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Neuroscience

Microglia और न्यूरॉन्स के लिए उदाहरण धुंधला: Cryosectioned चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों पर immunohistochemistry के लिए प्राइमर

Published: May 12, 2015 doi: 10.3791/52293

Abstract

Immunohistochemistry बगल में एंटीजन की उपस्थिति, स्थान, और रिश्तेदार बहुतायत का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की तकनीक है। इस प्रारंभिक स्तर प्रोटोकॉल microglia और एक उदाहरण के रूप में न्यूरोनल तत्वों के लिए मार्कर का उपयोग, अभिकर्मकों, उपकरण, और कृंतक मस्तिष्क के ऊतकों की immunohistochemical धुंधला पूरा करने के लिए आवश्यक तकनीक का वर्णन है। विशेष रूप से, इस अखबार क्रमशः Iba1 और अखिल neuronal, के लिए immunohistochemistry के माध्यम से microglia और न्यूरॉन्स की फ्लोरोसेंट दृश्य के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल है। प्रतिदीप्ति डबल लेबलिंग सही-सही प्रकार की कोशिकाओं, रिसेप्टर्स, ligands के बीच बातचीत का निरीक्षण करने के अवसर प्रदान करने, एक ही नमूना के भीतर अनेक प्रोटीन का स्थानीयकरण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, और / या एक दूसरे के साथ ही प्रोटीन सह के संबंध में बाह्य मैट्रिक्स एक एकल कोशिका के भीतर स्थानीयकरण। अन्य दृश्य तकनीकों के विपरीत, प्रतिदीप्ति immunohistochemistry के धुंधला तीव्रता में कमी आ सकती हैउचित सावधानियों लिया जाता है, जब तक धुंधला निम्नलिखित महीने के लिए सप्ताह। प्रतिदीप्ति अधिक समय कुशल है और दो या अधिक के बीच और अधिक सटीक भेदभाव के लिए अनुमति देता है के रूप में इस सीमा के बावजूद, कई अनुप्रयोगों में प्रतिदीप्ति डबल लेबलिंग, ऐसे 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (थपका) या alkaline फॉस्फेट (एपी) के रूप में विकल्प से अधिक पसंद है मार्करों। चर्चा समस्या निवारण युक्तियों और सफलता को बढ़ावा देने के लिए सलाह भी शामिल है।

Introduction

Immunohistochemistry ब्याज की एंटीजन को विशेष रूप से जो बाँध प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके ऊतक वर्गों में एंटीजन (यानी प्रोटीन) का पता लगाने के लिए एक प्रक्रिया है। वह एंटीबॉडी महान विशिष्टता 1 के साथ एंटीजन स्थानीय बनाना सकता है कि निर्धारित जब Immunohistochemistry 1934 में जे आर Marrack ने बीड़ा उठाया था। शुरू में 1942, immunohistochemistry कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग पढ़ाई के लिए इन विट्रो में पहले से कुछ विवो histochemical अध्ययन में पहली बार 4 प्रकाशित किया गया था, जिसके बाद 2,3, प्रकाशित किए गए थे। 1960 के दौरान, तीन दशकों immunohistochemical विधियों की स्थापना के बाद, एंजाइम संयुग्मित एंटीबॉडी माध्यमिक अभिकर्मकों के रूप में इस्तेमाल किया जाने लगा। इन तरीकों को एक साथ और स्वतंत्र रूप से फ्रांस और अमेरिका 5,6 में विकसित किए गए। आज, एंटीबॉडी की एक विस्तृत सरणी immunohistochemistry के अध्ययनों से 7 के लिए अनंत संभावनाओं प्रदान करता है।

"> इस पत्राचार के समग्र लक्ष्य immunohistochemical धुंधला में एक संक्षिप्त परिचय प्रदान करने के लिए है, यह इस तकनीक के लिए एक व्यापक और विस्तृत समीक्षा के होने का मतलब नहीं है उल्लिखित विधि में, दो एंटीजन के लिए immunohistochemical तकनीक microglia के लिए (मार्कर प्रस्तुत किया है और कर रहे हैं। perfused paraformaldehyde के धुंधला के लिए न्यूरॉन्स), सूक्रोज cryoprotected, cryosectioned चूहे के मस्तिष्क। immunohistochemical धुंधला पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के लिए बाध्य अविशिष्ट प्रतिजन रोकने के साथ शुरू होता है। इसके बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के ऊतकों में एक विशिष्ट प्रतिजन के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देता है। प्राथमिक एंटीबॉडी के बाद, एक और एंटीबॉडी, माध्यमिक एंटीबॉडी में कहा, एक संयुग्मित दृश्य संकेत से 8 प्राथमिक एंटीबॉडी लिंक करने के लिए लागू किया जाता है। माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी उठाया गया था जिसमें प्रजातियों के लिए विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) डोमेन लक्ष्य। माध्यमिक एंटीबॉडी संकेत amplifies प्राथमिक एंटीबॉडी के टी के फैब क्षेत्रों के बाद सेप्राथमिक एंटीबॉडी के आईजीजी डोमेन पर कई साइटों के लिए वह माध्यमिक एंटीबॉडी बाँध। या तो माध्यमिक एंटीबॉडी के एफ सी क्षेत्रों संयुग्मित एंजाइम या फ्लोरोसेंट अणु दृश्य सक्षम। उदाहरण के लिए, एक खरगोश विरोधी Iba1 प्राथमिक एंटीबॉडी Iba1 के लिए विशिष्ट एक खरगोश आईजीजी अणु है। गधा विरोधी खरगोश आईजीजी एक माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में लागू किया जाता है, यह पहचान और खरगोश विरोधी Iba1 आईजीजी के कई क्षेत्रों (चित्रा 1 देखें) के लिए बाध्य होगा। गधा एंटीबॉडी विभिन्न तरीकों से देखे जा सकते हैं। इस पत्राचार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी पहचानता है जो माध्यमिक एंटीबॉडी, संयुग्मित एक फ्लोरोफोरे का पता लगाने पर केंद्रित है। फ्लोरोसेंट immunohistochemistry के अलावा, इस तरह हेक्स्ट या DAPI के रूप में एक परमाणु दाग ​​सभी नाभिक कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1: SCHप्रत्यक्ष बनाम अप्रत्यक्ष एंटीबॉडी लेबलिंग तकनीकों का ematic प्रतिनिधित्व। एंटीबॉडी ब्याज की प्रतिजन करने के लिए बाध्य है और प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों के खिलाफ उठाया माध्यमिक एंटीबॉडी से परिलक्षित किया जा सकता है। इस तकनीक दृश्य (ए) के लिए प्रवर्धन और थपका के लिए avidin बायोटिन परिसर (एबीसी) का उपयोग किया जा सकता है या एक सीधे संयुग्मित फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी (बी)। वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक एंटीबॉडी सीधे बायोटिन या एक फ्लोरोफोरे (सी) सहित कई अलग अलग टैग, साथ संयुग्मित किया जा सकता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(थपका; आंकड़े 1 और देखना 2) immunohistochemical धुंधला के दृश्य के लिए एक वैकल्पिक तरीका 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride का उपयोग करता है। यह एक biotinylated का उपयोग करके प्रतिदीप्ति से अलग है याउज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत दिख रहा है कि एक वेग थपका कन्वर्ट करने के लिए एक एंजाइम प्रदान करता है जो घोड़े-मूली peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी,। एक एकल प्रतिजन ब्याज की है या धुंधला लंबे समय तक चलने होना आवश्यक है जहां उदाहरणों में, थपका फ्लोरोसेंट धुंधला की तुलना में अधिक उपयुक्त हो सकता है। हालांकि, थपका धुंधला दो परमाणु एंटीजन ब्याज की हैं, खासकर अगर एक से अधिक मार्करों के बीच भेदभाव के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है। थपका माल और प्रोटोकॉल संशोधनों के बारे में जानकारी के लिए, 1 टेबल से परामर्श करें। वैकल्पिक रूप से, नाइट्रो नीले tetrazolium क्लोराइड / 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-indolyl फॉस्फेट (एनबीटी / BCIP) माध्यमिक संयुग्मित एक alkaline फॉस्फेट (एपी) कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एंटीबॉडी।

चित्र 2
चित्रा 2:। निकल बढ़ाया थपका एकल लेबल चूहे के मस्तिष्क ऊतक वर्गों के प्रतिनिधि छवियों चूहा मस्तिष्क seअकेले microglia या न्यूरॉन्स के लंबे समय तक चलने के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं Iba1 (ए) और अखिल neuronal (बी) के लिए निकल बढ़ाया थपका के साथ चिह्नित कर रहे हैं जो ctions। स्केल बार 20 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक ऊतक के भीतर ब्याज की प्रतिजन की अनुमानित बहुतायत विश्लेषण किया जा रहा विचार करना चाहिए। अप्रत्यक्ष तरीकों (ऊपर वर्णित है) कम बहुतायत के साथ लक्ष्य के लिए उपयोगी होते हैं। ब्याज की प्रतिजन उच्च बहुतायत में होता है, तो सीधे तरीके से लागू किया जा सकता है। सीधे तरीके सीधे एक दृश्य संकेत करने के लिए संयुग्मित है कि एक प्राथमिक एंटीबॉडी शामिल है, और इस तरह कोई माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता है। इस विधि को धुंधला प्रक्रिया को सरल है, लेकिन अप्रत्यक्ष तरीकों से हासिल की प्रवर्धन समाप्त। एक सीधे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग भी माध्यमिक एंटीबॉडी के पार जेट समाप्तजब डबल लेबलिंग।

यह संचार Iba1 और अखिल neuronal (1 टेबल में विवरण) के साथ डबल लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल का विवरण है। Iba1 डालियां फैला हुआ, अति डालियां फैला हुआ, सक्रिय, अमीबीय, और रॉड सहित कई सक्रियण राज्यों में microglia दाग। अखिल neuronal दाग न्यूरोनल एक्सोन, डेन्ड्राइट, और सोमा। Iba1 सबसे microglia और अखिल neuronal लक्ष्य न्यूरॉन के धब्बे के बाद से, दाग के इस संयोजन microglia-न्यूरॉन बातचीत की एक व्यापक समझ पाने में उपयोगी है।

संक्षेप में, immunohistochemical धुंधला एंटीबॉडी का चयन सावधानी पर निर्भर करता है। अनुसंधान प्रश्न अधिक विशिष्ट हो जाता है, वैकल्पिक एंटीजन को उठाया एंटीबॉडी वांछित हो सकता है। एक विशिष्ट microglial सक्रियण राज्य लक्षित करने के लिए, एक नहीं बल्कि Iba1 की तुलना में, CD45 या CD68 एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए चुन सकते हैं। इसके अलावा, चूहों के साथ काम करने में, F4 / 80 आवश्यक परिणाम प्रदान कर सकते हैं। इसी तरह, न्यूरोनल तत्व विशेष रूप से एंटीबॉडी आरए के साथ लक्षित किया जा सकतानाभिक के खिलाफ ised, Synapse (पूर्व या बाद), अक्षतंतु, और विकास शंकु। इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन (डबल cortin, NeuN) वर्ष की आयु में अंतर है, जो अन्य मार्कर, और neuronal उत्थान (जीएपी-43) हैं।

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Protocol

नोट: सभी प्रक्रियाओं एरिजोना विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुपालन में किए गए। की सिफारिश की सामग्री और उपकरणों की एक सूची तालिका 1 में पाया जा सकता है।

1. ऊतक तैयारी

  1. छिड़काव
    1. सोडियम pentobarbital (25 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) की अधिक मात्रा के साथ कृंतक Euthanize, और 8 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर पूरी तरह से exsanguinated (3-5 मिनट) तक फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ transcardially छिड़कना। में गहराई से छिड़काव निर्देशों के लिए, पण एट अल 2012 9 देखते हैं।
    2. इसके तत्काल बाद / मिनट 8 मिलीलीटर की एक प्रवाह की दर में 15-20 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ perfusing द्वारा ऊतक को ठीक, पीबीएस फ्लश के बाद।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस, (Tris बफर खारा में तैयार अनुक्रम में, 15%, 30%, 30%) श्रेणीबद्ध सूक्रोज समाधान द्वारा पीछा 24 घंटा, के लिए 4% paraformaldehyde में मस्तिष्क और जगह निकालें। बाद में sucrose के समाधान के लिए ओ मस्तिष्क हस्तांतरणnly मस्तिष्क के बाद प्रत्येक समाधान में डूब गया है। नोट: आमतौर पर, प्रत्येक समाधान में 5 दिनों के ऊतक सिंक करने के लिए पर्याप्त समय है।
  2. ऊतक बर्फ़ीली और Cryosectioning
    1. ऐसे अक्टूबर यौगिक के रूप में, मध्यम एम्बेड करने में मस्तिष्क प्लेस और -35 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर isopentane में डूब। मस्तिष्क 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए फ्रीज, और फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए अनुमति दें। तापमान के लिए परिश्रम नहीं लिया जाता है तो समस्याएं पैदा कर सकते हैं; समस्या निवारण जानकारी के लिए चर्चा देखें।
    2. 20 माइक्रोन की मोटाई और -20 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर धारावाहिक राज्याभिषेक वर्गों में कटौती। सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड पर ऊतक लीजिए। मस्तिष्क वर्गों -80 डिग्री सेल्सियस पर एक ज़िप टॉप बैग और संग्रहीत लंबी अवधि में पन्नी में लपेटा एक स्लाइड बॉक्स में रखा जा सकता है। भंडारण की यह विधि हवा और ठंढ के लिए जोखिम को रोकने के लिए एक डबल सीमा बनाता है।

2. ऊतक प्रसंस्करण

नोट: उदाहरण के उपकरण और सामग्री Rधुंधला के लिए equired 3 चित्र में दिखाया जाता है। विकल्प उपलब्ध हैं, हालांकि, इन छवियों immunohistochemical धुंधला करने के लिए नए उन पूर्व क्रय करने के लिए उपयुक्त आइटम कल्पना करने के लिए सहायता करेगा।

चित्र तीन
चित्रा 3: उदाहरण आइटम immunohistochemical धुंधला के लिए आवश्यक (ए) में दिखाया गया है ब्लैक बॉक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक आदर्श आर्द्रता चैम्बर है, स्लाइड पन्नी पर बॉक्स रैप करने के लिए आवश्यकता के बिना प्रकाश से रक्षा कर रहे हैं।। सेक्शनिंग के बाद, स्लाइड ऐसे (बी) में दिखाया गया है पीले बॉक्स के रूप में एक बॉक्स में संग्रहित किया जा सकता है। पन्नी में कसकर बॉक्स लपेटकर और पूर्व फ्रीजर करने के लिए एक ज़िप टॉप बैग में रखकर फ्रीजर जला से ऊतकों के नमूनों की रक्षा में मदद करता है। स्लाइड का एक उदाहरण (अलग धुंधला (डी) में दर्शाया व्यंजन और साथ (सी), में दी गई है (एफ) में भिन्न हो सकते हैं। इस तरह के (जी) में दिखाया गया है कि के रूप में एक पेंसिल स्लाइड लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्याही चला सकते हैं के रूप में स्थायी मार्कर धुंधला और नमूना क्या है यह निर्धारित करने की क्षमता दोनों को प्रभावित करने से परहेज किया जाना चाहिए। कि (एच) में दिखाया गया है इस तरह के रूप में एक मिनी पैप कलम एक से बचाने वाली क्रीम सीमा स्लाइड्स पर तैयार किया जा सक्षम बनाता है।

  1. स्लाइड तैयारी
    1. कमरे के तापमान पर फ्रीजर और पिघलना से स्लाइड्स निकालें।
      1. वैकल्पिक: वर्गों पहले से स्लाइड से मंगाई है, तो स्लाइड बंद फ्लोटिंग से ऊतक वर्गों को रोकने में मदद करने के लिए कोई अधिक से अधिक 4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में thawed स्लाइड जगह है।
    2. एक स्लाइड रैक और इसी डिश में रखें स्लाइड।
    3. धो washes के बीच समाधान बदलते, 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में तीन बार स्लाइड। आगे इस कदम से, secti होने से बचनेons के समय की विस्तारित अवधि के लिए तरल के बिना। नोट: वर्गों के बाहर सूखी हैं, पृष्ठभूमि धुंधला बढ़ जाता है और सार्थक डेटा मज़बूती से प्राप्त नहीं किया जा सकता है।
  2. ऊतक धुंधला
    1. एक प्रकाश तंग धुंधला बॉक्स में, विआयनीकृत पानी से लथपथ प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतकों के साथ एक "आर्द्रता चैम्बर" पैदा करते हैं।
    2. दूर ऊतक वर्गों से, स्लाइड के बहुत किनारे पर एक तरल से बचाने वाली क्रीम सीमा बनाने के लिए एक छोटा पैप कलम का उपयोग करें, एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक के साथ स्लाइड के किनारों सूखी। इस सीमा तरल का meniscus और कहा कि सतह तनाव धुंधला प्रभावित नहीं करता है इसलिए ऊतक के किनारे के बीच पर्याप्त जगह सुनिश्चित करना चाहिए।
      नोट: ब्याज की एंटीबॉडी माइक्रोवेव प्रतिजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं है अगर पैप कलम से बचाने वाली क्रीम सीमा से पहले 2.1.3 के लिए लागू किया जा सकता है। पैप कलम पीबीएस में धुलाई करने से पहले लागू कर दिया गया है, तरल से बचाने वाली क्रीम सीमा की अखंडता के इस कदम पर जाँच की जानी चाहिए। सीमा में किसी भी अंतराल में भरने के लिए एक छोटा-पैप कलम का उपयोग करें।
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी किया जाता है, जिसमें एक ही प्रजाति से सीरम का प्रयोग करें। नोट: इस प्रक्रिया में, माध्यमिक एंटीबॉडी गधा में किया जाता है, और इस तरह गधा सीरम प्रयोग किया जाता है। दो या दो से अधिक विभिन्न प्रजातियों में से माध्यमिक एंटीबॉडी उपयोग किया जाता है, तो प्रत्येक प्रजातियों से सीरम शामिल हैं।
  3. स्लाइड पर पिपेट प्राथमिक एंटीबॉडी। नोट: इस धुंधला के लिए एंटीबॉडी सांद्रता 1 पर अनुकूलित किया गया है: 5000 और 1: क्रमश Iba1 और अखिल neuronal के लिए 500,। इन सांद्रता पृष्ठभूमि धुंधला के अभाव के साथ सार्थक धुंधला दिखाने के लिए पाया गया है।
    1. करने के लिए ब्लॉक समाधान पतला1% पीबीएस में सीरम और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। स्लाइड प्रति 1% सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 300 μl पिपेट। फिर, तरल पदार्थ पैप कलम के किनारे करने के लिए है सुनिश्चित करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    2. Iba1 और न ही अखिल neuronal न तो एंटीबॉडी शामिल है कि एक, अखिल neuronal एंटीबॉडी के बिना Iba1 के साथ एक है, और Iba1 बिना अखिल neuronal एंटीबॉडी के साथ एक: तीन नियंत्रण स्लाइड्स शामिल करें। हालांकि माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन गैर विशिष्ट परीक्षण करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी न आना, एक ही समाधान के साथ एक ही समय में इन स्लाइड दाग।
  4. अगली सुबह, धोने washes के बीच समाधान बदलते, 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में तीन बार स्लाइड।
  5. फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी आगे इस कदम से, काला या अंधेरे में incubated रहे हैं या तो धोने कंटेनर पन्नी और संकरण बक्से में लिपटे रहे हैं सुनिश्चित करने के द्वारा प्रकाश जोखिम को कम से कम है, इसलिए, प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं। सभी स्लाइड पर उचित माध्यमिक एंटीबॉडी पिपेट और के लिए सेते1 के एक एकाग्रता में कमरे के तापमान पर 60 मिनट: ब्लॉक समाधान में 250 एक प्रकाश तंग "नमी कक्ष 'में (कदम 2.2.3 देखें) (कदम 2.2.1 देखें)।
    1. अलग तरंग दैर्ध्य के माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें। इधर, प्राथमिक एंटीबॉडी खरगोश विरोधी Iba1 के लिए, उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में गधा विरोधी खरगोश 594 का उपयोग करें। प्राथमिक एंटीबॉडी माउस विरोधी अखिल neuronal के लिए, उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में गधा विरोधी माउस 488 का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, विरोधी खरगोश 488 और विरोधी माउस 594 का उपयोग करें।
  6. धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में तीन बार स्लाइड।
  7. वैकल्पिक: परमाणु धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    1. वास्तव में 60 सेकंड के लिए दोहरा आसुत एच 2 0 में 0.03 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में हेक्स्ट (या अन्य परमाणु दाग) में रखें।
    2. धो 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में तीन बार स्लाइड।
  8. DDH 2 0 में धो लें।
  • Coverslipping
    1. ऐसे Fluor के रूप में एक जलीय बढ़ते मध्यम के साथ coverslip स्लाइड,omount-जी या ProlongGold। एक कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर सभी बुलबुले को दूर करने के लिए ध्यान रखना।
      नोट: अन्य बढ़ते एजेंटों इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उच्च खून के माध्यम से रंगों के बीच coverslipping के दिनों के भीतर कुछ लोगों द्वारा उल्लेख किया गया है।
    2. , किनारों को सील करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश का प्रयोग करें वाष्पीकरण की वजह से बाहर सुखाने से वर्गों को रोकने। स्लाइड फ्लैट और कमरे के तापमान पर बने हुए हैं जबकि नेल पॉलिश एक प्रकाश तंग कंटेनर में सूखे की अनुमति दें, और उसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी में लपेटा एक प्रकाश तंग कंटेनर में स्टोर।
  • 3. सना हुआ ऊतक इमेजिंग

    1. माइक्रोस्कोपी
      1. नेल पॉलिश एक अंधेरे कमरे में जगह ले जाना चाहिए, जो माइक्रोस्कोपी शुरू होने से पहले कम से कम एक घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
      2. एक फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत और एक डिजिटल कैमरा लगाव के साथ एक confocal या अनुसंधान माइक्रोस्कोप का उपयोग photomicrographs मोल। साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए जोखिम निर्धारित - 405, 488, और 594 - अलग से। नोट: में गहराई इमेजिंग निर्देश खुर्दबीन निर्माता से ऑनलाइन उपलब्ध होना चाहिए।
      3. वर्गों चलती है या फोकस समायोजन के बिना हर चैनल में photomicrographs मोल। रंग में छवियों को ले लो, या एकांतर स्केल में और बाद में रंग करने के लिए परिवर्तित।
        नोट: रंग या हर चैनल से स्केल छवियों बाद के प्रसंस्करण में collated जा सकता है।
      4. वर्गों की तस्वीर विरंजन घटित होगा, जैसा कि ऊतक वर्गों समय की लंबी अवधि के लिए परिवेश प्रकाश या सूक्ष्म प्रकाश के संपर्क में नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें। इससे बचने के लिए, बढ़ती प्रकाश / लेजर तीव्रता के बजाय जोखिम समय वृद्धि हुई है।
      5. पर दिया जा रहा है के 30 मिनट के भीतर फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत को बंद कर मत करो।
        नोट: जल्दी उत्तराधिकार में और पर बंद स्रोत स्विचिंग फ्लोरोसेंट बल्ब की जीवन अवधि कम हो सकती है।

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    Representative Results

    यह धुंधला प्रोटोकॉल microglia fluorescently 594 चैनल (लाल) में लेबल है कि चूहे के मस्तिष्क ऊतक वर्गों में परिणाम और 488 चैनल में लेबल न्यूरॉन्स (हरा, चित्रा 4 देखें)। एक परमाणु दाग ​​किया गया है, तो यह 405 चैनल (नीला) में दिखाई देंगे। छवियाँ विभिन्न चैनलों में ले लिया है और तीन चैनलों के प्रत्यक्ष तुलना के लिए मढ़ा, या किसी भी दो चैनलों के बीच किया जा सकता है। कई डिजिटल अधिग्रहण सॉफ्टवेयर सुइट्स इस कार्यक्षमता शामिल हैं। यहाँ दिखाए गए Iba1 और अखिल neuronal मार्कर के साथ डबल लेबलिंग cortical परतों के पार स्पष्ट लंबे समय ठीक न्यूरोनल अनुमानों के साथ ज्यादातर डालियां फैला हुआ microglia, को दर्शाता है।

    चित्रा 4
    चित्रा 4:। मोबाइल-1 / अखिल neuronal डबल लेबलिंग कॉलम 1 के प्रतिनिधि कोंफोकल फ्लोरोसेंट छवियों Iba1 (लाल) के साथ दाग microglia से पता चलता है। न्यूरॉन्स में दिखाए जाते हैंतीसरे स्तंभ में लाल और हरे रंग चैनलों दोनों की मढ़ा छवि के साथ हरे रंग में दूसरे स्तंभ,। पहली पंक्ति में होने के कारण दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी के अभाव के विशिष्ट धुंधला की एक पूर्ण अभाव है। तीसरी पंक्ति microglia के लिए Iba1 की विशिष्टता से पता चलता है, जबकि दूसरी पंक्ति दोनों ही मामलों में पार जेट की एक पूर्ण अभाव के साथ, न्यूरोनल धुंधला के लिए अखिल neuronal प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता को दर्शाया गया है। चौथी पंक्ति microglial और neuronal धुंधला दोनों दिखा दो चैनलों का एक ओवरले के साथ डबल लेबलिंग दिखाता है। स्केल बार 50 माइक्रोन।

    स्पष्ट रूप से परिभाषित सेल शरीर और खंडित microglial / neuronal प्रक्रियाओं की कमी इसका सबूत के रूप में गरीब धुंधला परिणाम भी, (चित्रा 5) दिखाए जाते हैं। उच्च पृष्ठभूमि खराब गुणवत्ता धुंधला का संकेत है, और एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट सह स्थानीयकरण (चित्रा 5) के द्वारा देखा जा सकता है। इसके अलावा, संकेत fluorescently बाध्य streptavidi साथ एक प्रवर्धन कदम है, कमजोर हैएन शामिल किया जा सकता है। इसके बजाय कदम 2.2.6 में एक सीधे में चिह्नित फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर के, एक biotinylated माध्यमिक लागू किया जाता है। पीबीएस में धोने के बाद, streptavidin (1: पीबीएस में 1000) 1 घंटे के लिए स्लाइड पर incubated है। स्लाइड फिर धोया और एक counterstain में डूबा हुआ है या कवर फिसल रहे हैं, जहां कदम 2.2.7 पर प्रोटोकॉल पर लौटें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5:। गरीब ऊतक गुणवत्ता के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों यहाँ दिखाया microglial धुंधला (क) और neuronal धुंधला (ख) के पूर्ण अभाव की स्पष्टता की कमी में जो परिणाम गरीब ऊतक में धुंधला का एक उदाहरण है। इस न्यूरोनल धुंधला बस उच्च पृष्ठभूमि है। मढ़ा छवि (ग) सार्थक नहीं है।

    सामग्री / उपकरण का नाम कंपनी सूची की संख्या टिप्पणियाँ / विवरण
    Fisherbrand Superfrost प्लस गिलास स्लाइड फिशर साइंटिफिक 22-034-979 बढ़ते ऊतक के लिए प्रयुक्त (1.2.2)
    ओवन थर्मो वैज्ञानिक 51028112 ऊतक सुखाने के लिए प्रयुक्त (2.1.1)
    मिनी पैप कलम जीवन टेक्नोलॉजीज 00-8877 कदम 2.2.2 में प्रयुक्त
    वैज्ञानिक ऊतक टेक स्लाइड धुंधला डिश Andwin फिशर साइंटिफिक 22-149-429 Hoechst के कदम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से (2.2) धुंधला दौरान सभी washes के लिए प्रयुक्त (2.2.8)
    Kimwipes फिशर साइंटिफिक 06-666-ए सुखाने स्लाइड के लिए प्रयुक्त (2.2)
    काले धुंधला बॉक्स टेड पेला 21,050 अवरुद्ध और धुंधला चरणों के लिए (2.2) खेतों में प्रयुक्त
    सामान्य गधा सीरम फिशर साइंटिफिक 50-413-253 ब्लॉक और एंटीबॉडी ऊष्मायन (2.2) के लिए प्रयुक्त
    माउस α-पान न्यूरोनल Millipore MAB2300 प्राथमिक एंटीबॉडी (2.2.4) के लिए प्रयुक्त
    खरगोश α-Iba1 मदद की रासायनिक 019-19,741 प्राथमिक एंटीबॉडी (2.2.4) के लिए प्रयुक्त
    गधा α-खरगोश 594 जैक्सन ImmunoResearch 711-585-152 माध्यमिक एंटीबॉडी (2.2.6) के लिए प्रयुक्त
    गधा α-माउस 488 जैक्सन ImmunoResearch 715-545-150 माध्यमिक एंटीबॉडी (2.2.6) के लिए प्रयुक्त
    कैटरर पन्नी कोई एन / ए चरणों 1.2.2 और 2.3.2 में प्रयुक्त
    Fluoromount-जी दक्षिणी बायोटेक 0100-01 Coverslipping के लिए प्रयुक्त (2.2.8)
    Coverslips फिशर साइंटिफिक 12544E Coverslipping के लिए प्रयुक्त (2.2.8)
    स्पष्ट नेल पॉलिश कोई एन / ए Coverslipping के लिए प्रयुक्त (2.2.8)
    इस axio Observer.Z1 और एल एस एम 710 (लेजर स्कैनिंग, कोंफोकल) कार्ल जीस एन / ए इमेजिंग के लिए इस्तेमाल (3)
    Axioskop ए 2 कार्ल जीस एन / ए इमेजिंग के लिए इस्तेमाल (3)
    CitriSolv FisherScientific थपका प्रोटोकॉल के लिए
    एबीसी वेक्टर प्रयोगशालाओं पी-6100 थपका प्रोटोकॉल के लिए
    थपका peroxidase किट वेक्टर प्रयोगशालाओं एसके-4100 थपका प्रोटोकॉल के लिए
    Biotinylated घोड़े α-खरगोश आईजीजी वेक्टर प्रयोगशालाओं बीए-1100 थपका प्रोटोकॉल के लिए
    Biotinylated घोड़े α-माउस आईजीजी वेक्टर प्रयोगशालाओं बीए-2001 थपका प्रोटोकॉल के लिए
    30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड FisherScientific H325-500 थपका प्रोटोकॉल के लिए
    Wheaton स्लाइड रैक और धुंधला व्यंजन TedPella 21043 थपका प्रोटोकॉल के लिए
    Masterflex छिड़काव पंप और टयूबिंग कोल-परमार छिड़काव (1.1.1 और 1.1.2) के लिए प्रयुक्त
    वैज्ञानिक ऊतक टेक क्रायो अक्टूबर यौगिक Andwin (12 के मामले) फिशर साइंटिफिक 14-373-65 ऊतक ठंड के लिए प्रयुक्त (1.2.1)
    थर्मामीटर (-50 के लिए 50 सी) फिशर साइंटिफिक 15-059-228 ऊतक ठंड के लिए प्रयुक्त (1.2.1)
    Cryostat लीका CM3500S ऊतक सेक्शनिंग के लिए प्रयुक्त (1.2.2)
    2 lids के साथ डिश, प्लास्टिक धुंधला Grale वैज्ञानिक 353 प्रतिजन retrival के लिए
    20 प्लेस धुंधला रैक, स्लाइड क्षैतिज Grale वैज्ञानिक 354 प्रतिजन retrival के लिए
    माइक्रोवेव कोई एन / ए प्रतिजन retrival के लिए

    तालिका 1: माल की सूची।

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    Discussion

    इस संचार के समग्र लक्ष्य पाठक को immunohistochemistry के प्रक्रियाओं को शुरू करने की थी। इस के लिए, Iba1 और अखिल neuronal एंटीजन के साथ डबल लेबलिंग का उदाहरण microglia और perfused paraformaldehyde में न्यूरॉन्स निरीक्षण करने के लिए, सूक्रोज cryoprotected, cryosectioned चूहे के मस्तिष्क का इस्तेमाल किया गया था।

    इस तकनीक को अनंत उद्देश्यों की सेवा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। मस्तिष्क, फेफड़े, जिगर, गुर्दे और आंत तक ही सीमित रूप में इस तरह, लेकिन नहीं प्रकार के ऊतकों की एक किस्म में विभिन्न एंटीजन की एक सरणी प्रोटोकॉल को मामूली समायोजन के साथ immunohistochemically देखे जा सकते हैं। Immunohistochemistry कई मार्करों के प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है और एक भी नमूने में चार अलग अलग एंटीबॉडी अप करने के लिए शामिल कर सकते हैं। एक नमूने में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की संख्या खून के माध्यम से, फ्लोरोसेंट तरंग दैर्ध्य की ओवरलैपिंग का वर्णन करता है जो द्वारा सीमित है। फलस्वरूप रूप भीतर धुंधला संयोजन जो सीमा एक सीमित फ्लोरोसेंट प्रकाश स्पेक्ट्रम है,चिमनी नमूना (चित्रा 6 देखें)।

    चित्रा 6
    चित्रा 6:। एक विशिष्ट लेजर या फिल्टर से उत्साहित जब रंग स्पेक्ट्रम चार्ट हर फ्लोरोफोरे प्रकाश की एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य उत्सर्जन करता है। प्रभावी रूप से बहु लेबल ऊतक का उत्पादन करने के लिए, एंटीबॉडी संयुग्मित विशिष्ट fluorophores के बीच कम से कम ओवरलैप होना चाहिए। बाजार पर उपलब्ध कम से कम 10 अलग fluorophores के होते हैं, यह सभी 10 उपयोग किया जाता है तो स्पष्ट परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव नहीं है। न्यूनतम ओवरलैप इन तरंग दैर्ध्य के बीच, यदि कोई हो, के रूप में वहाँ उदाहरण के लिए, 405, 488 और 594 (ए) में तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन के साथ ट्रिपल लेबलिंग स्पष्ट लेबलिंग देना होगा। 488, 514 और 555 पर तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन का इस्तेमाल किया गया है यदि प्रत्येक एंटीबॉडी (लेजर से उत्साहित या फिल्टर अन्य के लिए मतलब हो सकता है लेकिन, जैसा कि धुंधला आसानी से व्याख्या नहीं की जाएगी

    जब डबल लेबलिंग दोनों एंटीबॉडी एक साथ लागू किया जा सकता है, यह विभिन्न प्रजातियों में की गई प्राथमिक एंटीबॉडी का चयन करने के लिए सबसे अच्छा है। एक ही प्रजाति से दो एंटीबॉडी के साथ डबल-लेबलिंग हालांकि तकनीकी रूप से कठिन है, संभव है। दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी एक ही प्रजाति में किया जाता है, धुंधला दूसरे से पहले एक प्रतिजन के लिए धुंधला पूरा करके, क्रमिक रूप से किया जाना चाहिए। एक ही प्रजाति से प्राथमिक एंटीबॉडी अलग पुलिस महानिरीक्षक वर्गों (यानी माउस आईजीजी और आईजीएम माउस या विभिन्न उपवर्गों IgG1 और IgG2a) है, तो कम मुद्दों पैदा होगा। अधिक जानकारी के लिए अतिरिक्त संदर्भ 10,11 से परामर्श करें। इस प्रोटोकॉल खरगोश विरोधी Iba1 और माउस विरोधी अखिल neuronal उपयोग करता है। यह उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए भी आवश्यक है। आईबी के साथ डबल लेबलिंग के लिएA1 और अखिल neuronal, एक स्लाइड कोई प्राथमिक एंटीबॉडी होते हैं, एक स्लाइड विरोधी Iba1 केवल और एक स्लाइड केवल विरोधी अखिल neuronal होता है (चित्रा 4 देखें) शामिल हैं। इन नकारात्मक नियंत्रण के पार जेट और झूठे धुंधला की अनुपस्थिति की पुष्टि करें। अन्य सभी स्लाइड्स दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी होते हैं। इसे पार प्रतिक्रिया हो सकती है कि माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, खरगोश विरोधी Iba1 प्राथमिक एंटीबॉडी और गधा विरोधी खरगोश 594 विरोधी माउस 488 माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों के लिए बाध्य गधा विरोधी खरगोश 594 नतीजा होगा गधा विरोधी खरगोश 594 और खरगोश विरोधी माउस 488 का उपयोग करते हुए। इस झूठी सह लेबलिंग से पैदा होगा।

    एक विशेष प्रोटीन (एंटीजन) के लिए एंटीबॉडी हमेशा एक ही नहीं कर रहे हैं। दूसरों आयल एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान बदल दिया गया है, जो एक प्रतिजन पहचान लेंगे, जबकि उदाहरण के लिए, कुछ एंटीबॉडी, जमे हुए ऊतक में मौजूद हैं जो एंटीजन के खिलाफ उठाए गए हैं। इस कारण से, विशेष रूप से ध्यान देने के लिए टी भुगतान किया जाना चाहिएवह खरीद करने से पहले विवरण पत्र एंटीबॉडी। एंटीबॉडी के लिए इरादा आवेदन सूचीबद्ध नहीं है, मुसीबत शूटिंग धुंधला प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है, या धुंधला सब पर काम नहीं कर सकते। इसके अलावा, पहले प्रकाशित डेटा धुंधला प्राप्त करने के लिए "व्यापार के गुर" की पेशकश कर सकते हैं। ध्यान दें करने के महत्व के सूक्ष्म मतभेद एंटीबॉडी के विभिन्न बैचों में देखा जा सकता है; मामूली संशोधनों के एक एंटीबॉडी के प्रत्येक फिर से आदेश के साथ किए जाने की जरूरत हो सकती है।

    अधिकांश एंटीबॉडी प्राप्ति की तारीख से 12 महीने के लिए अच्छे हैं। उत्पाद विनिर्देश शीट पर आगमन की तारीख इंगित करने के लिए सुनिश्चित करें। एंटीबॉडी धुंधला नहीं मनाया जाता है, तो एंटीबॉडी भी पुराने या गलत तरीके से संग्रहित किया जा सकता है। यह उचित भंडारण के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी का विवरण पत्र की जांच करने के लिए इसलिए भी महत्वपूर्ण है।

    इसके अतिरिक्त, कई एंटीबॉडी के लिए, अलग क्लोन उपलब्ध हैं। विभिन्न क्लोन ब्याज की प्रतिजन के विभिन्न भागों को पहचानते हैं। एदी क्लोन विभिन्न प्रसंस्करण तकनीकों के अधीन ऊतक के लिए बेहतर हो सकता है (मोम-एम्बेडेड / जमे हुए), ऊतक प्रकार, या लक्ष्य प्रजातियों लक्ष्य। एंटीबॉडी उठाया गया था जिसमें प्रजातियों के लिए विशेष ध्यान दे। एंटीबॉडी के विश्लेषण के लिए ऊतक के रूप में एक ही प्रजाति में उठाया गया है, जब उच्च पृष्ठभूमि देखा जा सकता है। ऐसे माउस किट पर एक माउस के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ इस अतिरिक्त अवरुद्ध मुकाबला करने के लिए, धुंधला के लिए आवश्यक हो सकता है। इस तकनीक को भी सेल संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। कोशिकाओं, क्लोन और विशिष्टता के फिक्सेशन अनुप्रयोगों के लिए विवरण पत्र पर जांच की जानी चाहिए।

    कुछ स्थितियों में प्रतिजन बाध्यकारी साइटों छुपा सकता है जो paraformaldehyde के पार लिंक प्रोटीन, साथ फिक्सेशन। प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रोटीन पार लिंक तोड़ने के लिए और बाध्यकारी साइटों को बेनकाब कर सकते हैं। एक प्लास्टिक धुंधला पकवान का उपयोग करने और (1 टेबल देखें), माइक्रोवेव स्लाइड डालें: प्रतिजन पुनर्प्राप्ति आवश्यक है, कदम 2.1.3 के बाद निम्नलिखित प्रोटोकॉल डालनेकड़ाई से समाधान फोड़ा नहीं होने के ख्याल रख रही 10 मिनट के लिए एक कम बिजली की सेटिंग पर साइट्रेट बफर में (विशेष शक्ति के स्तर के कारण माइक्रोवेव के बीच सेटिंग में परिवर्तनशीलता को शामिल नहीं)। वैकल्पिक रूप से, फिर 10 मिनट के लिए स्लाइड जोड़ने के लिए, एक ओवन में एक गिलास धुंधला डिश में 80 डिग्री सेल्सियस के लिए साइट्रेट बफर लाने के लिए।

    गरीब ऊतक गुणवत्ता भी धुंधला (चित्रा 5) के साथ समस्या पैदा कर सकते हैं। एक ऊतक गुणवत्ता में कोई समझौता से बचने के लिए ले जा सकते हैं सावधानियों के एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, अच्छी तरह से ठंड से पहले ऊतक में पानी विस्थापित करने के क्रम में सुक्रोज परिवर्तन के साथ मरीज और मेहनती हो। ठंड है, जब तापमान स्थिर रखने के लिए। ऊतक भी धीरे धीरे जमा देता है तो वे फ्रीज के रूप में, पानी के अणुओं के ऊतकों में छेद बनाने, विस्तार होगा। वैकल्पिक रूप से, बहुत कम तापमान पर ठंड ऊतक दरार करने के लिए प्रेरित करेगा।

    प्रोटोकॉल ब्याज की प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए थोड़ा भिन्न हो जाएगा। एक नई एंटीबॉडी के प्राप्त होने पर, एक चुनना चाहिएतदनुसार प्रोटोकॉल imize। पृष्ठभूमि (चित्रा 5) अधिक है, समय की एक लंबी अवधि के लिए अवरुद्ध प्रयास करें। वैकल्पिक रूप से, ब्लॉक समाधान के सीरम एकाग्रता बढ़ाने के लिए या एक से अधिक विभिन्न प्रजातियों जैसे बकरी और खरगोश सीरम से सीरम जोड़ें। इसके अतिरिक्त, कैसिइन गैर विशिष्ट बंधनकारी कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। (शुष्क पाउडर से बना) स्किम मिल्क कैसिइन में शामिल है और सांद्रता की एक श्रृंखला में प्रयोग किया जा सकता है (आम तौर पर, 1-5% W / वी)। दूध अकेले इस्तेमाल किया, या सीरम के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है। ब्याज की एक प्रतिजन एक intracellular मार्कर है, तो इस तरह के TritonX-100 या बीच 20 पर डिटर्जेंट कोशिका झिल्ली permeabilize को अवरुद्ध समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है। मोटे ऊतक वर्गों कुओं में ऊतक वर्गों अस्थायी बजाय स्लाइड्स पर उन्हें बढ़ते द्वारा इसी तरह कार्रवाई की जा सकती। आयल एम्बेडेड ऊतक भी इसी तरह संसाधित, लेकिन अवरुद्ध करने से पहले एक डे-वैक्सिंग कदम की आवश्यकता जा सकता है। Feldengut एट अल। 12 पतों इन दोनों पद्धतियों के।

    थपका धुंधला के साथ खाते में लेने के लिए एक और पहलू कोशिकाओं ऊतक के कई परतों कि अवधि है। यह ऐसी फैले प्रक्रिया है जो microglia के रूप में कोशिकाओं का स्पष्ट चित्र प्राप्त करने के लिए इसलिए मुश्किल है। इस समस्या को दूर करने के लिए, कुछ जांचकर्ताओं 8-12 माइक्रोन में अपने वर्गों पतले काट।

    Fluorescently लेबल ऊतक के इमेजिंग सबसे अच्छा एक confocal खुर्दबीन पर हासिल की है। Confocal सूक्ष्मदर्शी अलग और नमूना भीतर ध्यान की एक ही विमान पर कब्जा करने से सामान्य रूप से एक शोध फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ देखा धुन्ध को समाप्त। Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ, बेहतर जानकारी तेज और खून के माध्यम से फ्लोरोसेंट रंगों के बीच कम हो जाता है कर रहे हैं। मोटा नमूने सच सह स्थानीयकरण प्रदर्शित करने के लिए एक समय (z ढेर) में एक विमान imaged किया जा सकता है। एक confocal खुर्दबीन के लिए उपयोग में उपलब्ध नहीं है, जब एक शोध माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग संभव है, लेकिन जोखिम समय और प्रकाश की तीव्रता नियंत्रण रेखा होने की जरूरतछवियों के बीच ked।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides  Fisher Scientific 22-034-979 Used for tissue mounting (1.2.2)
    Oven Thermo Scientific 51028112 Used for tissue drying (2.1.1)
    Mini Pap pen Life Technologies 00-8877 Used in step 2.2.2
    Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish Fisher Scientific 22-149-429 Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) 
    Kimwipes Fisher Scientific 06-666-A Used for drying slides (2.2)
    Black Staining Box Ted Pella 21050 Used for blocking and staining steps (2.2)
    Normal Donkey Serum Fisher Scientific 50-413-253 Used for block and antibody incubation (2.2)
    Mouse α-Pan-neuronal Millipore MAB2300 Used for primary antibody (2.2.4)
    Rabbit α-Iba1 Wako Chemical 019-19741 Used for primary antibody (2.2.4)
    Donkey α-rabbit 594 Jackson ImmunoResearch 711-585-152 Used for secondary antibody (2.2.6)
    Donkey α-mouse 488 Jackson ImmunoResearch 715-545-150 Used for secondary antibody (2.2.6)
    Caterer's foil Any N/A Used in steps 1.2.2 and 2.3.2
    Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Used for coverslipping (2.2.8)
    Coverslips Fisher Scientific 12544E Used for coverslipping (2.2.8)
    Clear Nail Polish  Any N/A Used for coverslipping (2.2.8)
    Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) Carl Zeiss N/A Used for imaging (3)
    Axioskop A2 Carl Zeiss N/A Used for imaging (3)
    CitriSolv  FisherScientific For DAB protocol
    ABC Vector Laboratories PK-6100 For DAB protocol
    DAB Peroxidase kit Vector Laboratories SK-4100 For DAB protocol
    Biotinylated horse α-rabbit IgG Vector Laboratories BA-1100 For DAB protocol
    Biotinylated horse α-mouse IgG Vector Laboratories BA-2001 For DAB protocol
    30% Hydrogen Peroxide FisherScientific H325-500 For DAB protocol
    Wheaton slide racks and staining dishes TedPella 21043 For DAB protocol
    Masterflex perfusion pump and tubing Cole-Parmer Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)
    Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) Fisher Scientific 14-373-65 Used for tissue freezing (1.2.1)
    Thermometer (-50 to 50 C)  Fisher Scientific 15-059-228 Used for tissue freezing (1.2.1)
    Cryostat Leica  CM3500S Used for tissue sectioning (1.2.2)
    Staining Dish, Plastic with 2 Lids Grale Scientific 353 For antigen retrival
    20 Place Staining Rack, Slides Horizontal Grale Scientific 354 For antigen retrival
    Microwave Any N/A For antigen retrival

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    References

    1. Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
    2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
    3. Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
    4. Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
    5. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
    6. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
    7. Cuello, A. C. Immunohistochemistry. , Wiley. (1983).
    8. Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. Junqueira's basic histology : text and atlas. , Thirteenth edition / edn, (2013).
    9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
    10. Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).
    11. Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
    12. Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).

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    तंत्रिका विज्ञान अंक 99 immunohistochemistry Iba1 अखिल neuronal प्रतिदीप्ति डबल लेबलिंग microglia न्यूरॉन चूहा एंटीबॉडी
    Microglia और न्यूरॉन्स के लिए उदाहरण धुंधला: Cryosectioned चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों पर immunohistochemistry के लिए प्राइमर
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    Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F.,More

    Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J. Vis. Exp. (99), e52293, doi:10.3791/52293 (2015).

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