Summary
De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.
Abstract
Giant Unilamellaire Vesicles (GUVs) zijn een populaire biomimetic voor het bestuderen membraan samenhangende verschijnselen. Echter, vaak gebruikte protocollen groeien GUVs, dient te GUVs houdende functionele transmembraan proteïnen worden gemodificeerd. Dit artikel beschrijft twee dehydratatie-rehydratatie methoden - electroformation en gel bijgestaan zwelling - naar GUVs met de voltage-gated kalium kanaal, KvAP vormen. In beide werkwijzen wordt een oplossing van eiwithoudende unilamellaire vesicles gedeeltelijk gedehydrateerd om een stapel membranen, die vervolgens wordt zwellen in een rehydratatie buffer te vormen. Voor de electroformation werkwijze wordt de film afgezet op platinaelektroden zodat een wisselveld in tijdens rehydratatie kunnen worden toegepast. Daarentegen gebruikt de gel ondersteunde zwelling werkwijze een agarosegel substraat film rehydratatie verbeteren. Beide methoden kunnen GUVs in lage (bijvoorbeeld 5 mM) en fysiologische (bv, 100 mM) zoutconcentraties produceren. De resulterende GUVs gekenmerkt door fluorescentie microscopie, en de functie van gereconstitueerde kanalen gemeten met de inside-out patch-clamp configuratie. Terwijl zwelling in aanwezigheid van een wisselend elektrisch veld (electroformation) geeft een hoge opbrengst van foutloze GUVs, produceert de gel ondersteunde zwelling werkwijze een homogeen eiwit verdeling en vereist geen speciale apparatuur.
Introduction
Bij het bestuderen van de fysische principes die levende systemen regeren, bottom-up aanpak kan een experimentator om systeem samenstelling en andere parameters die niet gemakkelijk worden gemanipuleerd in cel-gebaseerde systemen 1 beheersen. Bij membraan processen, Giant Unilamellaire Vesicles (GUVs, diameter ~ 1-100 um) hebben bewezen een zeer nuttige biomimetische systeem 2-7 als ze goed geschikt voor microscopie studies en micromanipulatie 8-10. Hoewel er veel verschillende protocollen om GUVs produceren, de meeste vallen in twee categorieën - emulsie gebaseerde benaderingen 11,12 en technieken gebaseerd op rehydrating een lipide film 13-16. In-emulsie gebaseerde methoden, worden de binnenste en buitenste blaadjes van de GUV membranen samengesteld sequentieel uit lipide monolagen aan water / olie-interfaces. Deze benadering is geschikt voor het inkapselen van oplosbare eiwitten metin de GUVs en voor het vormen GUVs asymmetrische bijsluiter lipidensamenstelling. Echter, GUVs gevormd uit emulsies sporen oplosmiddel dat het membraan de mechanische eigenschappen 17 wijzigen behouden, en de benadering is bijzonder goed geschikt voor trans- membraaneiwit reconstitutie.
Film rehydratatie werkwijzen gebaseerd op het feit dat (dehydratatie) veroorzaakt veel lipidemengsels een multilamellaire stapel membranen. Indien stapel vervolgens in contact gebracht met een waterige buffer, zal membranen in de stapel uit elkaar solventstromen tussen hen en aan het oppervlak van de stapel te verplaatsen, kunnen afzonderlijke membranen los te GUVs 13,18 (ook een ware dierentuin van vormen andere lipidische objecten). Zelfs voor optimale buffer en lipidesamenstellingen Deze klassieke "spontane zwelling" werkwijze een relatief lage opbrengst van foutvrije GUVs. Een veel gebruikte methode om de opbrengst van foutvrije GUVs boost is "electroformation221 ;, waarin een wisselstroom veld (AC) wordt toegepast tijdens folie rehydratatie. Hoewel het mechanisme blijft slecht begrepen, "electroformation" kan spectaculair GUV opbrengsten geven (> 90% in gunstige omstandigheden) voor lage zoutconcentratie buffers (<5 mM) 14,19, en kan zelfs werken in fysiologische buffers (-100 mM) met een hogere frequentie (500 Hz versus 10 Hz) wisselveld en platina elektroden 15. Een alternatieve benadering om de opbrengst van foutvrije GUVs boost "gel ondersteunde zwelling", waarbij de lipide oplossing afgezet op een polymeer gel substraat plaats van passief (bijvoorbeeld glas, PTFE) materialen in klassieke "spontane zwelling ". Wanneer de resulterende lipide / gel film wordt gerehydrateerd kan GUVs snel vormen zelfs fysiologische buffers 16,20.
Al deze methoden kunnen alleen lipide GUVs die kan worden gebruikt om membraangebonden fenomenen zoals de studie producereninteractie tussen oplosbare eiwitten en membranen. Echter, een transmembraan eiwit in GUVs nemen, zijn belangrijke wijzigingen nodig om te verzekeren dat het eiwit blijft in een functionele toestand gedurende de reconstitutie procedure. Hoewel oplossingen van lipiden in organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld chloroform, cyclohexaan) zijn ideaal voor de productie lipidefilms, trans-membraaneiwitten zijn meestal alleen stabiel wanneer hun hydrofobe transmembraan domein is ingebed in een lipide bilaag, of omgeven door een detergent micel ( bijvoorbeeld gedurende eiwitzuivering). Aldus, het uitgangsmateriaal voor reconstitutie typisch natief membranen, gezuiverd eiwit in een reinigingsmiddel of kleine unilamellaire proteïne bevattende vesicles (proteo-SUV's) en / of multilamellaire vesicles (proteo-MLVs) gevormd door detergensverwijdering in de aanwezigheid van lipiden. De meeste methoden om deze membraaneiwitten te nemen in GUVs vallen in drie categorieën.
Direct insertion: Trans-membraaneiwit gesuspendeerd in detergens gemengd met voorgevormde, lipide only, mild detergens gesolubiliseerde GUVs en het detergens verwijderd middels biobeads 21. Terwijl conceptueel eenvoudige Deze werkwijze vereist een nauwkeurige regeling van de detergens concentratie zoals te hoge detergensconcentratie de GUVs terwijl een te lage concentratie kan het eiwit ontvouwen of aggregaat kan oplossen.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Eiwit in proteo-SUV's wordt gecombineerd met voorgevormde, lipide-only GUVs en fusie wordt vergemakkelijkt met speciale fusogene peptiden 22 of wasmiddel 21. Typisch de omvang van de fusie is beperkt leidt tot GUVs met een laag eiwit dichtheid.
Uitdroging / Rehydratatie: A-eiwit bevatten lipide film wordt gevormd door gedeeltelijke dehydratatie van een proteo-SUV (of proteo-MLV) oplossing en GUVs worden vervolgens gekweekt als voor een zuivere lipide film. De zichtbare uitdaging is om het eiwit te beschermen tijdens de gedeeltelijke dehydratiin stap 23, maar de werkwijze is met succes gebruikt om trans-membraaneiwitten zoals bacterio, calcium-ATPase, integrine en VDAC reconstitueren in GUVs 7,23 - 25.
Dit artikel beschrijft dehydratatie / rehydratie protocollen GUVs met het voltage-gated kalium kanaal, KvAP van de hyper-thermofiele archaea, Aeropyrum pernix maken. KvAP een hoge mate van homologie met eukaryote spanningsafhankelijke kaliumkanalen 26 en een bekende kristalstructuur 27 , waardoor het een goed model voor het bestuderen van het mechanisme van spanning gating. De productie van de proteo-SUV is eerder in detail beschreven en is geen onderdeel van deze tutorial 26,28,29. Belangrijk hoeft KvAP proteo-SUV niet te worden geproduceerd voor elke GUV bereiding, aangezien ze kunnen worden opgeslagen in kleine (bijvoorbeeld 10 pi) bij -80 ° C gedurende langere tijd (> 1 jaar). Electroformationof-gel ondersteunde zwelling kan vervolgens worden gebruikt om GUVs groeien van de KvAP proteo-SUV (of proteo-MLVs).
De belangrijkste stappen voor de electroformation protocol worden geïllustreerd in figuur 1. Druppeltjes van een oplossing van SUV die het eiwit wordt afgezet op platina draden (zie figuur 2). Gedeeltelijke dehydratatie van de SUV schorsing leidt tot de vorming van een lipide eiwit film door de fusie van SUV's. Tijdens rehydratatie wordt een wisselveld op de elektroden aan de lipide lagen helpen delamineren en vorm GUVs. Een veld 10 Hz werkt goed bij het gebruik van "zoutarm" (<5 mM) rehydratatie buffer 28 en GUVs enkele uren duren om te groeien. In tegenstelling, fysiologische buffers (met ~ 100 mM zout) goed te werken met een lagere spanning, 500 Hz AC veld, maar vereisen een langdurige (~ 12 uur) zwelling periode 15. Deze methode is gebaseerd op een eerder protocol met ITO dia 24, maar gebruikt een aangepaste kamer containing twee platina draden, zoals weergegeven in figuur 2 (zie de bespreking voor details in het design en suggesties voor eenvoudigere, geïmproviseerde kamers).
Figuur 3 illustreert de gel ondersteunde zwelling methode. Het protocol werkt goed met buffers met fysiologisch zout concentraties, is een snelle en produceert GUVs met een meer homogene eiwit distributie. Echter, de opbrengst van geïsoleerde, blijkbaar defect-vrije GUVs (dat wil zeggen, de GUV membraan uniform is bij optische lengte-schalen en geen objecten omsluiten) is lager, maar het zorgt voor een voldoende aantal voor patch-clamp en micro-manipulatie experimenten . Deze methode is gebaseerd op een protocol met agarosegel alleen lipide GUVs 16 produceren en vereist minder gespecialiseerde apparatuur dan de electroformation methode.
De karakterisering van GUVs met fluorescentie microscopie wordt beschreven, evenals de procedures met behulp van een standaard patch-clamp set-up temeten KvAP activiteit in "inside-out" weggesneden membraan patches.
Groeiende eiwithoudende GUVs kan zijn moeilijker dan alleen lipide GUVs. In het bijzonder kunnen de uiteindelijke GUV rendement gevoelig afhankelijk van hoe de SUV oplossing afgezet en ontwaterd om het membraan stack. Voor iemand zonder eerdere ervaring met GUVs, kan het nuttig zijn eerst alleen groeien lipide GUVs na een gebruikelijke protocol 15,16 waarbij het membraan film wordt gevormd door lipiden uit een organisch oplosmiddel. Zodra de conventionele protocol werkt goed, kan SUV depositie en gedeeltelijke dehydratatie vervolgens worden beheerst met behulp van alleen lipide-SUV's, die ook erg behulpzaam bij het aanpassen van het protocol voor een nieuwe lipide samenstelling. Wanneer GUVs groeien betrouwbaar van alleen lipide-SUV's, dan is het maar een kleine stap om eiwithoudende GUVs uit proteo-SUV's te produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oplossing Voorbereiding
- Bereid 5 ml 'SUV buffer' bevattende 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) of Tris (pH 7,5) en 2 mM trehalose. Filtreer de buffer met een 0,2 urn spuitfilter en verdelen in porties van 1 ml die bij -20 ° C worden bewaard.
LET OP: Extra informatie voor reagentia en instrumenten worden gegeven in de lijst met materialen. - Bereid 40 ml van GUV 'Groei Buffer' dat de GUV interieur zal vullen tijdens de film rehydratatie. Voor een 'low salt' groei combineren 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) en 1 mM TRIS (pH 7,5) en -400 mM sucrose. Voor een 'fysiologisch zout' groei combineren 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) en 5 mM TRIS (pH 7,5) en -200 mM sucrose.
- Bereid 40 ml Observatie Buffer voor de externe oplossing in de experimentele kamer door het combineren van 100 mM KCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) en 5 mM TRIS (pH 7,5) en -200 mM glucose.
LET OP: Deze buffers zijn alleen EXAmples. Zie de discussie buffers andere experimenten passen. - Meet de osmolarities van de groei en observatie buffers met een osmometer. Korrels van sucrose of glucose toe om ze af te stemmen op binnen 1%, zodat GUVs niet zal lyseren of instorten wanneer overgebracht van de groei kamer naar de observatie kamer.
OPMERKING: In dit concentratiegebied, het toevoegen van 1 mM van sucrose (13,7 mg per 40 ml) of glucose (7,2 mg per 40 ml) verhoogt de osmolariteit door ~ 1 mOsm. - Filter de groei en observatie buffers met een 0,2 um filter en opgeslagen bij 4 ° C om bacteriegroei te remmen.
- Los 50 mg beta-caseïne in 10 ml 20 mM Tris (pH 7,5) buffer tot een 5 mg / ml beta-caseïne is gebruikt om de oppervlakken van experimentele kamers passiveren zodat GUVs niet houden, verspreiden en barsten te vormen. Zodra het beta-caseïne volledig is opgelost (tot enkele uren bij 4 ° C), filter (0,2 pm) het in monsters van 0,5 ml die flash worden ingevrorenbij -20 ° C voor later gebruik (ontdooid monsters opgeslagen bij 4 ° C kan typisch gebruikt tot 1 week).
2. SUV Voorbereiding
- Bereiden en fracties van proteo-SUV's naar aanleiding van de eerder gepubliceerde gedetailleerd protocol 28 bevriezen. Gebruik KvAP fluorescent gelabeld met Alexa-488 maleïmide, gereconstitueerd in DPhPC SUVs (10 mg / ml) bij een proteïne lipide-verhouding van 01:10 (massa).
OPMERKING: Wildtype KvAP bevat één cysteine per monomeer vlakbij het intracellulaire C-terminus (aminozuur 247). - Fluorescerende, only Lipid SUV:
OPMERKING: ga chloroform onder een rookkap dragen van nitril handschoenen en een veiligheidsbril. Vermijd het gebruik van een kunststof zoals chloroform ze kan oplossen. Chloroform oplossingen kunnen worden opgeslagen in amberkleurige glazen flesjes met Teflon caps en overgebracht met behulp van glas spuiten. Zorg glaswerk spoelen ten minste 5 tot 10 maal met chloroform vóór en na pipetteren lipiden.- Bereid 100 ul10 mg / ml DPhPC SUV die 0,5 mol% van de rode fluorescente lipiden, Texas rood-DHPE, door het mengen van 100 ui DPhPC oplossing (10 mg / ml in chloroform) 8,2 gl van Texas rood-DHPE oplossing (1 mg / ml in methanol) in een 1,5 ml amberkleurige glazen flacon.
- Droog de lipiden onder een stikstofstroom in een chemische kap tijdens het draaien van het flesje. Toen de film droog lijkt te zijn, plaatst de lipiden onder vacuum gedurende 3 uur om eventueel achtergebleven oplosmiddel te verwijderen.
- Voeg 100 ul van SUV buffer om de lipiden, en vortex krachtig tot geen lipide blijft vast aan de wanden van de flacon en de oplossing is uniform melkachtig.
- Ultrasone trillingen de lipide oplossing SUV vormen. Pas de flacon positie totdat de echo zorgt ervoor dat de meeste bewegingen en stromen in het flesje, en zorg niet aan de oplossing onnodig verwarmen. Ga sonicatie totdat de oplossing doorschijnend, of indien mogelijk, transparant (2-5 min voor tip sonificatie, ~ 20 min voor badsonicatie).
- Aliquot SUV (bijvoorbeeld 10 ul of 20 pi) en bevriezen (-20 ° C) voor later gebruik.
OPMERKING: Lipids, vooral onverzadigde vetten, kan gemakkelijk afbraak. WINKEL lipide oplossingen bij 20 ° C (of 80 ° C) onder argon en binnen 6 maanden. Lipide afbraakproducten kunnen worden gedetecteerd met dunnelaagchromatografie.
3. GUV Groei door Electroformation
- Bereid de electroformation kamer.
- Als de kamer niet is schoongemaakt, verwijder de ramen, veeg alle kit en vet, haal de draden, en spoel en scrub de kamer met een weefsel met behulp van water en ethanol (≥70%) afwisselend.
- Wrijf de draden goed, dompel de draden en de kamer in aceton, en ultrasone trillingen gedurende 5 minuten. Veeg alles met opnieuw een weefsel met behulp van aceton. Zet de kamer in ethanol en ultrasone trillingen gedurende 5 minuten.
- Monteer de kamer door het plaatsen van de draden door de gaten en draai en veeg de draden om ervoor te zorgen dat ze are schoon. Zet de kamer in gedestilleerd water, ultrasone trillingen gedurende 5 minuten en droog de kamer met een stroom van stikstof of lucht.
- Bereid 30 pi van 3 mg / ml suspensie in SUV SUV buffer. Om eiwithoudende GUVs vormen samen 8 pl proteo-SUV (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), 2 ui tl SUV (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) en 20 ui SUV buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis een laatste eiwit lipide (massa) verhouding van 1: 12,5 en 0,1 mol% TexasRed-DHPE. Meng de oplossing krachtig.
- Als alternatief voor het protocol met lipide-only SUV oefenen, gewoon combineren 10 ul van fluorescerende SUV's (10 mg / ml DPhPC en 0,5 mol% TexasRed-DHPE) met 20 pi SUV buffer.
- Stort de SUV Solution.
- Gebruik 2 pi pipet of 5 ul glazen spuit kleine (<0,2 ui) druppels van de SUV oplossing op de draden deponeren. Ongeveer 1 ui oplossing nodig voor een reeks druppels langs vormen1 cm van de draad. Zorg ervoor dat de druppels zijn klein genoeg en met voldoende tussenruimte dat ze niet aanraken of zekering.
- Laat het afgezette SUV drogen ~ 30 min in de open lucht. Wanneer alle druppels hebben gevestigd, draai de draad zodat de lipide deposito's zijn gemakkelijker te observeren met de microscoop.
OPMERKING: Als de SUV's niet voldoende droog, kunnen ze gewoon afwassen de draden bij de groei buffer wordt toegevoegd, terwijl het drogen te veel kan het eiwit beschadigen. Omdat luchtvochtigheid beïnvloedt de droogsnelheid, de droogtijd en / of luchtvochtigheid kan worden aangepast voor optimale resultaten 30. De lipide film op de draden moeten zichtbaar onder een microscoop.
- Monteer de kamer.
- Sluit de ruimte Bodem: Gebruik een spuit vacuüm vet aanbrengen op de bodem van de kamer rond de drie putjes en op een 40 mm x 22 mm dekglaasje voorzichtig tegen de kamerbodem dichten zodat het hecht zonder speling. Verzegeling van de zijwanden van de kamer (waar de uitgang draden) metafdichtpasta. Solliciteer vacuüm vet op de top van de kamer waarin de drie putten.
- Voeg langzaam groei buffergeheugen totdat elk putje wordt gevuld tot de top. Vermijd snelle beweging van de oplossing in de putten als dit de lipide film strip uit de elektroden.
- Sluit de tank af door zachtjes te drukken op de bovenklep dia op het vet, het verzorgen van de onderkant dekglaasje niet te verjagen. Gebruik een tissue om eventuele druppels buffer bij de randen van de bovenste dekglas verwijderd.
LET OP: Dit is een goed moment om de kamer onder de microscoop te onderzoeken om te bevestigen dat de lipide film is gebleven op de draden.
- Sluit de signaal generator om de draden met behulp van twee alligator clips. Stel de frequentie (10 Hz / 500 Hz sinus voor laag / hoog zout buffer) en gebruik een multimeter voor het meten en regelen van de spanning over de draden tot 0,7 / 0,35 V root mean square (Vrms) voor de lage / hoge zout buffer. Bedek de kamer met aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming tegen licht. Verlaat thij GUVs groeien voor 2 tot 3 uur voor de lage zout buffer, en 12 uur of O / N voor de hoge zout buffer.
- Koppel de kamer van de generator en zorgvuldig plaats het op een omgekeerde microscoop om GUV groei te evalueren. Gebruik langzame, gestage bewegingen of vloeistofstroom in de putten kan voortijdig los GUVs uit de draden.
OPMERKING: GUVs op de bramen gewoonlijk zichtbaar fasecontrast (40X lang werkende doelstelling afstand), terwijl GUVs overal op de onderste helft van de draden kan worden gezien met epifluorescentie. Indien geen GUVs zichtbaar, draai hem de draden te kijken naar het bovenoppervlak. GUVs kunnen bij 4 ° C worden bewaard in een groeikamer gedurende enkele dagen.
4. GUV Groei door Gel-bijgestaan Zwelling
- Maak 10 ml van een 1% agarose-oplossing door het mengen van 100 mg van agarose met 10 ml zuiver water. Verwarm het totdat het kookt door het te plaatsen in een magnetron bij 480 W voor ~ 20 sec. Roer om ervoor te zorgen dat de agarose volledig is opgelost.
OPMERKING: De oplossingkunnen worden opgeslagen bij 4 ° C en opgewarmd wanneer nodig. - Plasma-clean (lucht plasma) een cover-glijbaan voor 1 min, zodat de agarose-oplossing zal mooi verspreid over het. Gebruik de cover-dia's binnen de komende 15 min als het effect van plasma reiniging vermindert snel.
- Breng 200 pl warm agarose oplossing in elk 22 x 22 mm2 zo in de oplossing bevochtigt het gehele oppervlak. Kantel de dia verticaal en raak de onderrand om een tissue om overtollige vloeistof te verwijderen en laat slechts een dunne gladde laag van agarose op de dia.
- Plaats het preparaat op een hete plaat of in een oven bij 60 ° C en laten drogen gedurende ten minste 30 min. De agarose film nauwelijks zichtbaar met het blote oog. Nadat de objectglaasjes afkoelen tot KT, gebruik onmiddellijk of bewaar ze maximaal een week in een gesloten houder bij 4 ° C.
- Plaats de-agarose gecoate dekglaasje in een standaard 3,5 cm petrischaal.
- Bereid de SUV-oplossing zoals in paragraaf 3.2 en de toepassing ~ 15 ul van de SUV-oplossing (3 mg / ml lipide) in~ 30 fijne druppels voorzichtig op de agarose oppervlak. Zorg ervoor dat u de agaroselaag vervormen teveel.
- Plaats het preparaat onder een zachte stroom van stikstof gedurende ongeveer 10-15 min en volg de verdamping van de buffer door oog als druppeltjes drogen.
- Zodra de SUV gedroogd, voeg groei buffer aan het glijoppervlak bedekken. Voor een kleine 3,5 cm petrischaaltje gebruik ~ 1 ml buffer.
- Laat de zwelling te gaan voor ~ 30 min, en dan onderzoeken de groei van GUVs in de kamer met behulp van een omgekeerde microscoop met fase-contrast of Differentieel Interferentie Contrast (DIC).
OPMERKING: Epifluorescentie waarneming is moeilijk vanwege de sterke achtergrond van fluoroforen in de gel en de auto-fluorescentie van de agarose.
5. Oogsten en Observeren GUVs
- Passiveren de observatie kamer (bv kleine petrischaaltje of glazen dekglaasje), zodat GUVs niet houden, verspreiden en barsten op de kamer beneden. Bedek de chamber bodem met beta-caseïne oplossing, incubeer gedurende 5 minuten, spoel de caseïneoplossing met zuiver water, droog met een stroom van lucht of stikstof, en ten slotte toe observatie buffer (bv ~ 5 mm diepte voor een kleine petrischaal).
- Oogst de GUVs. Snij het einde van een 100 ui pipetpunten zodat de opening groter (~ 2 mm diameter), en streven langzaam de schuifspanning pipetteren gemakkelijk GUVs vernietigen.
- Voor-electro gevormd GUVs, opent de klimaatkast door voorzichtig verwijderen van de bovenste dekglaasje. Plaats de pipetpunt boven iedere draad en zuig ~ 50 ul tijdens het verplaatsen de pipetpunt langs de draad naar de GUVs los.
NB: Het kan helpen om de draad te GUVs te verzamelen over de "andere kant" van de draad te draaien. - Voor "-gel bijgestaan zwelling" GUVs, tikt u eerst op de zijkant van de petrischaal een paar keer om te helpen de GUVs los te maken van het dekglaasje oppervlak. Plaats de pipet net boven het dekglaasje en zuig 50 ul terwijl pulling de tip terug over het oppervlak. Rechtstreeks over geoogst GUVs om een observatie kamer, of op te slaan in een 1,5 ml microcentrifugebuis bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.
- Voor-electro gevormd GUVs, opent de klimaatkast door voorzichtig verwijderen van de bovenste dekglaasje. Plaats de pipetpunt boven iedere draad en zuig ~ 50 ul tijdens het verplaatsen de pipetpunt langs de draad naar de GUVs los.
- Plaats de observatie kamer op een omgekeerde microscoop, voeg de GUVs aan de observatie kamer, en wacht een paar minuten voor de GUVs te vestigen op de kamer bodem.
- De enquête van de kamer met fase contrast of DIC te glad, bolvormig ('foutloze') "GUV kandidaten" snel te lokaliseren. Onderzoekt elke "GUV kandidaat" in epifluorescente elke daarin kleinere liposomen in genest sluiten. Controleer ten slotte dat de lipide fluorescentie-intensiteit is uniform en compatibel met een enkel membraan (dat wil zeggen, unilamellair).
Opmerking: In sommige bilamellar (of multilamellaire) vesicles, de membranen te dicht bij elkaar worden opgelost zodat deze worden weergegeven unilamellaire in fase contrast of DIC afbeeldingen. Echter, deze voorwerpen worden onderscheiden van werkelijke unilamellar GUVs hun lipide fluorescentie, die tweemaal (of meer) helderder.
6.-Patch klemmen GUVs
- Maak patch pipetten met een 1-2 micrometer tip diameter van standaard borosilicaat capillair glas met behulp van het programma aanbevolen voor de pipet trekker.
OPMERKING: Bijzondere behandelingen zoals brand polijsten niet nodig, en pipetten kan worden gebruikt voor meerdere dagen na zijn getrokken als ze worden bewaard in een gesloten doos. - Passiveren de kamer door incubatie met een beta-caseïne-oplossing (5 mg / ml) zodat GUVs niet hechten, verspreiden en breuk op kameroppervlakken. Spoel de caseïne uit na 5 min.
- Plaats de aardelektrode, vult de kamer met observatie buffer, overdragen 10 ul van de GUV schorsing zoals beschreven in stap 5.2 en 5.3, en wacht een paar minuten voor de GUVs om zich te vestigen op de bodem.
- Vul een frisse patch pipet met oplossing (observatie buffer of een andere iso-osmotische oplossing) enmonteren op de patch-clamp versterker headstage.
- Zoek door de kamer om een "foutloze" GUV lokaliseren zoals beschreven in paragraaf 5.4, en controleer of het fluorescerend eiwit bevat.
- Breng een constante positieve druk (> 100 Pa, of ongeveer 1 cm H 2 O in een manometer) om de patch pipet interieur schoon te houden, en steek de patch pipet in de kamer. Breng de patch pipet in het gezichtsveld, testimpulsen gelden voor het meten / compenseren de pipet spanning offset en weerstand, en onderzoekt de pipet onder tl-verlichting te bevestigen dat de tip is schoon.
- Breng de patch pipet richting de GUV, en indien nodig, tegelijkertijd verminderen van de positieve druk, zodat de uitstroom uit de patch pipet niet de GUV maken "weg te lopen". Wanneer de patch pipet dicht bij de GUV, passen een negatieve druk (tot 5 cm H2O) aan de GUV tegen de patch pipet trekken. Controleer de weerstand als de "; Tong "van GUV membraan komt de patch pipet en de gigaseal vormen.
- Als een gigaseal niet vormen, verwijder de patch pipet uit de kamer en terug te keren naar stap 6.4. Als het membraan patch vormden een gigaseal, maar de GUV blijft aan de pipet, accijnzen de patch door weg te trekken uit de GUV, barsten de GUV tegen de kamer bodem, of in het kort het verplaatsen van de pipet uit de oplossing.
- Wanneer de inside-out membraan patch is uitgesneden uit de GUV en de gigaseal stabiel is, schakelt u de test pulsen en een spanning protocol toe te passen zoals die weergegeven in figuur 13.
OPMERKING: Figuur 13 volgt de standaard elektrofysiologische conventie voor een inside-out patch waarin stroom in de patch-elektrode is 'positief', en V = V bad - V pipet. Houd de pleister op een negatieve potentiaal (bijvoorbeeld V = -100 mV) voor ~ 30 sec plaatsen KvAP in de toestand van rust, terwijl de stappen (100 msec tot 5 sec) om meer positieve potentials (bv V = 100 mV) kan rijden dan het in het uitvoeren van (dat wil zeggen, open) actieve toestanden. - Na metingen op een membraan patch klaar zijn, breken de patch met een zap of drukpuls en controleer of de spanning te compenseren van de patch elektrode niet afgedreven. Verwijder de patch pipet uit de kamer, en terug te keren naar stap 6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De groei van GUVs kan snel worden geëvalueerd door het onderzoeken van de groeikamer onder de microscoop. Voor electroformation, de GUVs neiging om te groeien in trossen langs de platina draden, zoals getoond in figuur 4. In-gel ondersteunde zwelling, GUVs weergegeven als bolvormige structuren die snel groeien en samensmelten (figuur 5).
Foutloze GUVs gemakkelijker kunnen worden vastgesteld en geëvalueerd na de overdracht aan een observatie kamer. Kalibratiemetingen zijn nodig om grondig te evalueren GUV kwaliteit, en een systematische kwantificering is eerder 28 gepubliceerd. Echter, als een empirische gids, "goed" GUVs moeten worden geïsoleerd (dwz niet in een cluster), hebben een enkele, vloeiende, sferische buitenste membraan, bevatten geen objecten (dwz, buizen, genesteld blaasjes, enz.) Binnen, en hebben de "standaard" lipide fluorescentie niveau (helderder objecten zijn meestal bi- of multi-lamellaire). Figuur 6 toont DIC en epifluorescentie beelden van een 'foutloze' GUV na overdracht naar een iso-osmotische glucose-oplossing. Het contrast in DIC wordt veroorzaakt door het verschil in optische dichtheid tussen de sucrose gevuld GUV en het glucose bevattende badoplossing. De brekingsindex contrast van KvAP bevattende GUVs neemt vaak tijd, hoewel KvAP zelf niet doorlaatbaar sucrose of glucose dient. De uniforme eiwit fluorescentie in de GUV membraan bevestigt dat KvAP is verwerkt in de GUV (dat wil zeggen, het niet in de lipide film blijven) en is nog niet gevormd micron-schaal (of groter) aggregaten.
Figuren 7, 8 en 9 tonen confocale beelden van lipiden en eiwitten fluorescentie van GUVs geproduceerd door de lagere-zout electroformation protocol, fysiologisch zout electroformation protocol, en gel bijgestaan zwelling protocol. De fluorescerende lipide (magenta) en eiwit(Groen) signalen geschaald om dezelfde gemiddelde intensiteit, zodat GUVs met een laag / hoog aantal eiwitten per oppervlakte-eenheid (eiwit dichtheid) een magenta / groene tint deklaag afbeeldingen (rechterkant), terwijl GUVs een gemiddelde eiwit dichtheid zijn wit. Geïsoleerde, foutloze GUVs geïdentificeerd en de GUV grootteverdeling wordt getoond in figuur 10. Typisch electroformation produceert meer foutloze GUVs dan gel ondersteunde zwelling, maar de door electroformation GUVs kleiner. Figuur 11 toont de verdeling afgeleide eiwit dichtheid van de fluorescentie van de GUVs. Electroformation met high-zout buffer produceert GUVs waarin het eiwit dichtheid varieert sterk van GUV te GUV. Het eiwit dichtheid van individuele GUVs varieert veel minder voor electroformation zoutarme buffer, terwijl het eiwit dichtheid van GUVs door gel ondersteunde zwelling opmerkelijk uniform.
De patch-clamp techniek is een veel gebruiktd methode voor het bestuderen van de functie van voltage-gated ionkanalen, zoals KvAP. In 'inside-out' opnames, is een schoon glas "patch" pipet gebruikt om een patch van membraan te snijden uit een GUV. Een elektrode in de patch pipet wordt vervolgens gebruikt om spanning op, en meet de resulterende stroom die door de membraanplaat. De samenstelling van de membraanplaat kan sterk verschillen van de rest van de cel / GUV 31, maar de "binnenste buiten" configuratie is nog altijd zeer bruikbaar voor het meten van de eenkanaals geleidbaarheid, ionische selectiviteit en voltage-afhankelijke gating. Deze drie eigenschappen zijn een uitstekende manier om vast te stellen dat de stromingen zijn niet te wijten aan artefacten (bijv gigaseal kwesties) of contaminanten (bijvoorbeeld bacteriële porinen van de zuivering), en er zijn functionele KvAP kanalen in de GUVs.
-Geleidingsvermogen het gemakkelijkst gemeten vlekken met slechts één of twee actieve kanalen. In de EXAmple getoond in figuur 12, worden geen kanaalopeningen waargenomen wanneer het membraan wordt gehouden op -100 mV, terwijl bij +100 mV, afzonderlijk kanaal openingen duidelijk opgelost. De huidige histogram toont twee pieken die overeenkomen met de gesloten en open toestanden en rusten met een dubbele Gaussische functie levert een enkel kanaal stroom van 10,9 ± 0,85 pA, overeenkomend met een geleiding van 109,2 ± 8,5 pS (100 mM KCl). Merk op dat de single channel geleidbaarheid is afhankelijk van de oplossing (vooral kalium concentratie) en membraansamenstelling 32,33.
Net als veel andere K-kanalen, individuele KvAP kanalen tentoonstelling "klapperende" uitbarstingen van snelle openingen en sluitingen. Zoals eerder aangetoond kan kalium selectiviteit worden getest door een andere oplossing in de patch pipet (bijvoorbeeld patch pipet oplossing 90 mM NaCl, 10 mM KCl) 28.
Spanningsafhankelijke schakeling is vaak studied in pleisters met meerdere kanalen, teneinde een ensemble gemiddelde gemakkelijker verkrijgen. Hoewel er geen duidelijk mechanisme bevorderen van de fysiologische (intracellulaire domein GUV binnenkant) en inverse (intra-cellulaire domein van de GUV buitenzijde) inbrengen van KvAP in GUVs, in "inside-out" membraan plekken de meeste functionele kanalen de " fysiologische "insertie 28. Figuur 13 toont de respons van een membraanplaat met meerdere (> 10) kanalen een reeks van 5 seconden depolariserende stappen. Tussen elke stap wordt de pleister gehouden -100 mV gedurende 30 seconden om kanalen met de "fysiologische" insertie terugkeren naar hun rusttoestand. Als de potentiële voldoende negatief (bijvoorbeeld V <-60 mV) de meeste stroom door de gigaseal lek, en af en toe openingen een of twee kanalen die waarschijnlijk de "omgekeerde" insertie kunnen hebben. Voor stappen om meer positieve potentials, steeds meer kanalen te worden, totdat zijn er zo veel dat individuele openingen en sluitingen niet langer kunnen worden opgelost. Aldus, de open waarschijnlijkheid van het kanaal duidelijk spanningsafhankelijke. De kinetiek van KvAP activering en inactivering verschillen aanzienlijk tussen zwart lipidemembranen (BLMs) 26 en GUVs, maar dit is in overeenstemming met eerdere rapporten die Kv kanaal gating gevoelig voor de membraansamenstelling en staat 34 kunnen zijn.
Figuur 1. GUV Electroformation Schematische:. Druppels met SUV's worden afgezet op een elektrode gedeeltelijke dehydratatie van de oplossing zorgt ervoor dat de SUV's te fuseren tot een stapel membranen vormen. Buffer wordt toegevoegd en een AC elektrisch veld toegepast. Naarmate de film zwelt individuele membranen los van de stapel GUVs vormen. (Dit cijfer is mod ified van Aimon et al. 28)
Figuur 2. GUV Electroformation kamer. De kamer wordt gefreesd uit een PTFE-blok met drie putten (10 mm diameter, mm diepte 5). Twee 0,5 mm diameter platinadraden worden gescheiden door 3 mm (edge-to-edge afstand) en dicht bij de bodem van de kamer gepositioneerd om beeldvorming van de draad vergemakkelijken. Onderkant en bovenkant dekglaasjes zijn plaats gehouden met vacuüm vet, en afdichtpasta voorkomt lekken van de draad gaten aan de zijkant. De AC-generator is verbonden met krokodillenklemmen om de draden. De kamer is gebaseerd op één ontwikkeld door Ernesto Ambroggio en Luis Bagatolli. (Dit cijfer is gewijzigd van Aimon et al. 28)
"/>
Figuur 3. Gel-ondersteunde Spontane Zwelling schema: Druppeltjes die een SUV suspensie worden afgezet op een agarosegel Als druppel uitdroogt, de SUV fuseren aan een lipide film te vormen.. Wanneer de groei buffer toegevoegd, de film hydrateert en GUVs vormen op het oppervlak. GUVs groeien tot een grootte van ~ 10 um door zwelling en het fuseren met naburige GUVs.
Figuur 4. Vertegenwoordiger beeld van DPhPC GUVs bevatten KvAP groeien op de platinum draad in een buffer met hoog zoutgehalte. De GUVs lijken druiventrossen langs de draad. Fasebeeld Contrast met behulp van een 40X LWD doelstelling. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. DPhPC GUVs met KvAP zwelling op agarosegel. De GUVs zijn zichtbaar als zwakke bolletjes met een diameter van ~ 10 urn. De donkere / lichte vlekken zijn lipide / agarose aggregaten waarvan de blaasjes zwellen. Fasebeeld Contrast met 40X LWD doel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Beelden van een foutvrije GUV. (Ei-PC: Ei-PA 9: 1 van de massa) met KvAP gelabeld met Alexa-488 links: DIC, rechts: Alexa-488 epifluorescente. Excitatie: 470/50 nm, emissie: 545/75 nm. Opmerking uniforme fluorescentie van KvAP zonder zichtbare aggregaten. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. confocale beelden van lipide (magenta) en eiwit (groen) fluorescentie van elektrovormen GUVs geteeld in een zoutarm buffer (Ei-PC: Ei-PA 9: 1 van de massa) (A) De witte pijlen merk (waarschijnlijk). GUVs, terwijl de rode pijl markeert een potentieel bi-lamellaire blaasje met hogere lipide fluorescentie. Merk op dat de fluorescentie-intensiteit is helderder in het centrum van het beeld vanwege de extreem groot gezichtsveld. (B) Zoom met een kleine groep van GUVs. Links (magenta): TexasRed-DHPE excitatie: 543 nm laser lijn, emissie: 605/70 nm. Center (groen): KvAP gelabeld met Alexa-488 excitatie: 488 nm laser lijn, emissie: 515/30 nm. Rechts: overlay.OAD / 52.281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8. confocale beelden van lipide (magenta) en eiwit (groen) fluorescentie van elektrovormen GUVs geteeld in fysiologische zoutconcentratie (Ei-PC: Ei-PA 9: 1 van de massa). (A) De GUVs (witte pijlen geven waarschijnlijk unilamellair voorbeelden) zijn meer schaars in vergelijking met de lage zout protocol en kan zeer verschillend eiwit concentraties (rode pijl) hebben. (B) Zoom met een kleine groep van GUVs. Links (magenta): TexasRed-DHPE excitatie: 543 nm laser lijn, emissie: 605/70 nm midden (groen): KvAP gelabeld met Alexa-488 excitatie: 488 nm laser lijn, emissie: 515/30 nm. Rechts:. Overlay Gelieve clik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9. confocale beeld van lipide (magenta) en eiwit (groen) fluorescentie van GUVs (DPhPC) gevormd door-gel bijgestaan zwelling met een fysiologische zoutconcentratie buffer. GUVs tonen een meer homogene eiwit dichtheid dan elektrovormen GUVs bereid met fysiologische buffer. Links (magenta): BPTR-Cer 0,1% excitatie: 543 nm laser lijn, emissie: 605/70 nm. Midden (groen): KvAP gelabeld met Alexa-488 excitatie: 488 nm laser lijn, emissie: 515/30 nm. Rechts:. Samenvoegen van de twee kanalen Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 11. GUV eiwit dichtheid histogrammen: Het eiwit dichtheid (aantal eiwitten per oppervlakte-eenheid) van GUVs geëlektroformeerde met een laag zout buffer (5 mM KCl, DPhPC) varieert van minder dan met fysiologisch zout concentratie (100 mM KCl, Ei-PC: Ei -PA. 9: 1 van de massa) Het eiwit dichtheid van GUVs (DPhPC) gegroeid met gel bijgestaan zwelling in fysiologisch zout buffer geeft de minste variatie. Eiwit dichtheid evenredig met KvAP-A488 fluorescentie-intensiteit voor deze concentraties 28 en in elk histogram van de fluorescentie-intensiteiten worden genormaliseerd door het gemiddelde van de verdeling. (Het middenpaneel is gewijzigdvan Aimon et al. 28)
Figuur 12. Single channel activiteit van GUV Membraan Patches (DPhPC 'inside-out' voltage-verdrag). De GUV werd gekweekt in 100 mM KCl, 5 mM HEPES pH 7,4 op platina draden. Single kanalen geopend na het toepassen van 100 mV potentiaal op de patch. Rechts van de inzet is een histogram gebruikt om één kanaal geleidingsvermogen berekenen. De rode lijn is een fit om een dubbele Gaussische functie met maxima bij 4.70 ± 0.27 pA en 15,62 ± 0,58 pA, wat overeenkomt met een geleiding van 109,2 ± 8,5 Ps. Het spoor werd gefiltreerd bij 10 kHz met een 4-polig Bessel filter en opgeslagen bij 50 kHz.
Afbeelding 13. Spanning-dependen t gating kanalen in het membraan patch uit een GUV gevormd op agarose in een buffer met hoog zoutgehalte (DPhPC, 'inside-out' voltage-verdrag). (A) Reactie van de patch membraan stroom om een tijdelijke stap in spanning. Pipet en badoplossingen beide bevatten 100 mM KCl en het membraan werd gedurende 30 seconden bij -100 mV tussen opeenvolgende stappen spanning. Van een nauwgezet onderzoek kan men zien dat het spoor bevat 1 of 2 kanalen die lijken te openen met negatieve spanningen. Inzet a) toont een zoom van de vertraagde opening en inzet b) vertraagde sluiting van het kanaal. Stromen werden gefiltreerd met een 4-polig Bessel filter bij 10 kHz en vervolgens aan 51.3 kHz. Offline het spoor werd down-bemonsterd tot 513 Hz. De negatieve capaciteit van voorbijgaande aard is afgesneden op -150 pA. (B) De gemiddelde stroom (0,25 sec <t <5 sec) en de step spanning. Stromen bij positieve spanningen groter zijn, omdat het kanaal geopend kans is spanningsafhankelijke.iles / ftp_upload / 52.281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biomimetic modelsystemen zijn een belangrijk instrument voor het bestuderen van de eigenschappen en interacties van eiwitten en membranen. Vergeleken met andere gereconstitueerde systemen zoals BLMs of ondersteunde lipidemembranen, GUV systemen vertonen vele mogelijkheden waaronder aanzienlijke invloed membraan samenstelling, spanning en geometrie, maar ook als echte olie-vrij. Echter, waarin transmembraan eiwitten, zoals KvAP, in GUVs vereist aanzienlijke aanpassingen van conventionele protocollen voor slechts lipide GUVs. De electroformation protocol hier gepresenteerde werd eerder gekarakteriseerd en worden gebruikt voor het bestuderen van de biofysische principes van membraaneiwit verdeling en dynamiek in gebogen membranen 2,4,35. Dit werk toont een nieuwe gel bijgestaan zwelling protocol, toe te voegen aan de set van methoden voor eiwit reconstitutie in GUVs. Beide protocollen kunnen foutloze GUVs met hoge dichtheden van KvAP, en metingen produceren op inside-out plekken bevestigen dat dese GUVs bevatten functionele kalium-selectieve, spanningsafhankelijke kanalen.
De twee benaderingen hebben verschillende sterke en zwakke punten. Wanneer zoutarm omstandigheden kan worden gebruikt, electroformation biedt een goed compromis tussen GUV rendement en uniforme eiwit dichtheid. Electroformation geeft nog redelijke opbrengst met fysiologische zoutconcentraties, maar het eiwit dichtheid kan sterk variëren GUVs (zie figuren 8 en 11). De dichtheid variaties lijkt verband te houden met de duur van electroformation, zo laag zout buffer groei ook aanzienlijke dichtheidsvariaties indien de groei verder veel langer dan 2 uur. Daarentegen GUVs door gel ondersteunde zwelling opvallend uniform eiwit dichtheid, zelfs fysiologische buffers. De fractie van multilamellaire vesicles groter en agarose auto-fluorescentie compliceert kwantificering van eiwitarme dichtheden 16. Met polyvinylalcohol in place agarose werd gemeld aan de gel ondersteunde GUV opbrengst te verbeteren wanneer lipiden werden afgezet uit chloroform 20, maar we konden GUVs met polyvinylalcohol met SUV oplossingen produceren. Als een lagere opbrengst van foutvrije GUVs is acceptabel, gel bijgestaan zwelling heeft een duidelijk voordeel voor experimenten die een uniforme eiwit distributie vereist.
Electroformation en gel bijgestaan zwelling hebben ook heel andere uitrusting. De gel ondersteunde zwelling protocol gebruikt weinig gespecialiseerde apparatuur behalve het plasma schoner, dat niet essentieel omdat er veel alternatieve manieren schoon, hydrofiel glas produceren. In tegenstelling electroformation vereist een aangepaste kamer met draad elektroden. Platina draad is duur, maar voor dit protocol GUVs groeide gemakkelijker met platina dan titanium draden, en GUVs niet groeien op ITO dia's bij het gebruik van fysiologische zoutconcentraties. De diameter van de elektroden (0,5 mm) is een compromise tussen elektrode oppervlak en prijs. De in figuur 2 kamer is gebaseerd op een ontwerp van Luis Bagatolli 15 en Ernesto Ambroggio, en is vervaardigd uit polytetrafluorethyleen (PTFE) voor het reinigen met de meeste oplosmiddelen mogelijk. Wel moet polyacetaal of polyvinyl chloride (PVC) ook goed werken. De mogelijkheid om de platina draden verwijderd voor agressieve schoonmaakmiddelen belangrijk, en bij de eerste leren van het protocol, is het zeer nuttig kunnen GUV groei in situ waarnemen door de bodem dekglaasje. De kleinere, gesloten putten verhinderen oplossing van klotsen heen en weer en ook proeven van verschillende lipidesamenstellingen parallel staan. Echter, een speciaal aangepaste kamer is niet van essentieel belang bij het opstarten uit. Zo kan eenvoudig enkelvoudig putjes kamers worden geïmproviseerd door tacking twee draden naar de bodem van een kleine petrischaal of met zegellak sandwich ze tussen twee glasplaatjes, of gewoon poking ze door de dop van een klein flesje.
Zowel de electroformation en gel ondersteunde zwelling protocollen moeten voldoende foutloze GUVs micro-manipulatie en patch-clamp experimenten produceren. De GUV opbrengst is afhankelijk gevoelig op de vorming van de bilaag stapel wanneer de SUV oplossing gedeeltelijk gedehydrateerd. Als de problemen worden ondervonden in het kweken van GUVs (dwz geen of weinig GUVs zijn zichtbaar in de klimaatkast), kan het heel nuttig zijn om alleen lipide GUVs groeien met behulp van een lipide / chloroform oplossing in plaats van SUV 15,16 (en een lage zout buffer). Als GUVs niet goed groeien van een lipide / chloroform film dan is er iets fundamenteel mis is (bijvoorbeeld onjuiste lipide oplossingen of buffers, vet of vuil op de elektroden, verkeerde spanning of frequentie, enz.). Indien GUVs groeien van lipide / chloroform films maar niet de SUV films, ligt het probleem waarschijnlijk bij de gedeeltelijke dehydratie.
De gedeeltelijke dehydratatie stap isgemakkelijkst geoptimaliseerd met lipide alleen SUV omdat er geen gevaar "denatureren" lipiden door overmatige dehydratatie. Voor electroformation, kan het nuttig zijn om de draden te onderzoeken nadat de SUV druppeltjes zijn laten drogen om te controleren of er heldere lipide fluorescentie op elke plek waar een druppel werd afgezet. Als de lipide fluorescentie verdwijnt na de kamer wordt gevuld met groei-oplossing, dan is ofwel de groei oplossing moet zorgvuldiger worden toegevoegd, of de SUV's moeten uitdrogen langer zodat de film hecht meer stevig aan de draad. Tijdens de groei, zorg ervoor dat noch de draden noch oplossing verhuizing binnen de kamer (bijvoorbeeld bij het aantrekken van de kamer op de microscoop) om te voorkomen dat het strippen GUVs uit de draden. Wanneer GUVs goed groeien, ze zijn meestal gemakkelijk te zien in fase contrast beelden. Echter, kleinere GUVs zijn met lipide fluorescentie, die ook nuttig voor het zien hoe het membraan stack is veranderd tijdens de groei vaak duidelijker. Onderzoek alle oppervlakken vande draden (binnen, buiten, boven en onder) in alle putjes en de kamervloer voor weggooien groei omdat rendement aanzienlijk kan verschillen van plaats tot plaats.
De behandeling en opslag van GUVs is eenvoudig in vergelijking met cellen, maar GUVs zijn heel gevoelig voor osmotische stress, afschuifkrachten en adhesie. Gladde, zachte bewegingen zijn belangrijk bij het oogsten of het overbrengen GUVs, en het is belangrijk om oppervlakken te GUVs voorkomen hechten en exploderende passiveren. Echter, voor patch clamp experimenten de kamer moet worden grondig gespoeld na passiveren zodat de passivering oplossing kan niet de vacht van de patch pipetten en voorkomen gigaseal formatie. Voor passivering, de beta-caseïne behandeling is eenvoudig en doeltreffend, en vergeleken met bovine serum albumine, die een lipide transportfunctie heeft, meer beperkte interactie met lipide dubbellagen de voorkeur en bij het werken met GUVs 36 beta-caseïne. Door het variëren van de incubatietijd, ismogelijk om GUVs te houden zonder te ontploffen. Toch zal de GUVs niet aan het dekglaasje zo stevig cellen, en dus moet stil tijdens een procedure die stroming in de kamer kunnen induceren (bijvoorbeeld buffer perfusie, beweegt de kamer) genomen.
Patch-clamp opname is een klassieke methode voor het bestuderen van voltage-gated ionkanalen zoals KvAP en dit protocol is afgeleid van standaard technieken voor het verkrijgen van "inside-out" patches van hechtende cellen. Een standaard patch-clamp set-up waarin de patch pipet daalt schuin (bv 30-60 graden van horizontaal) in een kleine petrischaal moet goed werken. Echter, kan duidelijker beelden van de patch pipet en gigaseal regio worden verkregen met behulp van een kamer waarin hoes-slips vormen de kamer boven en onder (~ 1 mm scheiding) zodat de patch pipet kan horizontaal te voeren vanaf de zijkant. Omdat grote patch pipet druk niet nodig zijn, kan de druk gunstig zijn controlled met een spuit en bewaakt met elke eenvoudige drukmeter (bijv, geïmproviseerde water manometer). Het kan nuttig zijn om de eerste training patch clamp experimenten met slechts lipide GUVs geteeld met behulp van een lipide / chloroform-oplossing en zoutarme buffer zijn. Omdat de opbrengst van foutvrije GUVs is zeer hoog, is er voldoende perfect GUVs zijn samen met de ook als velen vernietigd tijdens het oogsten en transfer naar de experimentele kamer.
Met een beetje oefening, kan weggesneden membraan van patches met stabiele gigaseals gemakkelijk worden verkregen uit DPhPC GUVs en KvAP-DPhPC GUVs. Om een hoog slagingspercentage te bereiken, het helpt om zorgvuldig te selecteren ronde, maar iets-fluctuerende, foutloze GUVs en controleer of de patch pipet schoon is (op zoek naar lipiden in fluorescentie) voordat u de gigaseal vormen. Wanneer een membraan "tong" komt in de patch pipet, de gigaseal vormt typisch snel (<1 sec) zonder enige noodzaak voor sterke zuigkracht of specific houdspanning. Terwijl een slechte afdichting kan verbeteren het membraan kruipt verder in de patch pipet, vaak de afdichting blijft arm omdat de pipet interieur was verontreinigd en moet beginnen met een nieuwe pleister pipet en GUV. DPhPC vormen zeer stabiele membraan vlekken (tientallen minuten) met een uitstekende afdichting weerstand, ook bij hoge spanningen (bv ± 150 mV). SOPC: cholesterol (3: 1 mol) kan vormen zeer stabiele pleisters maar hogere zuigkracht eisen te verzegelen, terwijl ei-PC pleisters lijken gemakkelijker breken.
Voor langere patch-clamp sessies kan het nodig zijn om de osmolariteit van de oplossing kamer passen. Als de osmolariteit is te veel lager dan de GUV groei buffer, GUVs geworden gezwollen, gespannen en sferische en kan het niet mogelijk zijn om de GUV membraan ver genoeg te zuigen in de patch pipet om een gigaseal vormen. Dit kan vaak door simpelweg te wachten 10 of 20 min als de verdamping uit de kamer worden vastgesteld verhoogt de externe oplossing osmolariteit totdat de GUVs leeglopen en beginnen te schommelen. Omgekeerd, als de kamer open blijft te lang de osmolariteit van de externe oplossing kan toenemen totdat GUVs leeglopen, buisvormig maken en bud. Dit kan worden vermeden door het blokkeren van verdamping uit de kamer (bijvoorbeeld minerale olie) of periodiek toevoegen van gedestilleerd water aan het water dat verdampt vervangen.
Omdat eiwitten van uitgesneden membraan pleisters 31 kan worden uitgesloten, wordt het aantal actieve kanalen in een uitgesneden patch niet alleen gerelateerd aan de dichtheid van eiwit in de GUV membraan. Fluorescentie metingen suggereren de concentratie van KvAP in de patch membraan is veel lager dan de GUV 28 en kan vrij gemakkelijk om pleisters met slechts een klein aantal kanalen te verkrijgen. Als pleisters bevatten te veel kanalen voor enkel kanaal opnemen, het duidelijke stappen met patch pipetten met kleinere uiteinden en / of verlagen van de eiwit-to-lipide density in de SUV mix effectief zijn. In tegenstelling tot ensemble metingen pleisters met vele kanalen uitvoert, kan het nuttig zijn om te beginnen met een relatief hoge dichtheid eiwit (bijvoorbeeld, 1:10, eiwit lipide per gewicht), gebruikt proteïnefluorescentie GUVs te selecteren met een hoog eiwitgehalte dichtheid Gebruik grotere patch pipetten (bijvoorbeeld 2-3 micron tip diameter) en zuig snel te proberen de afdichting snel vormen. Het is duidelijk dat de "whole-cell" -type configuratie (dat wil zeggen, 'whole-GUV') ideaal om alle kanalen te karakteriseren in een GUV te zijn, maar helaas is de "whole-GUV" configuratie brengt verschillende technische problemen 37.
De oplossingen, lipiden en eiwitconcentraties in deze handleiding worden louter als uitgangspunt, en kan worden aangepast aan de behoeften van een bepaalde proef na enkele overwegingen passen.
Alle oplossingen moet een pH buffer zoals HEPESof TRIS te verzekeren eiwitten niet worden blootgesteld aan extreme pH. De SUV buffer moet zo laag een concentratie van opgeloste stoffen als het eiwit zal tolereren (bijvoorbeeld 5 mM zout of lager), als opgeloste stof concentraties verhogen tijdens de gedeeltelijke dehydratatiestap en hoge zoutconcentraties kan het eiwit denatureren of snel veroorzaken de lipide film delamineren tijdens de rehydratatietrap. Kleine hoeveelheden suikers zoals trehalose (bijvoorbeeld 1 mM tot 5 mM) wordt gedacht dat het eiwit beschermen tijdens dehydratatie 23. Hoewel trehalose is betrokken bij anhydrobiosis en wordt geacht membraan eiwitten beschermen tegen uitdroging 38 kan sucrose of glucose even goed werken.
Voor de groei buffer, de zoutconcentratie is vooral belangrijk omdat dit de parameters beïnvloeden optimale GUV groei (bijvoorbeeld electroformation spanning, frequentie en duur). In tegenstelling, de primaire beperking voor waarneming buffer thoed het hetzelfde osmolariteit als de groei buffer moeten hebben. De opname van sucrose en / of glucose in het "groei buffer" en "observatie buffer" kan nuttig GUVs sediment op de bodem van de waarnemingskamer waarborgen, terwijl een verschil in brekingsindex tussen GUV binnen en buiten helpt met fasecontrast of DIC microscopie. Electrophysiologists bevatten vaak calcium- of magnesiumionen aan het bad en / of patch pipet oplossingen gigaseal formatie met celmembranen versterken, maar deze lijken niet essentieel GUVs zijn. Inderdaad, tweewaardige ionen zoals magnesium en calcium lipide fasescheiding induceren en hechting vergemakkelijken, dus als deze problemen nuttig 1 mM EDTA toe kan zijn.
Duidelijk, een attractie in gereconstitueerde systemen in vergelijking met cellen het vermogen om lipidesamenstelling controleren. DPhPC GUVs groeien goed en vormen stabiele weggesneden membraan patches en deze protocollen hebben ook gewerkt efdaadwerkelijk van voor lipide mengsels die fosfatidylcholine (PC), fosfatidylethanolamine (PE), fosfatidylglycerol (PG), fosfatidinezuur (PA), fosfatidylserine (PS) en cholesterol. Echter, GUV groei gevoelig voor zowel lipidensamenstelling en buffers 15, en dus protocol parameters (bijv hoeveelheid lipiden afgezet electroformation spanning / frequentie) moet worden aangepast lipide mengsels die hoge concentraties van PE, geladen lipiden (PG, PA, PS) of cholesterol. Wanneer beginnen, Ei-PC, DOPC of DPhPC zijn een goede eerste keuze, en het is ook zeer nuttig om een fluorescerende lipide bevatten om GUV groei te observeren en te GUVs onderscheiden van multilamellaire blaasjes met twee of meer dubbele lagen. Lipidemengsels kunnen worden bereid door SUV suspensies van voorraadoplossingen, de lipiden mengen tijdens de gedeeltelijke dehydratie stap (mits de temperatuur hoger is dan afzonderlijke faseovergangstemperatuur). Het gebruik van hogere SUV concentratie (bv10 mg / ml) voorraadoplossingen maakt aanzienlijke flexibiliteit, en deze kunnen vervolgens worden verdund tot 3 mg / ml voor het ontwateren suspensie.
Als proberen deze protocollen andere trans-membraaneiwitten passen, is het zeer belangrijk om zowel direct waarnemen van de opname van eiwit in de GUVs en testen eiwit functie. Hoewel niet een probleem met KvAP, is er altijd de mogelijkheid dat tijdens de rehydratatietrap het trans-membraan eiwit in de membraan stack leidt tot de vorming van slechts lipide GUVs blijven. TL-etikettering van het eiwit is erg handig als het biedt een snelle en eenduidige manier om eiwit incorporatie observeren in GUVs en ook controleren voor aggregatie binnen GUVs. Het is ook belangrijk om eiwitfunctie in de GUVs testen bevestigen dat het eiwit niet werd beschadigd tijdens de reconstitutie. Voor ion kanalen zoals KvAP, kunnen patch-clamp metingen op de aanwezigheid van functionele kanalen in de standGUVs. Echter, een fluorescentie-gemerkt hoge affiniteit ligand (bijvoorbeeld toxine, substraat of anti-lichaam) zou ook zeer nuttig zijn voor het testen van de toestand van eiwitten in GUVs.
Kortom, dit artikel legt uit hoe proteo-GUVs met de voltage-gated kalium kanaal KvAP produceren en te karakteriseren ze met behulp van fluorescentie microscopie en elektrofysiologie. Hopelijk deze werkwijzen kunnen worden aangepast aan nieuwe klassen van membraaneiwitten en een basis voor meer complexe in vitro systemen voor het bestuderen en het opbouwen van levende materie van de fundamentele componenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
- Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
