Abstract
Immunohistochimie est une technique largement utilisée pour détecter la présence, l'emplacement et l'abondance relative des antigènes in situ. Ce protocole de niveau d'introduction décrit les réactifs, le matériel et les techniques nécessaires pour compléter la coloration immunohistochimique du tissu cérébral des rongeurs, en utilisant des marqueurs pour les microglies et les éléments neuronaux comme un exemple. Plus précisément, ce document est un protocole étape par étape pour la visualisation fluorescente des microglies et les neurones via immunohistochimie pour Iba1 et Pan-neuronale, respectivement. Fluorescence double marquage est particulièrement utile pour la localisation de multiples protéines dans le même échantillon, en fournissant la possibilité d'observer avec précision les interactions entre les types de cellules, des récepteurs, des ligands, et / ou de la matrice extracellulaire par rapport à l'autre ainsi que des protéines co- localisation à l'intérieur d'une seule cellule. Contrairement à d'autres techniques de visualisation, la fluorescence immunohistochimie intensité de la coloration peut diminuer enles semaines ou mois suivants coloration, à moins que des précautions appropriées soient prises. Malgré cette limitation, dans de nombreuses applications fluorescence double marquage est préférée à d'autres solutions telles que la 3,3'-diaminobenzidine (DAB) ou la phosphatase alcaline (AP), en tant que fluorescence est plus efficace du temps et permet la différenciation plus précise entre deux ou plusieurs marqueurs. La discussion inclut des trucs et conseils pour favoriser la réussite de dépannage.
Introduction
L'immunohistochimie est un procédé pour la détection d'antigènes (par exemple des protéines) dans des coupes de tissu en utilisant des anticorps primaires qui se lient spécifiquement à des antigènes d'intérêt. L'immunohistochimie a été lancée par JR Marrack en 1934 quand il a déterminé que les anticorps peuvent localiser des antigènes avec une grande spécificité 1. A partir de 1942, une partie de la première des études in vitro utilisant des anticorps fluorescents pour visualiser immunohistochimie ont été publiés 2,3, après quoi la première étude in vivo histochimique a été publié 4. Au cours des années 1960, trois ans après le début de méthodes immunohistochimiques, des anticorps conjugués enzymatiques ont commencé à être utilisés comme réactifs secondaires. Ces méthodes ont été développées simultanément et indépendamment en France et aux Etats-Unis 5,6. Aujourd'hui, un large éventail d'anticorps offre des possibilités infinies pour les études d'immunohistochimie 7.
"> L'objectif global de cette correspondance est de fournir une brève introduction dans la coloration immunohistochimique; il est pas censé être un examen complet et exhaustif de cette technique dans le procédé décrit, des techniques d'immunohistochimie pour deux antigènes sont présentés (marqueurs de la microglie et. neurones) pour la coloration de paraformaldehyde perfusé, le saccharose cryoprotégés, le cerveau de rat cryosectioned. La coloration immunohistochimique commence par bloquer la liaison pour réduire la coloration de fond antigène non spécifique. Ensuite, l'incubation avec l'anticorps primaire permet de se lier à un antigène spécifique dans le tissu. À la suite de l'anticorps primaire, un autre anticorps, appelé anticorps secondaire, est appliquée pour lier l'anticorps primaire à un signal de visualisation conjugué 8. L'anticorps secondaire cible de l'immunoglobuline G (IgG) domaine spécifique de l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été soulevée. L'anticorps secondaire amplifie le signal de l'anticorps primaire depuis les régions Fab de til anticorps secondaire se lient à des sites multiples sur le domaine IgG de l'anticorps primaire. Chacune des enzymes ou des molécules fluorescentes conjuguées aux régions F c de l'anticorps secondaire permettent la visualisation. Par exemple, un anticorps primaire anti-lapin Iba1 est une molécule d'IgG de lapin spécifique pour Iba1. Lorsque âne anti-IgG de lapin est appliqué comme un anticorps secondaire, on reconnaître et se lier à de multiples régions de l'anticorps de lapin anti-IgG Iba1 (voir figure 1). L'anticorps peut être visualisé âne par divers procédés. Cette correspondance met l'accent sur la détection d'un fluorophore conjugué à l'anticorps secondaire qui reconnaît l'anticorps primaire, pour la visualisation par microscopie fluorescente. En immunohistochimie fluorescent, un colorant nucléaire Hoechst ou comme DAPI peut être utilisée pour visualiser tous les noyaux.
Figure 1: Schreprésentation hématique des vs. directe des techniques de marquage d'anticorps indirecte. anticorps se lient à l'antigène d'intérêt et peut être amplifié par des anticorps secondaires dirigés contre les espèces des anticorps primaires. Cette technique peut être effectuée en utilisant le complexe avidine-biotine (ABC) pour l'amplification et pour la visualisation DAB (A), ou un anticorps secondaire fluorescent directement conjugué (B). Alternativement, des anticorps primaires peuvent être directement conjugués avec de nombreuses balises différentes, y compris la biotine ou un fluorophore (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Une méthode alternative pour la visualisation de la coloration immunohistochimique utilise le 3,3'-diaminobenzidine (DAB; voir les figures 1 et 2). Cela diffère de la fluorescence en utilisant un ou biotinyléla peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à un anticorps secondaire, qui fournit une enzyme pour convertir DAB à un précipité qui est visible en microscopie à fond clair. Dans les cas où un seul antigène est d'intérêt ou de coloration est appelé à être de longue durée, DAB peut être plus approprié de coloration fluorescente. Cependant, DAB coloration est pas bien adapté pour la différenciation entre des marqueurs multiples, en particulier si deux antigènes nucléaires présentent un intérêt. Pour plus d'informations sur les matériaux de DAB et les modifications de protocole, consulter le tableau 1. En variante, un groupe nitro bleu de chlorure de tétrazolium / 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP) peut être utilisée pour visualiser une phosphatase alcaline (AP) conjugué secondaire anticorps.
Figure 2:. Des images représentatives de sections individuelles marqué DAB nickel améliorée rat tissus du cerveau de rat cerveau tilisezctions qui sont étiquetés avec des DAB de nickel-amélioré pour Iba1 (A) et Pan-neuronale (B) permettre une analyse de longue durée de la microglie ou neurones seul. Barre d'échelle 20 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Il faut considérer l'abondance estimée de l'antigène d'intérêt dans le tissu analysé. Les méthodes indirectes (comme décrit ci-dessus) sont utiles pour cibles avec une faible abondance. Lorsque l'antigène d'intérêt est en grande abondance, méthodes directes peuvent être appliquées. Les méthodes directes impliquent un anticorps primaire qui est directement conjugué à un signal de visualisation, et donc pas d'anticorps secondaire est exigée. Cette méthode simplifie le processus de coloration, mais élimine l'amplification réalisée par des méthodes indirectes. Utilisation d'un anticorps primaire conjugué directement élimine également la réactivité croisée des anticorps secondaireslors d'un double étiquetage.
Cette communication détaille le protocole pour double marquage avec Iba1 et Pan-neuronales (détails dans le tableau 1). Iba1 colore la microglie dans de nombreux états d'activation, notamment ramifiée, hyper-ramifié, activé, amoeboid, et la tige. Taches Pan-neuronales neuronale axones, dendrites, et Soma. Depuis Iba1 taches les plus microglie et les objectifs pan-neuronales le neurone, cette combinaison de taches est utile à acquérir une large compréhension des interactions neurone-microglie.
En somme, la coloration immunohistochimique repose sur la sélection rigoureuse des anticorps. Comme la question de la recherche devient plus spécifique, des anticorps dirigés contre les antigènes de rechange peuvent être souhaités. Pour cibler un état d'activation de la microglie spécifique, on peut choisir d'utiliser CD45 ou CD68, plutôt que Iba1. En outre, en travaillant avec des souris, F4 / 80 peut fournir les résultats nécessaires. De même, les éléments neuronaux peuvent être spécifiquement ciblées avec des anticorps raised contre le noyau, synapse (avant ou après), axone, et le cône de croissance. En outre, il ya d'autres marqueurs qui différencient l'âge du neurone (Double-Cortin, NeuN), et la régénération neuronale (GAP-43).
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) de l'Université de l'Arizona. Une liste des matériaux et équipements recommandés peut être trouvé dans le tableau 1.
1. Préparation des tissus
- Perfusion
- Euthanasier rongeur avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, IP), et perfuser transcardiaque avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) jusqu'à complètement exsangue (3-5 min) à un débit de 8 ml / min. Pour obtenir des instructions de perfusion en profondeur, voir Gage et al 2012 9.
- Immédiatement après PBS chasse d'eau, réparer les tissus par perfusion avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 15-20 min à un débit de 8 ml / min de débit.
- Retirer le cerveau et dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 heures, suivie de solutions de saccharose graduées (15%, 30%, 30%, en séquence, préparé dans une solution saline tamponnée tris) à 4 ° C. Transférer le cerveau postérieur à la solution de saccharose oeuls après que le cerveau a sombré dans chaque solution. Note: Habituellement, 5 jours dans chaque solution est suffisamment de temps pour les tissus de couler.
- La congélation de tissus et Cryosectioning
- Placez le cerveau en milieu d'inclusion, tel que le composé PTOM et plonger dans l'isopentane à une température de -35 ° C. Laisser le cerveau de geler pendant un minimum de 10 min, puis stocker à -80 ° C. Des problèmes peuvent survenir si la diligence à la température ne sont pas prises; s'il vous plaît voir la discussion des informations de dépannage.
- Couper coupes sériées coronales d'une épaisseur de 20 um et une température de -20 ° C. Prélever des tissus sur des lames chargées positivement. coupes de cerveau peuvent être placés dans une boîte de diapositives enveloppé dans une feuille dans un sac zip-top et à long terme conservés à -80 ° C. Cette méthode de stockage crée une double frontière pour prévenir l'exposition à l'air et au gel.
2. Traitement des tissus
NOTE: Exemple équipements et matériaux rbligatoire pour la coloration sont présentés dans la figure 3. Des alternatives sont disponibles, cependant, ces images vont aider les nouveaux à la coloration immunohistochimique de visualiser les éléments appropriés avant d'acheter.
Figure 3: Exemple éléments nécessaires pour la coloration immunohistochimique La boîte noire montré en (A) est une chambre d'humidité idéal pour immunofluorescence, sous forme de diapositives sont protégés de la lumière sans la nécessité d'envelopper la boîte sur une feuille.. Après sectionnement, diapositives peuvent être stockés dans une boîte comme la boîte jaune montré en (B). Envelopper la boîte hermétiquement dans du papier et placer dans un sac zip-top avant la congélation permet de protéger les échantillons de tissus de brûlures de congélation. Un exemple de lames est donnée en (C), avec des plats différents de coloration décrits dans (D) et (E (F), cependant 1.2 lamelles épaisses fournissent des résultats d'imagerie de belles sur la plupart des microscopes droits et confocale. Un crayon telle que celle représentée dans (G) peut être utilisé pour marquer les diapositives. Marqueurs permanents doivent être évités car l'encre peut fonctionner, affectant à la fois la coloration et la capacité de déterminer ce que l'échantillon est. Un mini stylo pap tel que représenté dans (H) permet une frontière imperméable à tirer sur des lames.
- Préparation de lames
- Retirer les lames du congélateur et décongeler à température ambiante.
- Facultatif: Si sections ont déjà flotté à partir de diapositives, placez diapositives décongelés dans un four à 60 ° C pendant plus de 4 heures pour aider à prévenir des coupes de tissus de flotter hors diapositives.
- Placer les lames dans un rack de diapositives et plat correspondant.
- Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 min de chaque solution entre les lavages changer. De ce pas en avant, éviter d'avoir sections sans liquide pendant de longues périodes de temps. Note: Si les sections se dessèchent, la coloration de fond est augmentée et des données significatives ne peut pas être obtenue de manière fiable.
- Retirer les lames du congélateur et décongeler à température ambiante.
- La coloration des tissus
- Dans une boîte de coloration étanche à la lumière, de créer une «chambre d'humidité" avec des tissus non pelucheux trempé avec de l'eau déminéralisée.
- Sécher les bords de la lame avec un tissu non pelucheux, utiliser un mini stylo pap à faire une bordure de répulsif des liquides à l'orée de la diapositive, loin des coupes de tissus. Cette frontière devrait garantir suffisamment d'espace entre la surface du bain de liquide et le bord du tissu de telle sorte que la tension de surface ne modifie pas la coloration.
NOTE: Le répulsif frontière stylo pap peut être appliqué avant la 2.1.3 si les anticorps d'intérêt ne nécessitent pas de micro-ondes récupération d'antigène. Si la plume de Pap a été appliquée avant le lavage en PBS, l'intégrité de la frontière imperméable au liquide doit être vérifiée à ce stade. Utilisez un stylo mini-pap pour combler les lacunes dans la frontière. - Utilisation sérum de la même espèce dans laquelle l'anticorps secondaire est effectué. Remarque: Dans cette procédure, les anticorps secondaires sont fabriqués en âne, et donc sérum âne est utilisé. Si des anticorps secondaires à partir de deux ou plusieurs espèces différentes sont utilisées, y compris le sérum de chaque espèce.
- Pipette anticorps primaire sur des lames. Remarque: Les concentrations d'anticorps pour cette coloration ont été optimisés au 1: 5000 et 1: 500 pour Iba1 et Pan-neuronale, respectivement. Ces concentrations ont été trouvées pour montrer coloration significative avec une absence de coloration de fond.
- Diluer la solution de bloc1% de sérum dans du PBS et ajouter des anticorps primaires. Pipeter 300 ul de solution d'anticorps primaire dans 1% de sérum par lame. Encore une fois, d'assurer le fluide est au bord de la plume de Papanicolaou. Incuber une nuit à 4 ° C.
- Inclure trois lames de contrôle: l'une qui contient des anticorps ni Iba1 ni Pan-neuronales, une avec Iba1 sans anticorps pan-neuronal, et l'un avec l'anticorps pan-neuronal sans Iba1. Colorer ces diapositives dans la même série avec les mêmes solutions, cependant omettre les anticorps primaires pour tester la liaison non spécifique des anticorps secondaires.
- Le lendemain matin, laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 min de chaque solution entre les lavages changer.
- Anticorps fluorescents sont sensibles à la lumière, donc, de ce pas en avant, de minimiser l'exposition de lumière en veillant à conteneurs de lavage sont enveloppés dans des feuilles et d'hybridation boîtes sont soit noir ou incubées dans l'obscurité. Introduire à la pipette les anticorps secondaires appropriés sur toutes les diapositives et incuber60 min à température ambiante à une concentration de 1: 250 dans une solution de bloc (voir l'étape 2.2.3) dans une "chambre d'humidité" étanche à la lumière (voir l'étape 2.2.1).
- Utilisez Anticorps secondaires de différentes longueurs d'onde. Ici, pour le lapin d'anticorps primaire anti-Iba1, utiliser âne de lapin anti-594 comme anticorps secondaire approprié. Pour la souris de l'anticorps primaire anti-pan-neuronal, utiliser âne anti-souris 488 comme anticorps secondaire approprié. Alternativement, utiliser anti-lapin 488 et 594 anti-souris.
- Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacun.
- Facultatif: effectuer une coloration nucléaire.
- Place à Hoechst (ou autre colorant nucléaire) à une concentration de 0,03 pg / ml dans le double H 2 0 distillée pendant exactement 60 secondes.
- Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacun.
- Laver à ddH 2 0.
- Lames couvre-objet avec un milieu de montage aqueux, tels que Fluoromount-G ou ProlongGold. Prendre soin d'enlever toutes les bulles à l'aide d'un coton-tige.
Note: D'autres agents de montage pourraient être utilisés, si haut purge à travers entre les colorants a été noté par certains au sein de jours de lamelles. - Utilisez vernis à ongles transparent pour sceller les bords, ce qui empêche les sections du dessèchement dû à l'évaporation. Laisser sécher le vernis à ongles dans un récipient étanche à la lumière tout en diapositives restent à plat et à la température ambiante, puis stocker dans un récipient étanche à la lumière enveloppé dans une feuille à 4 ° C.
3. Imagerie Tissue Stained
- Microscopie
- Laisser le vernis à ongles à sécher pendant au moins une heure avant le début de la microscopie, qui devrait avoir lieu dans une pièce sombre.
- Acquérir photomicrographies utilisant un microscope confocal ou d'un microscope de recherche avec une source de lumière fluorescente et un module appareil photo numérique. Utilisation du logiciel d'accompagnement, régler l'exposition pour chaque longueur d'onde - 405, 488, et 594 - séparément. Remarque: en profondeur des instructions d'imagerie devraient être disponibles en ligne à partir du fabricant de microscope.
- Acquérir photomicrographies dans chaque canal sans déplacer les sections ou d'ajuster la mise au point. Prendre des images en couleur, en niveaux de gris ou en alternance et de les convertir à la couleur par la suite.
Remarque: couleur ou en niveaux de gris de chaque canal peuvent être rassemblés dans le post-traitement. - Veiller à ce que les coupes de tissus ne sont pas exposés à la lumière ambiante ou la lumière microscopique pendant de longues périodes de temps, comme photo-blanchiment des sections aura lieu. Pour éviter cela, augmenter le temps d'exposition plutôt que d'augmenter l'intensité lumineuse / laser.
- Ne coupez pas la source de lumière fluorescente dans les 30 minutes d'être allumé.
Note: Changement de la source sur et en dehors en succession rapide peut diminuer la durée de vie de l'ampoule fluorescente.
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Representative Results
Ce protocole de coloration résultats dans des coupes de tissus de cerveau de rat qui ont microglie marquées par fluorescence dans le canal 594 (rouge) et neurones marqués dans le canal 488 (vert; voir la figure 4). Si un colorant nucléaire a été fait, il apparaîtra dans le canal 405 (bleu). Les images peuvent être prises dans les différents canaux et superposées pour une comparaison directe des trois canaux, ou entre deux chaînes. De nombreuses suites logicielles d'acquisition numériques incluent cette fonctionnalité. Double-marquage avec Iba1 et Pan-neuronale marqueur montré ici démontre la microglie essentiellement ramifiée, avec de longues projections neuronales fines évidentes à travers les couches corticales.
Figure 4:. Images fluorescentes confocale représentatifs de Iba-1 / Pan-neuronale double étiquetage Colonne 1 montre la microglie colorées avec Iba1 (rouge). Les neurones sont présentées dans lala seconde colonne en vert, avec l'image superposée de deux canaux rouge et vert dans la troisième colonne. Dans la première rangée, il ya une absence totale de coloration spécifique en raison de l'absence de deux anticorps primaires. La deuxième ligne représente la spécificité de l'anticorps primaire Pan-neuronale pour la coloration neuronale, alors que la troisième rangée présente une spécificité de Iba1 pour la microglie, avec une absence totale de réactivité croisée dans les deux cas. La quatrième ligne illustre double marquage avec une superposition des deux canaux montrant à la fois la microglie et coloration neuronale. Barre d'échelle 50 um.
Résultats de la coloration pauvres sont également présentés (Figure 5), comme en témoigne l'absence de corps cellulaires clairement définis et des processus neuronaux / microgliales fragmentés. Haut-fond est indicatif d'une mauvaise qualité de la coloration, et peut être vu par la co-localisation non spécifique d'anticorps (voir la figure 5). En outre, si le signal est faible, une étape d'amplification avec streptavidi lié par fluorescencen peut être incorporé. Au lieu d'utiliser un anticorps secondaire fluorescent directement marqués à l'étape 2.2.6, un secondaire biotinylé est appliquée. Après lavage dans du PBS, de la streptavidine (1: 1000 dans du PBS) est mis en incubation sur les lames pendant 1 heure. Retour à protocole à l'étape 2.2.7 où lames sont ensuite lavées et trempées dans une contre-coloration ou le couvercle glissé.
Figure 5:. Images fluorescentes représentatifs de la qualité des tissus pauvres Montré ici est un exemple de coloration en mauvais tissus qui se traduit par un manque de clarté de la coloration de la microglie (a) et l'absence totale de coloration neuronale (b). Cette coloration neuronale est tout simplement bruit de fond élevé. L'image superposée (c) n'a pas de sens.
| Nom du Matériel / Equipement | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires / Description |
| Fisherbrand Superfrost Plus Plaques de verre | Fisher Scientific | 22-034-979 | Utilisé pour les tissus de montage (1.2.2) |
| Four | Thermo Scientific | 51028112 | Utilisé pour le séchage des tissus (2.1.1) |
| Mini stylo Pap | Life Technologies | 00-8877 | Utilisé dans l'étape 2.2.2 |
| Andwin Tissue-Tek scientifique Glisser coloration Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Utilisé pour tous les lavages pendant la coloration (2.2), ainsi que l'étape Hoechst (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Utilisé pour les diapositives de séchage (2.2) |
| Noir coloration Box | Ted Pella | 21050 | Utilisé pour blocage et de coloration étapes (2.2) |
| Sérum normal âne | Fisher Scientific | 50-413-253 | Utilisé pour le bloc et l'anticorps incubation (2.2) |
| Souris α-Pan-neuronale | Millipore | MAB2300 | Utilisé pour l'anticorps primaire (2.2.4) |
| Lapin α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Utilisé pour l'anticorps primaire (2.2.4) |
| Âne α-Lapin 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Utilisé pour l'anticorps secondaire (2.2.6) |
| Âne α-souris 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Utilisé pour l'anticorps secondaire (2.2.6) |
| Fleuret Traiteur | Tout | N / A | Utilisé dans les étapes 1.2.2 et 2.3.2 |
| Fluoromount G- | Southern Biotech | 0100-01 | Utilisé pour lamelles (2.2.8) |
| Lamelles | Fisher Scientific | 12544E | Utilisé pour lamelles (2.2.8) |
| Vernis à ongles | Tout | N / A | Utilisé pour lamelles (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 et LSM 710 (balayage laser, confocale) | Carl Zeiss | N / A | Utilisés pour l'imagerie (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N / A | Utilisés pour l'imagerie (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | Pour le protocole DAB | |
| Abc | Vector Laboratories | PK-6100 | Pour le protocole DAB |
| Kit DAB peroxydase | Vector Laboratories | SK-4100 | Pour le protocole DAB |
| Biotinylés cheval α-IgG de lapin | Vector Laboratories | BA-1100 | Pour le protocole DAB |
| Biotinylés cheval α-IgG de souris | Vector Laboratories | BA-2001 | Pour le protocole DAB |
| 30% de peroxyde d'hydrogène | FisherScientific | H325-500 | Pour le protocole DAB |
| Wheaton racks de diapositives et des plats de coloration | TedPella | 21043 | Pour le protocole DAB |
| Masterflex pompe de perfusion et de tubes | Cole-Parmer | Utilisé pour perfusion (1.1.1 et 1.1.2) | |
| Andwin scientifique CRYO-OCT composé Tissue-Tek (cas de 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Utilisé pour la congélation de tissu (1.2.1) |
| Thermomètre (-50 à 50 ° C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Utilisé pour la congélation de tissu (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Utilisé pour la coupe de tissu (1.2.2) |
| La coloration vaisselle, plastique avec 2 couvercles | Grale scientifique | 353 | Pour antigène retrival |
| 20 Place coloration rack, glissières horizontales | Grale scientifique | 354 | Pour antigène retrival |
| Micro-onde | Tout | N / A | Pour antigène retrival |
Tableau 1: Liste des matériaux.
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Discussion
L'objectif global de cette communication était d'introduire des procédures d'immunohistochimie pour le lecteur. Pour cela, l'exemple de double marquage avec Iba1 et antigènes Pan-neuronales pour observer les microglies et les neurones dans paraformaldéhyde perfusé, le saccharose cerveau cryoprotégés, rat cryosectioned a été utilisé.
Cette technique peut être adaptée pour servir des fins interminables. Un tableau d'antigènes différents dans une variété de types tels que, mais sans s'y limiter tissus du cerveau, du poumon, du foie, des reins et de l'intestin peut être visualisée par immunohistochimie avec des ajustements mineurs au protocole. Immunohistochimie permet la comparaison directe de plusieurs marqueurs et peut englober jusqu'à quatre anticorps différents dans un seul échantillon. Le nombre d'anticorps utilisés dans un échantillon est limitée par la purge de passage, qui décrit le chevauchement des longueurs d'onde fluorescentes. Il existe un spectre de lumière fluorescente limité, ce qui limite par conséquent les combinaisons de coloration à l'intérieur commeéchantillon Ingle (voir Figure 6).
Lorsque double étiquetage, il est préférable de choisir des anticorps primaires effectuées dans différentes espèces, comme les deux anticorps peuvent être appliquées simultanément. Double-marquage avec deux anticorps de la même espèce est possible, bien que techniquement difficile. Lorsque les deux anticorps primaires sont réalisés dans la même espèce, la coloration doit être effectuée de manière séquentielle, en remplissant la coloration pour un antigène avant la seconde. Moins de problèmes surgiront si les anticorps primaires de la même espèce ont différentes classes d'Ig (c.-à-IgG et IgM de souris de la souris ou de différentes sous-classes IgG1 et IgG2a). Pour plus de détails consulter des références supplémentaires 10,11. Ce protocole utilise de lapin anti-Iba1 et souris anti-Pan-neuronale. Il est également nécessaire d'inclure des témoins négatifs appropriés. Pour double marquage avec Iba1 et Pan-neuronale, une diapositive contient pas d'anticorps primaires, une diapositive contient anti-Iba1 seulement et une diapositive contient anti-Pan-neuronale seulement (voir Figure 4). Ces contrôles négatifs confirment l'absence de réactivité croisée et faux coloration. Tous les autres lames contiennent à la fois des anticorps primaires. Il est également important d'éviter d'utiliser des anticorps secondaires qui peuvent réaction croisée. Par exemple, à l'aide d'âne anti-lapin 594 et de lapin anti-souris 488 se traduirait par âne anti-lapin de liaison 594 à la fois à l'anticorps primaire de lapin anti-Iba1 et l'âne anti-lapin anti-souris 594 488 d'anticorps secondaire. Cela créerait co-étiquetage faux. Anticorps pour une protéine particulière (antigène) ne sont pas toujours les mêmes. Par exemple, des anticorps sont dirigés contre des antigènes qui sont présents dans les tissus congelés, tandis que d'autres reconnaissent un antigène qui a été modifiée au cours du processus d'enrobage de paraffine. Pour cette raison, une attention particulière devrait être accordée à til anticorps fiche technique avant de les acheter. Si l'application envisagée pour l'anticorps est pas répertorié, le dépannage peut être nécessaire pour obtenir une coloration ou coloration peut ne pas fonctionner du tout. En outre, les données publiées précédemment peuvent offrir des «trucs du métier» pour obtenir la coloration. Important de noter est que les différences subtiles peuvent être vus dans les différents lots d'anticorps; peuvent avoir besoin d'être fait à chaque ordre nouveau d'un anticorps de légères modifications. La plupart des anticorps sont bons pour 12 mois à compter de la date de réception. Assurez-vous d'indiquer la date d'arrivée sur la feuille de spécifications du produit. Si la coloration des anticorps est pas respecté, l'anticorps peut être trop vieux ou stocké correctement. Il est donc également important de vérifier la fiche technique de chaque anticorps pour un entreposage correct. De plus, pour de nombreux anticorps, différents clones sont disponibles. Différents clones reconnaissent les différentes parties de l'antigène d'intérêt. UNEclone donné peut-être mieux pour les tissus soumis à différentes techniques de traitement (cire embarqué / congelé), cibler le type de tissu, ou des espèces cibles. Portez une attention particulière à l'espèce dans laquelle l'anticorps a été soulevée. Lorsque l'anticorps est soulevée dans la même espèce que le tissu pour l'analyse, bruit de fond élevé peut être observé. Pour combattre cela, le blocage supplémentaire avec des kits disponibles dans le commerce tel qu'une souris sur kit de souris, peuvent être nécessaires pour la coloration. Cette technique peut également être adapté à la culture cellulaire. Fixation des cellules, clone et la spécificité doivent être vérifiés sur la feuille de spécifications pour les applications. Fixation avec paraformaldéhyde liens croisés des protéines, qui pourraient dissimuler des sites de liaison de l'antigène dans certains conditions. restauration des antigènes protéiques peut briser des liens croisés et d'exposer les sites de liaison. Si la récupération de l'antigène est nécessaire, insérez le protocole suivant après l'étape 2.1.3: en utilisant un plat de coloration plastique et insérer (voir le tableau 1), diapositives à micro-ondesdans un tampon de citrate sur un réglage de faible puissance pendant 10 minutes, en prenant soin de ne pas laisser bouillir la solution rigoureuse (niveaux de puissance spécifiques ne figurent pas en raison de la variabilité des paramètres entre les micro-ondes). En variante, apporter tampon citrate à 80 ° C dans une capsule de coloration du verre dans un four, puis ajouter les lames pendant 10 min. La qualité des tissus de mauvaise qualité peut aussi causer des problèmes avec la coloration (voir figure 5). Il ya un certain nombre de précautions, on peut prendre pour éviter de compromettre la qualité des tissus. Tout d'abord, être patient et diligent avec des changements de saccharose afin de déplacer complètement l'eau dans le tissu avant de les congeler. Lors de la congélation, de maintenir constante la température. Si le tissu gèle trop lentement, les molécules d'eau se développeront si elles gèlent, créant des trous dans le tissu. Alternativement, la congélation à une température trop basse provoquera le tissu à se fissurer. Protocoles varient légèrement pour chaque anticorps d'intérêt. À la réception d'un nouvel anticorps, il faut opterimize le protocole en conséquence. Si le fond est élevé (figure 5), essayez de blocage pour une période de temps plus longue. En variante, d'augmenter la concentration sérique de la solution de sérum bloc ou ajouter de multiples espèces différentes, par exemple la chèvre et du sérum de lapin. En outre, la caséine peut être utilisé pour réduire la liaison non spécifique. Le lait écrémé (à base de poudre sèche) contient de la caséine et peut être utilisé dans une gamme de concentrations (généralement, 1 à 5% p / v). Le lait peut être utilisé seul, ou en combinaison avec le sérum. Si un antigène d'intérêt est un marqueur intracellulaire, par exemple des détergents à Triton X-100 ou le Tween-20 peuvent être ajoutés à la solution de blocage pour perméabiliser les membranes cellulaires. Coupes de tissu plus épaisses peuvent être traités de façon similaire en faisant flotter les coupes de tissus dans les puits au lieu de les monter sur des lames. tissu inclus en paraffine peut également être traité de manière similaire, mais nécessite une étape de déparaffinage avant le blocage. Feldengut et al. 12 adresses de ces deux méthodes. Un autre facteur à prendre en compte avec le DAB coloration est que les cellules couvrent plusieurs couches de tissu. Il est donc difficile d'obtenir des images claires de cellules telles que des microglies qui ont processus couvrants. Pour surmonter ce problème, certains chercheurs ont réduit leurs sections plus mince au 8-12 pm. Imagerie du tissu marqué par fluorescence est mieux réalisée sur un microscope confocal. Microscopes confocaux à éliminer le brouillard normalement observée avec un microscope fluorescent de recherche par l'isolement et la capture d'un seul plan de focalisation au sein de l'échantillon. Avec la microscopie confocale, des détails plus fins sont plus nettes et saigner-through entre les colorants fluorescents est réduite. Échantillons plus épais peuvent être imagées un plan à la fois (z-stack) de démontrer vrai co-localisation. Lorsque l'accès à un microscope confocal ne sont pas disponibles, l'imagerie sur un microscope de recherche est possible, toutefois la durée d'exposition et l'intensité de la lumière doivent être locked entre les images. 
Figure 6:. Tableau du spectre couleur Chaque fluorophore émet une longueur d'onde spécifique de la lumière lorsqu'il est excité par un laser ou d'un filtre spécifique. Afin de produire efficacement des tissus multi-étiquetés, il devrait y avoir un chevauchement minimal entre les fluorophores spécifiques conjugués aux anticorps. Bien qu'il y ait au moins 10 fluorophores différents disponibles sur le marché, il est impossible d'obtenir des résultats précis si tous 10 sont utilisés. Par exemple, triple étiquetage avec des émissions de longueur d'onde à 405, 488 et 594 (A) donnerait un étiquetage clair qu'il ya un chevauchement minimal, le cas échéant, entre ces longueurs d'onde. Toutefois, si les émissions de longueur d'onde à 488, 514 et 555 ont été utilisés, la coloration ne serait pas facilement interprétée comme chaque anticorps peut être excitée par le laser ou d'un filtre destiné à l'autre (
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
References
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