Abstract
Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Erfassung der Anwesenheit, den Ort und die relative Häufigkeit von Antigenen in situ. Dieser Einführungs Level-Protokoll beschreibt die Reagenzien, Geräte und Techniken erforderlich, um die immunhistochemische Färbung von Hirngewebe von Nagern zu vervollständigen, mit Markern für Mikrogliazellen und neuronale Elemente als Beispiel. Genauer gesagt, dieses Papier ist ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für fluoreszierende Visualisierung von Mikroglia und Neuronen über die Immunhistochemie für Iba1 und Pan-neuronalen sind. Fluoreszenzdoppelmarkierung ist besonders nützlich für die Lokalisierung mehrerer Proteine innerhalb der gleichen Probe, die Bereitstellung der Möglichkeit, genau zu beobachten Wechselwirkungen zwischen Zelltypen, Rezeptoren, Liganden und / oder der extrazellulären Matrix in Relation zueinander sowie Protein Co- Lokalisierung innerhalb einer einzelnen Zelle. Im Gegensatz zu anderen Visualisierungstechniken kann Fluoreszenz Immunhistochemie Färbeintensität Abnahmedie Wochen bis Monate nach Färbung, es sei denn, entsprechende Vorkehrungen getroffen werden. Trotz dieser Einschränkung in vielen Anwendungen Fluoreszenzdoppelmarkierung über Alternativen wie 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) oder alkalische Phosphatase (AP) bevorzugt, da die Fluoreszenz zeiteffizienter und ermöglicht genauere Unterscheidung zwischen zwei oder mehr Marker. Die Diskussion enthält Tipps zur Fehlerbehebung und Beratung zum Erfolg zu fördern.
Introduction
Immunohistochemie ist ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen (dh Proteine) in Gewebeschnitten unter Verwendung von primären Antikörpern, die spezifisch gegen die Antigene von Interesse binden. Immunhistochemie wurde von JR Marrack 1934 Pionierarbeit geleistet, als er festgestellt, dass Antikörper könnten Antigene mit großer Spezifität 1 zu lokalisieren. Ab 1942 einige der ersten in-vitro-Studien unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern immunhistochemisch visualisieren veröffentlicht wurden 2,3, wonach die erste in vivo histochemische Studie veröffentlicht 4. Während der 1960er drei Jahrzehnte nach dem Beginn des immunhistochemische Verfahren begann, Enzym-konjugierten Antikörper als sekundäre Reagentien verwendet werden. Diese Methoden wurden gleichzeitig und unabhängig voneinander in Frankreich und in den USA 5,6 entwickelt. Heute, ein breites Spektrum von Antikörpern bietet unendlich viele Möglichkeiten für die Immunhistochemie Studien 7.
"> Das übergeordnete Ziel dieser Korrespondenz ist es, eine kurze Einführung in immunhistochemischen Färbung bereitzustellen; es ist nicht als eine umfassende und abschließende Bewertung dieser Technik werden in der Methode beschrieben werden immunhistochemischen Techniken für zwei Antigene präsentiert (Marker für die Mikroglia und. Neuronen) für die Färbung von Paraformaldehyd perfundiert beginnt Saccharose kryogeschützt, gefriergeschnitten Rattenhirn. Die immunhistochemische Färbung mit Blockierungs unspezifische Antigen-Bindung an die Hintergrundfärbung zu reduzieren. Als nächstes wird die Inkubation mit dem primären Antikörper können zur Bindung an ein spezifisches Antigen im Gewebe. Im Anschluss an die primären Antikörper, ein anderer Antikörper, bezeichnet als sekundärer Antikörper, aufgebracht wird, um den primären Antikörper auf einen konjugierten Visualisierungssignal 8 zu verknüpfen. Der sekundäre Antikörper zielt auf das Immunglobulin G (IgG) Domäne spezifisch für die Spezies, in denen das primäre Antikörper gezüchtet wurde. Der sekundäre Antikörper verstärkt das Signal, des primären Antikörpers, da die Fab Regionen ter sekundären Antikörper binden sich an mehreren Stellen auf dem IgG-Domäne des primären Antikörpers. Entweder Enzymen oder fluoreszierenden Moleküle an die Fc-Bereiche der sekundären Antikörper konjugiert ermöglichen Visualisierung. Beispielsweise ist ein Kaninchen-Anti-Iba1 Primärantikörper ein Kaninchen-IgG-Molekül spezifisch für Iba1. Wenn Esel-Anti-Kaninchen-IgG als sekundärer Antikörper verwendet, wird es zu erkennen und zu mehreren Regionen des Kaninchen-Anti-Iba1 IgG (siehe 1), zu binden. Der Esel-Antikörper kann durch verschiedene Verfahren sichtbar gemacht werden. Diese Entsprechung konzentriert sich auf Erfassung eines Fluorophors an den sekundären Antikörper, der den primären Antikörper erkennt, zur Sichtbarmachung durch Fluoreszenzmikroskopie konjugiert. In fluoreszierenden Immunhistochemie kann eine Kernfärbung wie Hoechst oder DAPI verwendet, um alle Kerne zu visualisieren.
Abbildung 1: SchEmatic Darstellung direkte vs. indirekte Antikörper-Markierungstechniken. Antikörper binden an das Antigen von Interesse und kann durch sekundäre Antikörper, die gegen die Spezies des primären Antikörper erzeugt amplifiziert werden. Diese Technik kann durchgeführt werden unter Verwendung von Avidin-Biotin-Komplex (ABC) zur Verstärkung und DAB zur Visualisierung (A) oder einem direkt konjugierten fluoreszierenden Sekundärantikörper (B). Alternativ können primäre Antikörper direkt mit vielen verschiedenen Tags, einschließlich Biotin oder ein Fluorophor (C) konjugiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ein alternatives Verfahren zur Visualisierung von immunhistochemischen Färbung verwendet 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB; siehe 1 und 2). Dies unterscheidet sich von Fluoreszenz, die durch Verwendung eines biotinylierten oderMeerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Sekundärantikörper, die ein Enzym, um DAB zu einem Niederschlag, der unter Hellfeldmikroskopie sichtbar zu konvertieren bietet. In Fällen, in denen eine einzige Antigen von Interesse ist oder Färbung ist erforderlich, langlebig zu sein, kann DAB besser geeignet als Fluoreszenzfärbung ist. Allerdings DAB-Färbung nicht zur Differenzierung zwischen mehreren Markern gut geeignet, vor allem, wenn zwei nukleäre Antigene von Interesse. Informationen zur DAB Materialien und Protokoll Änderungen, wenden Tabelle 1. Alternativ Nitroblautetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (NBT / BCIP) kann verwendet werden, um eine alkalische Phosphatase (AP) konjugierten sekundären visualisieren Antikörper.
Abb. 2: Repräsentative Bilder von Nickel-verstärkten DAB einfach markierten Rattenhirngewebeschnitten Rattenhirn-sections, die mit Nickel-verstärkten DAB für Iba1 (A) und Pan-neuronalen (B) markiert sind, ermöglichen eine lang anhaltende Analyse von Mikrogliazellen oder Neuronen allein. Maßstabsleiste 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Man muß bedenken die geschätzte Häufigkeit des Antigens von Interesse innerhalb des Gewebes analysiert. Indirekten Methoden (wie oben beschrieben) sind nützlich für Ziele mit geringer Häufigkeit. Wenn das Antigen von Interesse in besonders hoher Zahl, können direkte Verfahren aufgebracht werden. Direkte Verfahren umfassen einen primären Antikörper, der direkt an ein Visualisierungssignal konjugiert ist, und damit keine sekundären Antikörpers erforderlich ist. Diese Methode vereinfacht die Färbung Prozess, aber beseitigt die durch indirekte Methoden erreicht Verstärkung. Mit Hilfe eines direkt konjugierten primären Antikörper beseitigt auch Kreuzreaktivität Sekundärantikörperals Doppelmarkierung.
Diese Mitteilung beschreibt die Protokoll für Doppelmarkierung mit Iba1 und Pan-neuronalen (Details in Tabelle 1). Iba1 Flecken Mikroglia-Aktivierung in vielen Staaten, darunter verzweigte, hyperverzweigte, aktiviert, amoeboid und Stange. Pan-neuronalen Flecken neuronalen Axonen, Dendriten, und Soma. Seit Iba1 Flecken meisten Mikroglia und Pan-neuronalen Ziele das Neuron ist diese Kombination von Flecken nützlich gewinnen ein umfassendes Verständnis von Mikroglia-Neuron-Interaktionen.
Zusammengefasst beruht die immunhistochemische Färbung auf die sorgfältige Auswahl von Antikörpern. Da die Fragestellung wird präziser können Antikörper, Antigene, um alternative angehoben wünschen übrig. Um einen bestimmten Mikrogliaaktivierung Staaten abzielen, kann man sich dafür entscheiden, CD45 oder CD68-Antikörper verwenden, anstatt Iba1. Ferner wird bei der Arbeit mit Mäusen, F4 / 80 können die erforderlichen Ergebnisse zu liefern. In ähnlicher Weise kann die neuronale Elemente spezifisch mit Antikörpern ra gezieltsierten gegen den Zellkern, synapse (Pre- oder Post), Axon, und Wachstumskegel. Darüber hinaus gibt es andere Markierungen, die das Alter des Neurons (Doppel-Cortin, NeuN) unterscheiden und neuronalen Regeneration (GAP-43).
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Protocol
HINWEIS: Alle Verfahren wurden in Einklang mit den institutionellen Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der Universität von Arizona durchgeführt. Eine Liste der empfohlenen Materialien und Geräte können in Tabelle 1 gefunden werden.
1. Gewebepräparation
- Perfusion
- Euthanize Nager mit einer Überdosis von Natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP), und transkardial perfundiert mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), bis sie vollständig ausgeblutet (3-5 min) bei einer Flussrate von 8 ml / min. Für umfassende Perfusion Anweisungen finden Sie Gage et al 2012 9.
- Unmittelbar im Anschluss an PBS spülen, fixieren Gewebe durch Perfusion mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15-20 min bei einer Flussrate von 8 ml / min.
- Entfernen Gehirn und in 4% Paraformaldehyd für 24 h, gefolgt von einer abgestuften Saccharoselösungen (15%, 30%, 30%, in der Reihenfolge, in Tris gepufferter Kochsalzlösung) auf 4 ° C. Übertragen Sie das Gehirn, um die nachfolgende Saccharoselösung only Nachdem sich das Gehirn in jeder Lösung versenkt. Anmerkung: Normalerweise, 5 Tage in jeder Lösung ist ausreichend Zeit für Gewebe zu sinken.
- Tissue Freezing und Kryoschneiden
- Platzieren des Gehirns in Einbettungsmedium, wie OCT-Verbindung und tauchen in Isopentan bei einer Temperatur von -35 ° C. Ermöglichen das Gehirn für ein Minimum von 10 min Einfrieren und dann bei -80 ° C lagern. Probleme können entstehen, wenn Fleiß Temperatur wird nicht übernommen; finden Sie Informationen zur Fehlerbehebung Diskussion.
- Geschnitten serielle Kranzschnitte mit einer Dicke von 20 & mgr; m und einer Temperatur von -20 ° C. Sammeln Gewebe auf positiv geladene Objektträger. Hirnschnitte können in einer Dia-Box in der Folie bei -80 ° C eingewickelt in einer Zip-Top-Tasche und dort zentral langfristig platziert werden. Diese Art der Lagerung verursacht einen doppelten Begrenzungs die Exposition gegenüber Luft und Frost zu verhindern.
2. Gewebeverarbeitung
HINWEIS: Beispiel Ausrüstung und Materialien rzur Färbung equired sind in Abbildung 3 dargestellt. Alternativen zur Verfügung stehen, jedoch werden diese Bilder zu unterstützen diejenigen, die mit immunhistochemischen Färbung geeignete Produkte vor dem Kauf zu visualisieren.
Abbildung 3: Beispiel Produkte zur immunhistochemischen Färbung erforderlich Die in (A) gezeigt, Black Box ist ein idealer Feuchtigkeitskammer für Immunfluoreszenz, wie Objektträger werden vor Licht ohne die Notwendigkeit, auf Folie wickeln Sie das Feld geschützt.. Nach Schnitte können Folien in einer Box, wie die in (B) gezeigt, gelben Kasten gelagert werden. Wickeln Sie das Feld dicht in der Folie und Platzierung in einem zip-Top-Tasche vor dem Gefrier hilft den Gewebeproben von Gefrierbrand zu schützen. Ein Beispiel für Folien ist in (C), wobei in (D) dargestellt verschiedenen färbekasten und da (E (F) variieren jedoch 1,2 dicken Deckgläser bieten schöne Imaging-Ergebnisse auf den meisten aufrecht und konfokale Mikroskope. Ein Bleistift, wie die in (G) gezeigt ist, kann verwendet werden, um Folien zu markieren. Filzstiften sollte vermieden werden, da die Tinte ausgeführt werden kann, die sowohl die Färbung und die Fähigkeit zu bestimmen, welche die Probe. Ein Mini-pap pen, wie sie in (H) gezeigt, ermöglicht eine abstoßende Grenze auf Objektträger gezogen werden.
- Slide Vorbereitung
- Folien aus dem Gefrierschrank und Tauwetter entfernen bei Raumtemperatur.
- Optional: Wenn Abschnitte wurden zuvor von Dias schwebte, legen Sie aufgetaut Dias in einem Ofen bei 60 ° C für nicht mehr als 4 Stunden, um zu verhindern, dass Gewebeschnitte von schwimmenden off Folien.
- Die Objektträger in einem Objektträgergestell und entsprechenden Gericht.
- Wasch gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten, Ändern Lösung zwischen Wäschen. Von diesem Schritt nach vorn, zu vermeiden, dass Abschnitons ohne Flüssigkeit über längere Zeiträume. Hinweis: Sofern Teile trocknen, wird die Hintergrundfärbung erhöht und aussagekräftige Daten nicht zuverlässig erreicht werden.
- Folien aus dem Gefrierschrank und Tauwetter entfernen bei Raumtemperatur.
- Gewebefärbung
- In einem lichtdichten Box Färbung, erstellen Sie eine "feuchte Kammer" mit fusselfreien Gewebe mit VE-Wasser eingeweicht.
- Trocknen Sie die Ränder der Objektträger mit einem fusselfreien Tuch, verwenden Sie einen Mini pap Stift, um eine flüssigkeitsabweisende Grenz ganz am Rand des Objektträgers zu machen, weg von Gewebeschnitten. Diese Grenze sollte ausreichend Raum zwischen dem Meniskus der Flüssigkeit und dem Rand des Gewebes, so dass die Oberflächenspannung nicht beeinflusst Markierung sicherzustellen.
HINWEIS: Der Pap pen abweisende Grenz kann vor 2.1.3 angelegt, wenn die Antikörper von Interesse nicht Mikrowelle Antigen-Retrieval verlangen. Wenn der PAP-Stift wurde vor dem Waschen in PBS aufzuerlegen, ist die Integrität der flüssigkeitsabweisenden Grenze bei diesem Schritt geprüft. Verwenden Sie ein Mini-pap Stift, um in Öffnungen in der Grenze zu füllen. - Verwenden Serum von der gleichen Spezies in dem sekundären Antikörper durchgeführt wird. Anmerkung: In diesem Verfahren werden die sekundären Antikörper in Esel gemacht und damit Eselsserum verwendet. Wenn Sekundärantikörper aus zwei oder mehr verschiedenen Arten verwendet werden, umfassen Serum von jeder Spezies.
- Pipette primären Antikörper auf Objektträger. Hinweis: Antikörperkonzentrationen für diese Färbung haben bei 1 optimiert: 5000 und 1: 500 für Iba1 und Pan-neuronalen sind. Diese Konzentrationen haben sich als sinn Färbung mit einer Abwesenheit von Hintergrundfärbung zu zeigen.
- Verdünnen Block Lösung1% Serum in PBS und fügen primären Antikörper. Pipette 300 ul primären Antikörperlösung in 1% Serum pro Folie. Wieder zu beachten, die Flüssigkeit an der Kante des pap Stift. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
- Fügen Sie drei Kontrollobjektträger: eine, die weder Iba1 noch Pan-neuronalen Antikörper enthält, eine mit Iba1 ohne Pan-neuronalen Antikörpers und eines mit Pan-neuronalen Antikörper ohne Iba1. Fleck diese Folien in der gleichen Flucht mit den gleichen Lösungen, aber die primären Antikörper weggelassen werden, um die nicht-spezifische Bindung der sekundären Antikörper zu testen.
- Am nächsten Morgen, Wasch gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten, Ändern Lösung zwischen den Waschgängen.
- Fluoreszierende Antikörper sind lichtempfindlich, daher von dieser Schritt nach vorn, Lichtexposition zu minimieren, indem sichergestellt Waschbehälter werden in Folie eingewickelt und Hybridisierung Kästen sind entweder schwarz oder im Dunkeln inkubiert. Pipettieren Sie die entsprechenden Sekundärantikörper auf allen Folien und Inkubation für60 min bei Raumtemperatur in einer Konzentration von 1: 250 in Blocklösung (siehe Schritt 2.2.3) in einer lichtdichten "feuchte Kammer" (siehe Schritt 2.2.1).
- Verwenden Sekundärantikörper unterschiedlicher Wellenlängen. Hier für den primären Antikörper Kaninchen-anti-Iba1 Verwenden Esel anti- Kaninchen 594 als geeigneter sekundärer Antikörper. Für den primären Antikörper Maus-Anti-Pan-neuronalen Verwenden Esel-anti-Maus 488 als geeigneter sekundärer Antikörper. Alternativ können Sie Anti-Kaninchen-488 und Anti-Maus-594.
- Wasch gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 min.
- Optional: durchführen Kernfärbung.
- Platz in Hoechst (oder andere Kernfärbung) in einer Konzentration von 0,03 ug / ml in doppelt destilliertem H 2 0 für genau 60 sec.
- Wasch gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 min.
- In ddH 2 0 waschen.
- Deckglasobjektträger mit einer wässrigen Einschlussmittel, wie beispielsweise Fluoromount-G oder ProlongGold. Achten Sie darauf, um alle Blasen mit einem Wattestäbchen entfernen.
Hinweis: Andere Befestigungsmittel verwendet werden könnte, hat sich jedoch hohe Durchschlag zwischen den Farbstoffen, die durch einige wenige Tage nach Eindecken festgestellt worden. - Verwenden klarem Nagellack, um die Kanten zu versiegeln, verhindern, dass die Abschnitte vor dem Austrocknen durch Verdunstung. Lassen Sie Nagellack auf eine lichtdichte Behälter trocken, während in flachen Folien und bei Raumtemperatur bleiben, und dann in einem lichtdichten Behälter in Folie bei 4 ° C eingewickelt zu speichern.
3. Abbilden der gefärbten Gewebe
- Mikroskopie
- Lassen Sie den Nagellack, um für mindestens eine Stunde trocknen vor Beginn der Mikroskopie, welche in einem abgedunkelten Raum stattfinden sollte.
- Erwerben Mikrophotographien mit einem konfokalen oder Forschungsmikroskop mit einer fluoreszierenden Lichtquelle und einer digitalen Kamera Anhaftung. Mit Hilfe der beiliegenden Software, stellen Sie die Belichtung für jede Wellenlänge - 405, 488, und 594 - getrennt. Hinweis: Tiefenabbildungsanweisungen sollten Online vom Mikroskop-Hersteller zur Verfügung.
- Erwerben Mikroaufnahmen in jedem Kanal, ohne die Teile oder Einstellung des Fokus. Nehmen Sie Bilder in Farbe, in Graustufen oder alternativ und konvertieren, um danach zu färben.
Hinweis: Farb- oder Graustufenbilder von jedem Kanal können in der Nachbearbeitung zusammengetragen werden. - Sicherzustellen, dass die Gewebeabschnitte nicht auf Umgebungslicht oder Licht mikroskopisch für lange Zeit ausgesetzt, als Photobleich der Abschnitte auftritt. Um dies zu vermeiden, erhöhen Sie die Belichtungszeit, anstatt die Licht- / Laserintensität.
- Schalten Sie nicht die Fluoreszenzlichtquelle innerhalb von 30 Minuten eingeschaltet.
Hinweis: Schalten Sie die Quelle an und aus kurz hintereinander kann die Lebensdauer der Leuchtstofflampe zu verringern.
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Representative Results
Diese Färbung Protokoll führt Rattenhirngewebeschnitten, die Mikroglia fluoreszenz im Kanal 594 (rot) markiert sind und Neuronen in dem Kanal 488 markiert (grün; siehe Abbildung 4). Wenn eine Kernfärbung durchgeführt wurde, wird es in der 405-Kanal (blau) zeigen. Bilder können in verschiedenen Kanälen zwischen zwei beliebigen Kanälen aufgenommen werden und überlagert zum direkten Vergleich der drei Kanäle oder. Viele digitale Erfassungssoftware Suiten verfügen diese Funktionalität. Doppelmarkierung mit den hier gezeigten Iba1 und Pan-neuronalen Marker zeigt meist verzweigten Mikroglia, mit langen feinen neuronalen Projektionen deutlich über kortikalen Schichten.
Abb. 4: Repräsentative konfokalen Fluoreszenzbilder von Iba-1 / Pan-neuronalen Doppelmarkierungs Spalte 1 Mikroglia mit Iba1 (rot) gefärbt. Neuronen in der gezeigtenzweite Spalte in grün, mit dem überlagerten Bild von beiden roten und grünen Kanäle in der dritten Spalte. In der ersten Zeile gibt es einen vollständigen Mangel an spezifischen Färbung aufgrund des Fehlens der beiden primären Antikörper. Die zweite Zeile zeigt Spezifität von Pan-neuronalen primären Antikörper für neuronale Färbung, während die dritte Reihe zeigt Spezifität Iba1 für Mikroglia, mit einem völligen Mangel an Kreuzreaktivität in beiden Fällen. Die vierte Zeile zeigt Doppelmarkierung mit einer Überlagerung der beiden Kanäle, die sowohl Mikroglia und neuronalen Färbung. Maßstabsleiste 50 um.
Schlechte Färbungsergebnisse sind ebenfalls dargestellt (Abbildung 5), wie durch das Fehlen von klar definierten Zellkörper und fragmentiert Mikroglia / neuronale Prozesse belegt. Hoch Hintergrund weist auf schlechte Färbungsqualität und kann durch nicht-spezifische Co-Lokalisation von Antikörpern (siehe Abbildung 5) zu sehen. Außerdem, wenn das Signal schwach ist, eine Verstärkungsstufe mit fluoreszenz gebundenen streptavidin eingearbeitet werden können. Anstelle der Verwendung eines direkt markierten fluoreszierenden Zweitantikörper in Schritt 2.2.6 einen biotinylierten sekundären angewendet wird. Nach dem Waschen in PBS, Streptavidin: (1 1000 in PBS) auf die Folien für 1 h inkubiert. Zurück zu Protokoll in Schritt 2.2.7, wo Objektträger werden dann gewaschen und in einem Gegenfärbung getaucht oder Abdeckung gerutscht.
Abb. 5: Repräsentative Fluoreszenzbilder der schlechten Gewebequalität Hier dargestellt ist ein Beispiel für schlechte Färbung in Gewebe, die in einem Mangel an Klarheit von Mikroglia-Färbung (a) und völligen Mangel an neuronalen Färbung (b) führt. Diese neuronalen Färbung ist einfach hoch Hintergrund. Das überlagerte Bild (c) ist nicht sinnvoll.
| Name Material / Ausrüstung | Unternehmen | Katalog-Zahl | Kommentare / Beschreibung |
| Fishersuperfrost Plus Objektträger aus Glas | Fisher Scientific | 22-034-979 | Wird für die Gewebebefestigung (1.2.2) |
| Backofen | Thermo Scientific | 51028112 | Wird für die Gewebetrocknung (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | In Schritt 2.2.2 verwendet |
| Andwin Scientific Tissue-Tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Für alle Waschanlagen verwendet während der Färbung (2.2) sowie der Hoechst Schritt (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Verwendet zum Trocknen Objektträger (2.2) |
| Schwarz Staining Box | Ted Pella | 21050 | Verwendet für die Sperrung und Färbeschritte (2.2) |
| Normale Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Wird für Block und Antikörper-Inkubation (2.2) |
| Maus-α-Pan-neuronalen | Millipore | MAB2300 | Wird für die primären Antikörper (2.2.4) |
| Kaninchen-α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Wird für die primären Antikörper (2.2.4) |
| Donkey α-Kaninchen 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Wird für Sekundärantikörper (2.2.6) |
| Donkey α-Maus-488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Wird für Sekundärantikörper (2.2.6) |
| Caterer des Folien | Jeder | N / A | In Schritten 1.2.2 und 2.3.2 verwendet |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Wird für Eindecken (2.2.8) |
| Deckgläser | Fisher Scientific | 12544E | Wird für Eindecken (2.2.8) |
| Klar Nail Polish | Jeder | N / A | Wird für Eindecken (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 und LSM 710 (Laser-Scanning, konfokale) | Carl Zeiss | N / A | Verwendet für die Bildgebung (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N / A | Verwendet für die Bildgebung (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | Für DAB-Protokoll | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | Für DAB-Protokoll |
| DAB Peroxidase-Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Für DAB-Protokoll |
| Biotinyliertem Pferde-α-Kaninchen-IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | Für DAB-Protokoll |
| Biotinyliertem Pferde-α-Maus-IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | Für DAB-Protokoll |
| 30% Wasserstoffperoxid | FisherScientific | H325-500 | Für DAB-Protokoll |
| Wheaton Objektträgerhalter und Färbeschalen | TedPella | 21043 | Für DAB-Protokoll |
| Masterflex Perfusionspumpe und Schläuche | Cole-Parmer | Wird für die Perfusion (1.1.1 und 1.1.2) | |
| Andwin wissenschaftlichen Tissue-Tek CRYO-OCT-Verbindung (Fall 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Wird für die Gewebe Einfrieren (1.2.1) |
| Thermometer (-50 bis 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Wird für die Gewebe Einfrieren (1.2.1) |
| Kryostat | Leica | CM3500S | Wird für die Gewebeschneide (1.2.2) |
| Färbetrog aus Kunststoff mit 2 Deckel | Grale Scientific | 353 | Für Antigen retrival |
| 20 Platz Färbebank, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | Für Antigen retrival |
| Mikrowelle | Jeder | N / A | Für Antigen retrival |
Tabelle 1: Materialliste.
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Discussion
Das übergeordnete Ziel dieser Mitteilung war die Immunhistochemie Verfahren für den Leser einzuführen. Hierzu wird das Beispiel der Doppelmarkierung mit Iba1 und Pan-neuronale Antigene an Mikroglia und Neuronen in Paraformaldehyd perfundiert beobachten, wurde Saccharose kryogeschützt, gefriergeschnitten Rattenhirn verwendet.
Diese Technik lässt sich an endlosen Zwecken dienen werden. Ein Array von verschiedenen Antigenen in einer Vielzahl von Gewebetypen, wie beispielsweise, jedoch nicht darauf Gehirn, Lunge, Leber, Niere und Darm beschränkt kann immunhistochemisch mit geringfügigen Anpassungen des Protokolls visualisiert werden. Immunhistochemie erlaubt die direkte Vergleich mehrerer Marker und können bis zu vier verschiedene Antikörper in einer einzelnen Probe umfasst. Die Anzahl von Antikörpern in einer Probe verwendet wird, durch Durchschlagen, die Überlappung der Fluoreszenzwellenlängen beschreibt beschränkt. Es gibt eine begrenzte Leuchtstofflichtspektrum, die folglich innerhalb wie begrenzt die Färbung Kombinationeningle Probe (siehe Abbildung 6).
Bei Doppelmarkierung, ist es am besten primären Antikörpern in verschiedenen Arten gemacht zu wählen, da beide Antikörper gleichzeitig angewendet werden. Doppelmarkierungstest mit zwei Antikörpern aus der gleichen Spezies möglich ist, obwohl technisch schwierig. Wenn beide primären Antikörper werden in der gleichen Art gemacht, muss Färbung nacheinander durchgeführt werden, durch die Vollendung der Färbung für ein Antigen vor dem zweiten. Weniger Probleme entstehen, wenn die primären Antikörper, die aus der gleichen Spezies unterschiedliche Ig-Klassen (zB Maus-IgG und Maus-IgM oder verschiedene Subklassen IgG1 und IgG2a). Für weitere Informationen konsultieren Sie weitere Referenzen 10,11. Dieses Protokoll verwendet Kaninchen-Anti-Iba1 und Maus-Anti-Pan-neuronalen. Es ist auch notwendig, um geeignete negative Kontrollen enthalten. Für Doppelmarkierung mit Iba1 und Pan-neuronalen enthält eine Folie keine primären Antikörper enthält eine Folie anti Iba1 nur und eine Folie enthält nur anti-Pan-neuronalen (siehe Abbildung 4). Diese negative Kontrollen bestätigen die Abwesenheit von Kreuzreaktivität und falsche Färbung. Alle anderen Folien enthalten sowohl primäre Antikörper. Es ist auch wichtig zu vermeiden, mit Sekundärantikörper, die kreuzreagieren können. Beispielsweise mit Esel-Anti-Kaninchen-594 und Kaninchen-anti-Maus 488 würde in Esel-Anti-Kaninchen-594 Bindung sowohl Kaninchen-anti-Iba1 primären Antikörpers und des Esel-anti-Kaninchen-594-anti-Maus Sekundär-Antikörper 488 führen. Das wäre falsch Co-Kennzeichnung zu erstellen. Antikörper für ein bestimmtes Protein (Antigen) nicht immer die gleiche. Beispielsweise sind einige Antikörper gegen Antigene, die in gefrorenem Gewebe vorhanden sind angehoben, während andere ein Antigen, das während der Paraffineinbettungsprozesses verändert wurde erkannt. Aus diesem Grund sollte besonders darauf geachtet werden, die bis ter Antikörper-Datenblatt vor Kauf. Wenn die vorgesehene Anwendung für den Antikörper nicht aufgeführt ist, kann die Fehlersuche benötigt werden, um Fleckenbildung zu erhalten, oder Färbung kann nicht funktionieren. Zusätzlich können zuvor veröffentlichten Daten "Tricks des Handels" anbieten, Färbung zu erhalten. Von Bedeutung anzumerken, dass subtile Unterschiede in verschiedenen Chargen von Antikörpern zu sehen; geringfügige Modifikationen benötigen, um mit jedem neu anordnen eines Antikörpers hergestellt werden. Die meisten Antikörper sind gut für 12 Monate ab dem Datum des Eingangs. Achten Sie darauf, das Datum der Ankunft auf dem Produktdatenblatt anzugeben. Wenn Antikörper-Färbung nicht eingehalten, kann der Antikörper zu alt oder falsch gelagert sein. Daher ist es auch wichtig, jedes Antikörper-Datenblatt für die ordnungsgemäße Lagerung zu überprüfen. Zusätzlich kann für viele Antikörper, sind verschiedene Klone verfügbar. Verschiedene Klone erkennen verschiedene Teile des Antigens von Interesse. EINgegebenen Klon besser für Gewebe an unterschiedliche Verarbeitungstechniken unterzogen werden (Wachs-Embedded / gefroren), Zielgewebetyp oder Zielarten. Achten Sie besonders auf die Art, in der der Antikörper wurde angehoben. Wenn der Antikörper in der gleichen Spezies wie das Gewebe für die Analyse erhöht wird, kann eine hohe Hintergrund beobachtet werden. Um dieses zusätzliche Sperr mit kommerziell erhältlichen Kits bekämpfen, wie einer Maus auf Maus Kit kann für die Färbung erforderlich. Diese Technik kann auch auf Zellkultur angepasst werden. Fixierung von Zellen, Klon und Spezifität müssen sich auf die technischen Daten für den Einsatz überprüft werden. Fixierung mit Para vernetzt Proteine, die Antigen-Bindungsstellen in bestimmten Bedingungen verbergen konnte. Antigen-Retrieval können Protein-Quervernetzungen zu brechen und setzen Bindungsstellen. Wenn Antigen-Retrieval erforderlich ist, legen Sie die folgende Protokoll nach Schritt 2.1.3: mit einem Kunststofffärbung Schüssel und fügen (siehe Tabelle 1), Mikrowelle Diasin Citrat-Puffer auf einem niedrigen Leistungseinstellung für 10 Minuten, wobei darauf zu achten nicht streng lassen Sie die Lösung zum Kochen (spezifische Leistungsstufen nicht auf die Variabilität in den Einstellungen zwischen Mikrowellen enthalten). Alternativ bringen Citratpuffer auf 80 ° C in einer Glasschale Färbung in einem Ofen, dann fügen Sie Folien für 10 min. Schlechte Qualität des Gewebes kann auch Probleme mit Färbung (siehe Abbildung 5) führen. Es gibt eine Reihe von Vorsichtsmaßnahmen kann man treffen, um nicht zu gefährden Gewebequalität. Erstens, seien Sie geduldig und fleißig mit Saccharose Änderungen, um Wasser gründlich zu verdrängen in dem Gewebe vor dem Einfrieren. Beim Einfrieren, halten die Temperatur konstant. Wenn das Gewebe gefriert zu langsam, wird die Wassermoleküle zu erweitern, wie sie einzufrieren, wodurch Löcher in dem Gewebe. Alternativ Einfrieren bei einer zu niedrigen Temperatur bewirkt, dass die Gewebe zu knacken. Protokolle wird etwas für jeden Antikörper von Interesse variieren. Bei Empfang eines neuen Antikörpers, eines entscheiden müssenimize das Protokoll entsprechend. Wenn der Hintergrund hoch ist (Abbildung 5), versuchen Blockierung für einen längeren Zeitraum. Alternativ erhöhen die Serumkonzentration des Blocks Lösung oder fügen Serum von mehreren verschiedenen Arten zB Ziege und Kaninchen-Serum. Zusätzlich kann Casein zur Verringerung nicht-spezifischer Bindung wird. Magermilch (von Trockenpulver) enthält Kasein und kann in einem Bereich von Konzentrationen verwendet werden (in der Regel 1-5% w / v). Milch kann allein in Verbindung mit einem Serum verwendet werden, oder. Wenn ein Antigen von Interesse ein intrazellulärer Marker können Detergenzien, wie Triton X-100 bei oder Tween-20 in die Blockierungslösung zugegeben werden, um die Zellmembranen zu permeabilisieren. Dickere Gewebeschnitte können in ähnlicher Weise durch die schwimmende Gewebeschnitte in Brunnen statt Montage sie auf Folien verarbeitet werden. Paraffin eingebettetem Gewebe können auch in ähnlicher Weise verarbeitet werden, sondern benötigt eine Entparaffinierung Schritt vor dem Blockieren. Feldengut et al. 12 Adressen Beide Methoden. Ein weiterer Faktor zu berücksichtigen, mit DAB-Färbung zu nehmen ist, dass Zellen über mehrere Gewebeschichten. Daher ist es schwierig, klare Bilder von Zellen zu erhalten, wie beispielsweise Mikroglia die Spanning Verfahren haben. Um dieses Problem zu überwinden, schneiden einige Forscher ihre Abschnitte dünner bei 8-12 & mgr; m. Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Gewebes am besten auf einem konfokalen Mikroskop erreicht. Konfokalmikroskopen beseitigen die Trübung in der Regel mit einem Forschungs fluoreszierenden Mikroskop von Isolieren und Erfassen eines einzelnen Fokusebene innerhalb der Probe. Bei der konfokalen Mikroskopie, feineren Details sind schärfer und Durchschlagen zwischen Fluoreszenzfarbstoffen wird reduziert. Dickere Proben können einer Ebene zu einer Zeit (Z-Stapel) zu wahren Co-Lokalisation zeigen abgebildet werden. Wenn der Zugang zu einem konfokalen Mikroskop nicht verfügbar ist, ist auf einer Abbildungsforschungsmikroskop jedoch möglich Belichtungszeit und Lichtintensität muss loc seinzwischen den Bildern ked. 
Abb. 6: Farbe-Spektrum Jeder Fluorophor emittiert eine bestimmte Wellenlänge des Lichts, als von einem bestimmten Laser oder Filter angeregt wird. Um mit mehreren Labels Gewebe effektiv zu produzieren, sollte es minimale Überlappung zwischen spezifischen Fluorophore an die Antikörper konjugiert werden. Zwar gibt es mindestens 10 verschiedene Fluorophore auf dem Markt verfügbar sind, ist es nicht möglich, eindeutige Ergebnisse zu erhalten, wenn alle 10 eingesetzt werden. So würde beispielsweise Triple-Kennzeichnung mit der Wellenlänge Emissionen bei 405, 488 und 594 (A) eine eindeutige Kennzeichnung zu geben, da es minimale Überlappung, wenn überhaupt, zwischen den Wellenlängen. Wenn jedoch Wellenlängen-Emissionen bei 488, 514 und 555 verwendet wurden, ist die Färbung nicht leicht zu interpretieren, da jeder Antikörper kann durch den Laser oder angeregt werden Filter gemeint für den anderen (
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
References
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