage.

Figur 2: Ett foto av den konstruerade pipetten med hjälp av en 30 G-nål (B), vattenfast lim lim (F), en silvertråd (C) och en glaspipett (D).

Figur 3: En illustration av den hämmande effekten av injektionen av GABA (300 pM) på visuellt framkallat flerenhetsaktiviteten i den överlägsna colliculi, Pilarna indikerar blixt debut. Elektriskal-signaler filtrerades med användning av ett bandpassfilter inställt mellan 30 och 3000 Hz.

Figur 4: Schematisk representation av den kompletta mikroinjektionssystem.

Discussion

Den föreslagna protokollet har utformats för att lösa de utmaningar som uppstår från den löpande reversibla inaktiveringsmetoder. Specifikt detta projekt som syftar till att förfina de metoder som används för kemiska microinjections av ämnen som modulerar neural aktivitet, särskilt i djupa hjärnstrukturer. En teknisk utmaning som kommer ut från den här typen av inställning är behovet av båda sonderna skall samlokaliserades i samma begränsade utrymmet in vivo för att få fram exakta inspelningar vid injektionsstället. Denna fråga kan lösas genom att använda anordningar, såsom den som presenteras här, som är i stånd att både injektion och inspelning på samma ställe. Alternativa metoder innefattar användning av enheter baserade på gastryckspulser. Sådana verktyg har funnits i många år, men användningen av ett komprimermellan minskar kontrollen över injektionstakt och volymer, två parametrar som är viktiga för att kontrollera att försäkra reversibilitet. Andra metoder såsom jontoforetisk injektion systems finns också, men de diffusion dynamiken i vätskan är olika kontra bolusinjektion, vilket minskar den potentiella intervallet inaktivering. Dessa metoder har fördelen av att ha en sfärisk spridningsbild i motsats till den elliptiskt mönster observeras för mikroinjektioner ^7. Därför bör valet av inaktiveringsmetod planeras efter målregionen och den experimentella utformningen. Även om kommersiella alternativ finns, ger det föreslagna protokollet ett kostnadseffektivt sätt att övervaka läkemedelssubstansen leverans samt möjliggör en hög grad av kundanpassning. En sådan frihet i crafting av injektionsanordningen gynnar ett stort utbud av experimentella flexibilitet och trimchip till specifika tillämpningssammanhang.

När det gäller det föreslagna protokollet, är det kritiska steget i processen att fylla glaspipett. Luftbubblor bör undvikas, eftersom luftkompressions kommer att göra övervakning av injiceratvolymer intractable. En mycket minimalt motstånd bör också kännas när manuellt trycka vätska genom pipetten, vilket bekräftar fritt flöde i systemet. En avsaknad av vätska med manuell injektion kan tyda på en läcka i systemet eller felaktig pipett beredning resulterar i en blockerad spets. Impedans pipetten bör också mätas för att erhålla önskad typ elektrofysiologiska inspelning (LFP, framkallade potentialer, multi-enhetens verksamhet, etc.), som större tips storlekar kommer att resultera i lägre impedans.

Om injektionen lyckas, är en volym av 400 till 800 nl av 300 iM GABA lösning eller lidokainlösning 2% tillräckligt för att avskaffa tillsatta aktivitet. Att ha en uppfattning om injektionen sprids i tid och rum, kan agar användas för att simulera nervvävnad. Spridningen av injektionen kan sedan lätt observeras med ett CSB-lösning. Efter simuleringar, är det viktigt att karakterisera injektion sprids histologiskt genom användning of färgämnen såsom CSB, med autoradiografi med användning av radiomärkta läkemedel eller genom att använda metaboliska metoder såsom glukos autoradiografi som indirekta fullmakter att mäta aktivering eller inaktivering av nervaktivitet ^1.

Det är också viktigt att notera att snabba injektioner (≥100 nl / min) kommer sannolikt att resultera i skador genom att till fullo reversibilitet ouppnåeligt. En stor fördel med det föreslagna protokollet är potentialen att integrera insprutningssystemet med programvara som skulle återkopplings styra insprutningshastigheten för en uppsättning neuronal aktivitetsnivå. En sådan tillämpning skulle göra det möjligt för forskare att fokusera på inaktive (eller aktivering) parametrar snarare än på tekniska parametrar såsom injektionstakt eller volymer samtidigt som den levererar bara rätt mängd läkemedel för den aktuella applikationen. Detta skulle minimera sökarförflyttning genom att optimera den erforderliga läkemedelsvolym, möjliggöra mer tidskänsliga kontroll av läkemedelstillförsel, gynnar reproducerbarhet och allaow direkt parad jämförelse av data.

Denna teknik kombinerar ett system för ämne leverans och registrering av elektrofysiologiska signaler. Vi visat sin effektivitet genom att använda inspelningskapacitet vår pipett att funktionellt lokalisera den överlägsna colliculi genom att inducera tåg av flera enheter aktivitet med blixt stimuli ^11. Under inaktive, multi-enhetens verksamhet minskat och så småningom återhämtat sig efter injektionen offset. Växelinaktive tekniker, såsom den som presenteras här, ger betydande fördelar jämfört med mekaniska eller kemiska lesioner tekniker som ger frånvarande eller dålig återhämtning ^3. Växelinaktive tekniker förstärka statistisk signifikans experiment sedan parade jämförelser är möjliga ^3, och därmed eliminera idiosynkratiska skillnader. Vi har utvecklat en kostnadseffektiv och anpassningsbar teknik som ger exakt kontroll över hur länge ämnet leverans och robustsondering av ett mål cerebral område.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection pump (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Injection console (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Hamilton syringe	Hamliton	(80301) 701LT 10 µL SYR	Syringes between 5 and 10 μl used
Flexible plastic adhesive	Lepage	393915	The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry.
Glass pipettes	WPI	#TW100F-4	Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used
720 Needle Pipette Puller	Kopf	720
Silver wire	A-M Systems, Inc.	782500	Bare 0.010”