Abstract
DNA in situ-hybridisering (DNA-ISH) är en vanligt använd metod för kartläggning sekvenser till specifika kromosomområden. Detta tillvägagångssätt är särskilt effektiv vid kartläggning mycket repetitiva sekvenser till heterochromatic regioner där beräkningsmetoder inför oöverkomliga utmaningar. Här beskriver vi en strömlinjeformad protokoll för DNA ISH som kringgår formamid tvättar som är standard stegen i andra DNA ISH-protokoll. Vårt protokoll är optimerat för hybridisering med korta enkelsträngat DNA-prober som bär fluorescerande färgämnen, som effektivt markerar repetitiva DNA-sekvenser inom heterochromatic kromosomala regioner över ett antal olika typer insektsvävnads. Dock kan program utökas för att använda med större prober och visualisering av enstaka exemplar (icke-repetitiva) DNA-sekvenser. Vi visar denna metod genom att kartlägga flera olika repetitiva sekvenser till klämd kromosomer från Drosophila melanogaster neurala celler och Nasoniavitripennis spermatocyter. Vi visar hybridiseringsmönster för både små, kommersiellt syntetiserade sonder och för en större sond för jämförelse. Denna procedur använder enkla laboratorieutrustning och reagenser, och är idealisk för utredare som har liten erfarenhet av att utföra DNA ISH.
Introduction
DNA in situ-hybridisering (DNA-ISH) är en vanligt använd metod för kartläggning sekvenser till specifika kromosomområden. Probes till lösnummer regioner inom eukromatin kan genereras genom en handfull metoder, inklusive nick-translation eller slut märkning av långa DNA-produkter 1,2 och införlivandet av deoxygenin (DIG) -attached nukleotider och deras erkännande genom ett brett utbud av grupp-konjugerade antikroppar 1-3. Visualisering av euchromatic sekvenser i få eller enstaka kopia nummer kräver användning av antingen enkla, stora sonder med hög specifik aktivitet eller en cocktail av flera, mindre sonder som kollektivt förbättrar signal.
Däremot mycket repetitiva sekvenser som finns i heterokromatin, såsom satellit-DNA, är lättare mål för DNA ISH eftersom de finns normalt som tiotals till tusentals upprepningar klustrade i enstaka kromosomområden som kallas block. Transposabla element kan också varafinns i höga kopietal vid distinkt kromosom loci 2. I dessa fall, kan enkel prober med låg specifik aktivitet effektivt märka heterochromatic sekvenser på grund av deras hybridisering på multipla ställen. Prober till repetitiva sekvenser kan syntetiseras kommersiellt som korta oligonukleotider (30-50 bp) och kemiskt konjugerad med någon av flera olika fluorescerande grupper. Kartläggning repetitiva sekvenser inom heterokromatin genom genomet-sekvenseringsteknologier är svårt på grund av utmaningar som uppstått i byggställningar inom mycket repetitiva satellitblock 4-6,7. För närvarande står ISH som det mest effektiva sättet att kartlägga dessa sekvenser på en sub-kromosomnivå. Denna strategi är viktigt för att kartlägga ett stort antal repetitiva sekvenser som håller avslöjats av pågående genomet och transkriptom sekvensestudier.
Effektiviteten och enkel kartläggning repetitiva sekvenser på glidmonterade kromosomer skulle greatly förbättras genom ett förenklat protokoll för DNA ISH. Till exempel, befintliga protokoll för DNA ISH involverar flera tvättar av hybridiserade vävnader i formamidlösning 2,8, vilket bidrar väsentligt till den tid som krävs för kartläggning sekvenser och även producera stora mängder kemiskt avfall för denna kostsamma reagens. Här beskriver vi en reviderad DNA ISH metod som kringgår behovet av formamid tvättar och utnyttjar grundläggande laboratorieutrustning och reagenser. Denna metod var ursprungligen avsedd för snabb kartläggning av mycket repetitiva DNA-sekvenser i heterochromatic regioner av Drosophila larver neuroblaster genom kommersiellt syntetiserade oligonukleotider som är konjugerade med fluorescens färgämnen. Men denna metod fungerar även för att kartlägga repetitiva sekvenser genom att använda större prober syntetiserade på andra sätt 9,10 och över flera olika vävnads och kromosomtyper. Dessutom kan denna metod användas för att kart euchromatic sekvenser genom användning av längre eller multiple, korta sönder inom euchromatic sekvensen av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vävnads Dissektion och Fixering (60 min)
- För Drosophila hjärnor, placera 3: e stadiet larver i en droppe 1x PBS (fosfatbuffrad saltlösning). Välj stora 3: e INSTAR larver som aktivt kryper från ampuller eller flaskor som inte är överfulla.
- Använd en ultrafina pincett paret att ta tag i munnen krokar och en annan pincett paret att ta 2/3 ned Kroppslängden (Figur 1A, B). Dra försiktigt munnen krokar att exponera hjärnan, ventrala ganglier, spottkörtlar och en del av larver matsmältnings. Använd pincett för att separera hjärnan och ventrala ganglier (Figur 1A, B) från andra vävnader och lägg i en droppe av 1x PBT (fosfatbuffrad saltlösning med Tween) på en plast Petri platta.
- För Nasonia testis dissektioner, väljer hane 3 dagar gamla puppor (gula kroppar med röda ögon). Man Nasonia har små ving pad längder förhållande till females under puppstadium (Figur 1C).
- Håll puppan på toppen av buken nära bröstregionen med en pincett par, och med den andra pincett paret, greppa mycket distala spetsen av buken och dra ut droppformade testiklar (de kommer att omges av fett kropp som kan skakas försiktigt bort; Figur 1D). Lossa eventuella yttre kroppsdelar från testiklarna, som kommer att förhindra en korrekt kross, och lägg i en droppe av 1x PBT på en plast Petri platta.
- För varje bild, dissekera totalt fyra eller fem vävnadsprover (dvs., Drosophila larver hjärnor eller Nasonia testiklar).
OBS: Mer än fem prover kommer att leda till överfulla kärnor och kromosomer. - Eventuellt för att uppnå en viss separation av systerkromatider i euchromatic regioner av mitotiska kromosomer, behandla vävnaden med en hypoton lösning: överföra hjärnor från 1x PBT till en droppe 0,5% natriumcitrat för 5-10 (inte mer än 10) min.
NOTERA: Kolkicin (en mitotisk hämmare) kan vara till hjälp för att öka antalet mitotiska former vid metafas 11. Dock är dess användning onödig om mycket stora friska larver används, och även önskvärt eftersom det negativt kan påverka kromosom upplösning, spridning och morfologi. - Placera en droppe (~ 20 | il) av fixeringslösning (2,5% paraformaldehyd i 45% ättiksyra) på ytan av en ren Sigmacote-behandlade täckglas.
OBS: fixeringslösning färskt för varje dags användning. Fixativ lösningar som sträcker sig från 1,8 till 3,7% paraformaldehyd i 45% ättiksyra ger de bästa resultaten för FISH. Användning av andra än hjärnor eller testiklar vävnader, eller anpassa detta protokoll för immun FISH kan kräva att experimentera med olika fixativ (för en lista på olika fixativ, se 12). - Försiktigt överföra varje vävnadsprov från dissekera buffert (1x PBT) i fixativ droppen med ultrafina pincett, minimizing överföringen av dissekera buffert in i fixeringslösning. Placera vävnadsprover, så att de är jämnt åtskilda från varandra inom det fixativ droppen. Inkubera vävnaderna i fixativ under 4 min vid rumstemperatur.
- Placera försiktigt en poly-lysin-belagda slide sidan nedåt på vävnaden och täckglas. Tryck inte ner på denna punkt, men i stället låta de två att kontakta lätt så att locket glida fastnar på undersidan av bilden. Vänd bilden så att locket glida är på topp.
- Sandwich bilden / vävnad / täckglas i en hopvikt bit filterpapper. På en stabil yta, med hjälp av tummen, trycker väldigt hårt rakt ner på den position direkt ovanför täckglas. Var noga med att undvika lateral glidning av locket slip (detta kommer att orsaka smet av vävnaden).
- Sänk bilden / vävnad / täckglas i flytande kväve (se apparaten i figur 1E, F), och låt stå tills Kväve slutar kokande (längre är fine). Ta bilden och genast bryt av locket glida med en fräsch rakblad genom att ställa ett hörn av locket glida i en uppåtgående riktning (inte repa fasta vävnaden med rakblad).
- Pre-kylning bilden / vävnad / täckglas på ett block av torris, omslag glida upp, för 1-2 min före dränka i flytande kväve kommer att förhindra bilderna från sprickbildning.
- Placera omedelbart objektglaset med vävnaden i en Coplin burk fylld med 100% etanol i rumstemperatur och låt stå i minst 5 minuter (den här gången kan vara längre om det behövs).
OBS: Kall 100% etanol skulle också kunna användas. - Ta bilden med vävnad, transportera bort överflödig etanol med en Kimwipe (utan att röra den fasta vävnaden), och lämna bilden lufttorka under 1 timme.
- Gå direkt till steg 2 eller behålla diabilder torra i låg luftfuktighet luft eller i en uttorkning kammare för veckor till och med månader innan du utför hybridisering.
Figur 1: (A) En 3: e INSTAR Drosophila larv (höger), med positioner som anges för var att ta munnen krokar (betecknas med *) och 2/3 av vägen ner larverna att dissekera hjärnor; (Vänster) en schematisk vy av en larv en samma utvecklingsstadium, som visar det relativa läget för hjärnan inom larvhuvudet. (B) Hjärnan och ventrala ganglier skäras ut från en 3: e INSTAR Drosophila larv (höger) och en schematisk bild av detta vävnad (till vänster). (C) 3 dagar gamla Nasonia puppa på den gula kroppen röda ögon stadiet. (D) En testikel par dissekeras från en 3 dagar gammal Nasonia hane puppa (höger) med positioner som anger var man greppa puppan vid den bakre delen av buken (betecknade med *) och halvvägs på kroppen; (Vänster) schema föreställande manliga och kvinnliga varp puppor; manlig puppor kan särskiljas genom vingar som inte sträcker sig förbi den saggital profilen (svart pil), i motsats till honor, som har vingar som sträcker sig förbi profilen; den relativa positionen för testiklarna paret visas i den manliga puppan. (E) Apparaten-en sträng av gem-och metod (F) används för att fördjupa diabilder i ett kärl med flytande kväve. Flera paperclip strängar kan användas för samtidig nedsänkning av flera diabilder.
2. In situ hybridisering (30 min på dag 1; en hr-2,5 tim för långa sönder-på dag 2)
- Tillsätt 1 l (100 ng) av varje sond till 20 ^ il 1.1x hybridiseringsbuffert. Pipettera sond / hybridiseringsbuffert på ytan av den fasta vävnaden (undvik att röra vävnad).
- Placera försiktigt ett täckglas direkt på sonden / hybridiseringsbuffert, och se till att locket glida centreras direkt över vävnaden. Bufferten bör migrera till the ytterkant locket glida, lämnar inga luftbubblor.
OBS: Små bubblor som inte kontakta vävnaden inte innebära några problem för förfarandet. Avlägsna stora bubblor genom att försiktigt lyfta ett hörn av täckglas och försiktigt släppa tillbaka den på bilden. - Placera objektglaset / vävnad / locket glida på ytan av ett block förvärmas till 95 ° C (locket glida upp). Täck med en stor bit av aluminiumfolie för att förhindra exponering för ljus. Låt sliden inkubera vid 95 ° C under 5 min.
OBS: En typisk värmeblock med hål för rör kan vändas för att ge en plan yta att placera bilden / vävnad / täckglas. - Ta bilden, låter det svalna något tills den är varm vid beröring. Försiktigt linda en bit sträckt Parafilm runt täckglas för att täta vätskan under den.
- Placera den förseglade sliden inuti en fuktighetskammare och placera kammaren i en inkubator förvärmd till 30 ° C. Inkubera vid 30 ° C under 4 h till över natten.
- Skapa en fuktkammare från en tom spets låda eller lockförsedda Tupperware behållare med dämpade Kimwipes eller pappershanddukar som placeras vid bottnen.
OBS: Enkelsträngade DNA-oligo-prober har utformats för att vara 28 till 33 baser för att uppnå en teoretisk smälttemperatur (Tm) av 45 till 47 ° C. Dessa längd och T m intervall spegla det faktum att många repetitiva sekvenser som vi studerat är AT-rika och har därför mycket låg GC innehåll. Längre prober kommer troligen att ha högre T m-värden; Detta kan resultera i högre bakgrunds hybridisering vid standard hybridisering temperatur på 30 ° C. Således kan vissa felsökning med hybridiseringstemperaturer krävas för att uppnå bästa resultat. För att hitta den bästa hybridiseringstemperatur, ökning (eller minskning) temperaturen med 5 ° C, stegvis.
- Skapa en fuktkammare från en tom spets låda eller lockförsedda Tupperware behållare med dämpade Kimwipes eller pappershanddukar som placeras vid bottnen.
- Ta försiktigt bort Parafilm från bilden och sedan försiktigt bort locket glida genom att långsamt lyfta ett hörn. Wash sliden tre gånger för 15 minuter varje tvätt i 0,1 x SSC-buffert. Täck Coplin burk med aluminiumfolie under tvättar för att minimera ljusexponering.
- Om du inte använder en lång biotinylerad sond, gå vidare till steg 2.8.
- Om du använder en lång biotinylerad sond, torka området runt vävnad med en Kimwipe, försiktigt så att inte vidröra vävnaden själv. Placera 100 pl blockeringslösning över vävnaden och täck försiktigt med en täck, var noga med att undvika kläm bubblor. Linda glider över täckglaset med Parafilm och rum vid 37 ° C under 30 minuter.
- Försiktigt bort täckglas och torka runt vävnaden med en Kimwipe. Pipettera 100 pl rodamin-avidin utspädd 1: 1000 i SBT över vävnaden och täck försiktigt med en täck, var noga med att undvika att fånga bubblor. Linda glider över täckglaset med Parafilm och rum vid 37 ° C under 30 minuter.
- Försiktigt bort täckglas och tvätta sliden 3 gånger i 5 minuter vardera i 4x SSCT och sedan3 gånger under 5 minuter vardera i 0,1 x SSC.
OBS: Objektglasen kan tvättas under längre tidsperioder.
- Ta bilden och torka runt vävnaden med en torr Kimwipe att avlägsna överskott buffert (undvik att röra vävnad). Placera glidvävnaden sidan upp i en mörk plats för 10-15 min eller tills fukten helt försvinner.
- Pipet 11 pl Vectashield monteringsmedium (med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-DAPI) på vävnaden. Placera försiktigt en ren täckglas (ej behandlats med Sigmacote) direkt över mitten av monteringsmedium och vävnad. Den monteringsmedium bör migrera långsamt utåt mot kanterna av täckglaset.
OBS: Om monteringsmedium inte når kanten av locket glida på alla sidor, sedan ytterligare 1-2 pl av monteringsmedel kan appliceras på ett läge vid kanten av locket glida för att fylla i den nödvändiga volymen. I det här fallet, se till att torka bort överflödigt medium från glidytan innantätning. - Täta kanterna på täckglas med nagellack. Undvik att måla nagellack över vävnadsprovet.
- Placera bilden upprätt på en mörk plats och låt nagellack torka tills helt hårt (vanligtvis 30 min eller mer). Vid denna punkt, avbildar vävnaden eller förvara vid -20 ° C i upp till en vecka för senare avbildning.
Buffert / Solution Recept
10x PBS
- 80 g NaCl
- 2,0 g KCl
- 14,4 g Na 2 HPO 4
- 2,4 g KH 2 PO 4
- pH till 7,4, H2O till 1 L
1x PBT
- 5 ml 10x PBS
- 45 ml H2O
- 0,1% Tween 20
20x SSC
- 175,3 g NaCl
- 88,2 g Na-citrat
- i 800 ml H2O
- pH till 7, H2O till 1 L
4x SSCT
- 200 ml 20x SSC
- 799 ml H 2
- 0,1% Tween 20
0,1 x SSC
- 5 ml 20x SSC
- 995 ml H2O
Hybridisering mix (20 pl, modifierad från 11)
- 10 pl formamid
- 4 | il 50% dextransulfat
- 2 pl 20x SSC
- 4 ^ il H2O
SBT 8 (10 ml)
- 2 ml 20x SSC
- 0,01 g bovint serumalbumin (BSA)
- 10 | il Tween 20
- 7,9 ml H2O
Blockeringslösningen 8 (10 ml)
- 0,3 g BSA
- 10 | il Tween 20
- 2 ml 20x SSC
- 8 ml H2O
Fixeringslösning med paraformaldehyd (1 ml)
- 393,75 pl H2O (tillsätt vatten först)
- 450 pl isättika
- 156,25 | il 16% paraformaldehyd
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera denna metod, hybridiserade vi en uppsättning av små kommersiellt syntetiserade oligonukleotider som var kemiskt modifierade med fluorescerande konjugat (Figur 2) och en längre biotinylerad sond (tillverkad genom nick-translation av en PCR-produkt, fig 2B), till kromosomer från flera olika vävnader typer (se tabell 1). Målsekvensema ingår satellit upprepningar belägna i pericentromera (heterochromatic) regioner av mitotiska kromosomer från D. melanogaster larvneuroblaster (Figur 2A-C) och meiotiska kromosomer från PUPP N. vitripennis testiklar (Figur 2D). Hybridiseringarna i vart och ett av dessa fall visade diskreta bandmönster på sub-kromosomala regioner. En punkt värd att nämna är att sonden till D. melanogaster 359 bp satellit upprepning erkänner både en stor multi megabas paret blocket på X, och en mycket mindre region på kromosom 3(Figur 2A). En längre sond mot Responder satelliten upptäcker också kommande block bestående av relativt låga upprepa kopietal (~ 700 kopior, Figur 2B). Således medger denna metod visualisering av mycket små satellit block. För att hjälpa avslöja kromosomstrukturen och hjälpa till i kromosomidentifiering, kan det vara användbart att behandla kromosomerna med en hypoton lösning (beskriven i steg 1.5). Vävnaderna i figur paneler 2B och 2C behandlades med en hypoton lösning för 5 och 10 minuter, respektive. Notera separation av systerkromatider är större med längre behandling (figur 2C).
Figur 2: DNA in situ hybridisering till (A) larver neuroblast kromosomer från D. melanogaster /D. simulans hybrider, (B) och (C) larver neuroblast kromosomer från D. melanogaster behandlades med hypoton lösning (se Dissektion och Fixering steg 1), (D) meiotiska kromosomer från PUPP testikel vävnad av juvelen geting Nasonia vitripennis. I (A), gröna pilar indikerar små regioner i AATAT satellit på D. simulans 4: e kromosom, medan de gröna pilspets punkter att AATAT på D. melanogaster X-kromosom. Röd pil belyser en liten region av 359 bp satellit på D. melanogaster 3 rd kromosomen, medan den röda pilspetsen markerar 359 bp-sekvenser på X. Alla satelliter i (A) hybridiserades med korta, fluorescensmärkta oligonukleotider. I (B), motsvarar den gröna signalen till AAGAG satelliten (syntetiserade oligo) och den röda signalen är 120 bp svarar satellit (en biotinylerad prob; markerademed röda pilar). (C) Samma Responder satellit med en kort fluorescensmärkt oligo (röda pilar). I (D), den röda pilen markerar en satellit som är unikt beläget på Paternal Sex Ratio (PSR) kromosom, som är en icke-essentiell, övertaliga B kromosom finns i naturliga populationer av N. vitripennis 13, medan den gröna pilen indikerar en satellit på en av de normala kromosomer; denna hybridisering utfördes med hjälp av korta, fluorescerande oligonukleotider. Alla prober beskrivs i tabell 1. Skala bar i panelen (A) är 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sondnamn | Probe typ | Oligos | |
| AAGAG satellit | Oligo | (AAGAG) 7 | 5 '6-FAM (fluorescein) |
| AATAT satellit | Oligo | (AATAT) 6 | 5'-Cy3 |
| 359-bp-satellit | Oligo | TTT TCC AAA TTT CGG TCA TCA AAT AAT CAT | 5'-Alexa555 |
| PSR satellit | Oligo | TGT AAC TGG AAA AGG AAA ATG TAT TAT TGA | 5'-Alexa555 |
| Nasonia Autosom satellit | Oligo | AAT TTT GTG AAT TTT GGT GTC TCC ATC | 5'-Alexa633 |
| Responder | PCR | F-5 'GGA AAA TCA CCC ATT TTG ATC GC | Biotin-14-dATP |
| R-5 'CCG AAT TCA AGT ACC AGA C |
Tabell 1: Probe typer som används i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA ISH används ofta för att kartlägga specifika sekvenser till kromosomer. Vi har beskrivit ett enkelt förfarande för DNA-ISH optimerad för högt kopietal, heterochromatic sekvenser. Istället för att använda tvättar i en formamidlösning, vilket är ett krav i andra befintliga DNA ISH-protokoll, placerar vi vävnads monterade diabilder direkt på en förvärmd blocket att denaturera DNA. Denna metod kringgår användning av stora mängder formamid. Ett kritiskt steg för att producera skarpa hybridiseringssignaler är att använda nybakade fixering lösning; underlåtenhet att göra detta (eller göra ny lösning med paraformaldehyd som har varit öppen i mer än en månad) kan minska signalupplösning. En begränsning med denna metod är att, liksom för andra DNA-ISH protokollen, kan hybridiseringstemperaturen kräva optimering för att eliminera falsk hybridisering till off-målsekvenser.
Detta protokoll är känsliga-kort, ssDNA sonder konjugerade med en enda fluorophore per molekyl kan upptäcka block av upprepningar med ännu relativt låga upprepning kopietal (t.ex. ~ 700 Rsp upprepar; Figur 2C). Signaler till satellitblock med färre upprepningar kan visualiseras med korta ssDNA sonder med hjälp av en mycket känslig digitalkamera. Även om det inte visas här, är metoden också effektivt för att kartlägga icke-repetitiva sekvenser i eukromatin 10. Använda långa, biotinylerade prober ger mer flexibilitet i detektera låga kopietal sekvenser som signalen lätt kan amplifieras genom upprepade behandlingar av biotinylerad anti-avidin och rodamin-avidin 9. Att visualisera lösnummersekvenser, kan multipla sönder spänner sekvensen vara nödvändig. Alternativt kan bakteriella artificiella kromosomer (BAC) innehåller sekvensen av intresse märkas genom nick översättning eller slumpmässig priming för användning som en sond för icke-repetitiva sekvenser 10. För att kart sekvenser på en fin skala, sonder inriktning different upprepningar (var och en med olika fluoroforer) kan användas samtidigt för att erhålla ställning målsekvenser förhållande till andra upprepningar och strukturella landmärken på kromosomerna. Medan vi använder två sonder här (Figur 2A, B, D), kan antalet prober lätt ökas till tre 10 eller mer, beroende på antalet olika mikroskop fluorescens filter tillgängliga. Detta protokoll kan utvidgas till andra vävnader-vi har verifierat att protokollet fungerar bra på polytena kromosom squash från spottkörtlar. Det är tänkbart att denna metod kopplas med immunfärgning av kromatin proteiner; men det rekommenderas att immunfärgning utföras som ett första steg och därefter åter fixering med paraformaldehyd före DNA ISH i syfte att förhindra förlust antikropp under DNA ISH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) | Sigma Aldrich | ||
| Ultrafine tweezers (5 gauge) | Dumont | ||
| 22 x 22 mm cover slips | Fisher | Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear | |
| Sigmacote | Sigma | ||
| Filter paper | 75 - 150 mm | ||
| Paraffin wax paper | |||
| Heat block with thermometer | |||
| Dry incubator | |||
| Razor blades | |||
| Humidity chamber | empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes | ||
| Coplin jars | with slide grooves | ||
| Aluminum foil | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 1.5 ml microfuge tubes | |||
| Nail polish | clear or colored | ||
| P20 micropipette and plastic tips | |||
| Paperclips | 20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain | ||
| Reagents | |||
| 16% EM grade paraformaldehyde | Electron Microscopy Reagents | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Liquid nitrogen | |||
| 100% Ethanol, chemical grade | |||
| Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos | |||
| Long biotinylated probe | Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 | e.g., nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen | |
| Rhodamine-Avidin | Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 | for detection of long biotinylated probe | |
| Hybridization buffer | Recipe above | ||
| 4x SSCT | Recipe above | saline-sodium citrate + Tween | |
| 0.1x SSC | Recipe above | saline-sodium citrate | |
| Blocking solution | Recipe above | ||
| SBT | Recipe above | SSC, bovine serum albumin, Tween | |
| 1x PBT | Recipe above | phosphate-buffered saline + Tween | |
| 1x PBS | phosphate-buffered saline | ||
| Hypotonic solution | 0.5% sodium citrate in H2O | ||
| Formamide | Sigma Aldrich | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector laboratories | ||
References
- Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).
- Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
- Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).
- Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3 (12), (2002).
- Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).
- Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).
- He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).
- Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).
- Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).
- Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).
- Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
