代償肺の成長のマウス肺モデル

Introduction

肺の主な機能は、生物と大気の酸素と二酸化炭素の交換を提供することである。ヒトでは、先天性および後天条件のホストが損なわれた肺機能をもたらす減少、肺の表面積をも​​たらす。 すなわち、肺-そのような吸入コルチコステロイド、気管支拡張薬、酸素補給、および慢性の機械的換気などの治療のホストが損なわれた肺機能^1-3の影響を緩和するために使用されているが、これらの状態のための理想的な治療は、機能的な肺組織の再生を促進する再生。

哺乳動物の組織再生は十分に立証されている。アフリカのトゲマウスは瘢痕形成⁴なく、皮膚の大部分を再生することができる。ヒトでの末節骨は、以下の傷害または切断^5-7を再生成することができます。以下の肺（PNX）、代償肺の成長が行い^、9ラット、マウス⁸で発生gsは^10、およびヒト^11。定義により、代償肺の成長は既存の空域の拡大が、関連した微小循環¹²の拡大にこれらの拡大空域の再隔壁形成だけではないが含まれます。遺伝子発現解析は、このモデルが肺の発達¹³のシグナル伝達事象の多くを再現することを示した。四週間マウスPNXた後、肺胞の表面積は、偽手術動物¹⁴と同等である。本稿では、我々は、マウスPNXおよび偽PNX手順を説明します。

Protocol

注：動物use文：本研究におけるすべての手順を承認し、シンシナティ小児病院での動物実験使用とケア委員会（IACUC）のガイドラインに従って行った。 8週齢のC57BL / 6J雄マウスをジャクソン·ラボラトリーズ（バーハーバー、ME）から入手し、使用前に一週間順応させた。手術まで、動物を、無病原体バリア施設で飼育し、オートクレーブした食餌及びろ過水広告libdiumを与えた。各マウスのケージは、専用の空気と水を供給し、客室は、12時間の昼夜サイクルで維持した。手術からの回復に続いて、マウスは、濾過トップとのケージに維持し、オートクレーブ処理飼料適宜該ギプスを提供し、水のボトルからの水を濾過して設けられた。

楽器の調製

1. ペーパークリップやピンを使用して6スキンリトラクターを作る。ツイストがl、紙·ピンのシャンク上のペーパークリップを伸ばした一端の5センチメートルストレート鋼線を庇ワイヤの端部にフック状の単0.5センチメートル "U"を作る。
2. プラスチック製のラップを使用して、いくつかの15×15四方の手術用ドレープを作る。マウス当たり1ドレッシングを準備します。各ラップの間に紙塔を置く。
3. 12×12インチのコル​​クタイル、ガーゼ、および綿棒のスタックと一緒にすべての手術器具を滅菌する。

2.マウスの準備

1. 2％イソフルランで麻酔を誘導する。動物を計量。
2. 専用の外科準備領域では、電気シェーバーと左胸部と首の領域を剃る。
3. マウスの目に人工涙軟膏の低下を適用します。
4. クロルヘキシジン、イソプロピルアルコールで首と左胸部を除染。さらに2回繰り返します。

3.マウスオロ気管挿管および機械的人工換気

1. 予め温めておいた手術領域における非滅菌外科技術者の場所でマウス仰臥位を持っている。
2. 足のピンチに応答がないことを文書化することにより、麻酔の深さを確認してください。
3. 手を洗うと手術衣装、マスク、帽子を着用した後、無菌手術用手袋を着用。
4. ドレープと無菌技術を使用した後、喉頭を露出させ、前方半ば首オーバー1センチメートル垂直切開する。軽く湾曲し、鋸歯状の10cmの鉗子でストラップの筋肉を撤回し、ストレートハサミの先端でストラップの筋肉を広げることによって喉頭と気管を公開。
5. 経口半ば気管（ 図1A）に22 G鈍先端の血管カテーテルを挿入し、視覚的に配置します（ 図1B）を確認します。麻酔を維持し、げっ歯類の人工呼吸器を介して1〜3％イソフルランを使用して換気（;毎分200ストークスストロークあたり225μL）。 15cmのH ₂ Oの圧力限界を採用

4.マウスの肺

1. マウスの背中を向けた状態で、右側臥位でマウスを置き演算子（左側上）。無菌ドレープのように自己シールプラスチックラップを使用してください。ドレープを切断、4 ^番目と5 ^番目の肋間で肋骨に2cmの長さのカット並列を作るために鈍い傾いて湾曲したハサミを使用しています。鈍先端湾曲したハサミを挿入し、根底にある肋骨と肋間筋から離れて皮膚を解剖。
2. 正方形の1.5×1.5センチメートル外科ウィンドウ（ 図2A）を露出するために4つのリトラクターで皮膚を撤回。コルクボードにリトラクターを固定します。
3. 湾曲した鉗子を用いてリブまで細かく分析し、胸腔を入力するように湾曲した鉗子の1チップを使用しています。
4. 丸い先端マイクロはさみを使用して、胸腔を入力するように下刃を使用しています。反対方向にリブを繰り返し間で0.5cmの切開を行います。
5. 残りの2つのリトラクターを使用して、前後軸に胸部を開き、コルクボード（ 図2B）に開創を確保。
<LI>左肺をつかみ、左肺動脈と気管支が（ 図3A、B）が露出するまで開胸を通って横方向及び下方に左肺の上部を変位、左手に湾曲した鈍先端が鉗子を使用。
6. 手のひらでアプリケーターとパーム（ 図3C）からポインティング曲がった先端の本体と右手にロードされたチタン血管をマイクロアプリケーターを持ち、左の後面の曲率に沿って胸部にアプリケータ先端部をスライドさせ左気管支及び肺動脈（ 図3D）の肺およびクリップ。
7. アプリケーターを取り外しますが後退し左肺を保つ。右手で鈍先端マイクロハサミを握り、クリップに気管支及び肺動脈遠位をカットし、左肺（ 図3E）を削除。
8. リブリトラクターを削除します。
9. incisiに劣る皮膚から1cmを挟まないように湾曲した鈍鉗子を使用してくださいではなく、振動板のレベルを超えて、皮膚を通して、左胸腔（ 図4A、B）への24のG血管カテーテルを挿入します。
10. 胸腔を閉じるには、4 ^番目と5 ^番目の肋骨の周りに2結節縫合を配置する5-0プロレン縫合糸を使用してください。
11. 肌のリトラクターを削除します。切開の長さに沿って皮膚を近似し、肌が閉じ接着する鉗子の二組を使用してください。
12. 血管カテーテルに3ミリリットルルアーロックシリンジを接続し、穏やかな吸引を適用し、血管カテーテルを引き出すことにより、残留空気を除去する。
13. 首の切開が以前鉗子の二組を使用して閉じた接着。

5.マウスシャム肺全摘術

1. 「マウス肺」プロトコルに記載されているように左肺を公開します。左胸腔内に空気を可能にするために湾曲した鈍鉗子を用いて胸郭を持ち上げて（ 図5A、B）。
2. 左カントーに24のG血管カテーテルを配置左肺を傷つけないように注意しながら、上記のようにracic空洞。
3. 5-0プロレン縫合糸を使用し、肺（ 図5C）を穿刺しないように注意しながら、 ^第 3 / ^第 4に縫合材料の2つの長さと5 ^番目 / 6 ^番目の肋骨隙間（ 図5D）を配置。左肺ヘルニアのリスクを軽減するために抱き合わせ前に縫合材料の両方の長さを置きます。 2、中断ステッチ（ 図5E）を作るために縫合材料を結ぶ。
4. 胸部切開上の皮膚を接着、血管カテーテルで残留空気を除去し、上記のように首の切開を接着。

6.蘇生、鎮痛、および回復

1. イソフルランの電源を切り、ブプレノルフィンの0.1 mg / kgを投与し、生理食塩水を皮下の0.5ミリリットル。
2. 自発呼吸が再開すると、気管内チューブを取り外します。
3. それが再び歩行になるまでマウスを観察します。通常resumウォーキング気管内チューブを除去した後、数分、ES。
4. O / Nを回復するために27℃のインキュベーター（加湿され、25％の酸素）でマウスを置きます。
   注：我々は、手術後の最初の24時間、ケージの床に水で湿らせた固形飼料のいくつかのペレットを配置。
5. 手術後3日間、一日二回腹腔内注射によりブプレノルフィンの0.1 mg / kgをを管理します。動物を扱うときに手術部位をオープンしないように注意してください。

7.マウスの監視

1. 手術後1、3、5、および7日目にマウスを秤量する。

Representative Results

。PNXと偽肺の両方のための100％ - PNXと偽手術マウスの体重のプロットを図6に提供されている我々の手では、生存率は一貫して95です。右肺がこのモデルと予想される時間経過に再成長する方法の詳細については、我々はギブニーら ¹⁵及びWang らの原稿を読者に参照してください^。14

いくつかの一般的な落とし穴が正常マウスPNXとマウス偽肺手順を実行するに避けなければならない。

気管内挿管 ：マウスPNXテクニックを学ぶ多くの研究者は、気管内挿管との難しさを持っている。マウスの喉頭を前方および気管内カテーテルが声帯を通過する必要がありますされると、カテーテルが食道に合格するために、それは簡単です。 図1Aに示したように、鈍い先端がカテーテルをCURVA以下のできるだけ前方ように傾斜する必要があります正中線に沿って舌のトゥーレ、その後静かに圧力を気管内に渡された。ミッド気管カテーテル位置を視覚的に（ 図1B）を確認する必要があります。気管内の配置を穏やかに左右にカテーテル側を移動させ、気管の移動を観察することにより確認することができる。適切な位置決めは、両側性胸上昇を観察することによって確認される。別の技術について説明する。

手術野の作成 ​​：第2の共通の落とし穴十分な開胸ウィンドウを作成するための障害です。 図2Aおよび図2Bに示すように、開胸ウィンドウは左肺動脈、左主気管支の適切な可視化を可能にするために十分に大きく、後方でなければならない。経験の浅い作業者は、一般的に簡単に左肺を撤回し、左肺門にアクセスするために彼の開胸が小さすぎて、前方、またはあまりにも劣るようになります。

血管クリップのアプリケーションシート上：正しく血管クリップを適用することができなかった場合放血になります。へその適切な識別（ 図3A）が重要です。 図3B及び図3Cに示されているように、クリップがクリップアプリケータによりホルダから取り外されると、クリップの端部は、クリップアプリケータの先端と面一であり、クリップの本体は、湾曲したアプリケータ先端部の本体内にある。アプリケーターハンドルの穏やかな閉鎖は、クリップを閉じます。クリップ配向の任意の変化が不十分クリップ閉鎖を生じ得る。クリップは、アプリケータから外れになった場合、したがって、新しいクリップをロードする必要があります。クリップに門の近位を引き裂くしないように同様に、左肺上の牽引力は穏やかでなければなりません。アプリケーターの湾曲した先端は、左肺門（ 図3D）を連結するために左肺の優れた側面の曲線に従うべきである。よくある間違いは、食道の合字です。 図3Eに示されているように

シャムPNX中、左肺傷害の回避 ：経験豊富で経験の浅いオペレーターのおそらく最も一般的な落とし穴は、シャムPNX時の肺障害を残している。 図5に示したように、オペレータは、縫合針で肺を穿刺するか、ヘルニア肺の捕捉を許可しないように開胸閉鎖時に注意する必要があります。これは、リトラクター、空気避難のための24のG血管カテーテル、及び縫合糸（ 図5A-D）を配置する際に肋骨を持ち上げることが重要です。開胸の閉鎖時には、抱き合わせの前に縫合糸の両方の鎖を配置する肺絞扼（ 図5E）のリスクを最小限に抑えることができます。当研究室では、一般的に4に続く4偽の手順を実行します PNXは我々は左肺を傷つけるべきであるPNXマウスに偽マウスを変換することができるように。それはしないすべてのグループが残留左胸部の空気の排出を行うことに留意すべきである。我々の知る限り、データは残留空気の排出ととせずにPNXを比較して存在していない。

練習と経験を、PNXと偽の手続きの両方が単一のセッションで実行されるまでの2ダースのマウス手術を可能にし、10分で達成されるべきである。

1.マウスの気管内挿管図。 （A）経口気管カテーテルは、正中線と、それが前方に喉頭に向かって前進し、角度を付けているように舌を押し下げるために使用されるべきである。（B）半ば気管内カテーテルの適切な位置決めを目視で確認する必要がありますが。「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.マウス開胸図。基本となる胸郭から切開し、皮膚のリリース後に（A）、1.5×1.5センチメートル外科ウィンドウは4 ^番目と5で開胸の作成 ​​後4 ^番目と5 ^番目の肋間スペースを中心とした。（B）が作成されリブ肋間スペース^番目 、リトラクターは、肺を可視化するために使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3.肺。 （A）左L UNGは、湾曲した鉗子で把持し、左肺門（白矢印）を明らかにするために開胸を通じて上昇する。（B）血管クリップ、血管クリップアプリケータの先端が湾曲したアプリケーターチップ内の同一平面に座る必要があります。（C）アプリケーターを手のひらから角度を曲がった先で右手の手のひらに沿って座って、アプリケータの本体と指^番目の右手の親指と4で保持されるべきである。（D）左上葉の曲線に続いて、血管クリップを左門に適用されます。（E）左PNX以下に見られるように、（白矢印の間）食道ちょうど。（血管クリップは白いボックスによって概説）は、左肺門に後方に配置されているの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。

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エア避難のための血管カテーテルの図4.配置。 （A）血管カテーテルの先端が皮膚を貫通。（B）血管カテーテルを胸腔内に横隔膜の上に挿入されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

5.マウスシャム肺図。偽手順の間（A）、配置を開創器に先立って肋骨エッジのリフティングは肺損傷の危険性を最小限に抑えることができます。（B）はPNXためのものであるとして、リトラクターが所定の位置に残されるべきである。（C）胸郭の劣るエッジ過度に胸部の残留空気以下の閉鎖を吸引するために使用する24のG血管カテーテルを配置するとき持ち上げとする必要があります肌をる。（D）胸郭も縫合糸の配置のために持ち上げる必要があります。（E）抱き合わせ前に開胸サイト上の縫合糸の2本鎖を確定すると、肺の閉じ込めの危険性が最小限に抑えられる。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。

図6.期待減量。グループあたり5匹のマウスを使用して、我々は、手術後24時間は、PNXマウスは1.5グラム（7.2％）の平均を失うことになる、と偽マウスは1.1グラム（5.2％）の平均を失うことになることを実証した。両グループは術後3日目までに彼らの術前体重を取り戻す。

Discussion

我々はこれまでに報告マウスPNXとマウス偽PNX手順のほとんどの詳細な説明を提供してきました。私たちは、手順を学ぶ研究者は、一般的に遭遇する、と​​我々はこれらの落とし穴を軽減するために私たちの研究室が開発したいくつかの技術を概説している共通の落とし穴のいくつかの読者は意識してきた。このモデルを利用する他の研究所は、他の技術の変更を開発したか、別の商品を利用している場合があります。テクニックの違いを評価する際に、個々の研究者らは、これらの違いが大幅に実験結果に影響を与えるかどうかを決定する必要があります。

代償性肺成長のマウスPNXモデルは、肺の修復および再生の他の動物モデルよりも多くの利点を有している。ほとんどの研究室¹⁶について達成標的遺伝子欠失実験のメイク系統のトレース、過剰発現遺伝子、および一般的なトランスジェニックマウスの多数が利用可能。第二に、MOR歯槽再成長を定量するためphometric技術は、上述した¹⁷である。第三に、このモデルを採用するコストは中程度である。これらの手順が必要とする唯一の特殊な装置は、血管クリップアプリケーターと鈍先端コーハン-Vannasスプリングはさみです。他のすべての機器は、一般にマウス外科中核施設を通じてマウス外科キットまたは使用可能で提供されます。第四に、経験と、マウスPNXおよび偽PNX手順は同じ日に実行される多くの手術を可能にし、比較的迅速である。最後に、他の動物モデル、適度なハウジングの要件と比較して、マウスのサイズが小さく、かつ、それらがまた、育種することができる容易さは、他の動物モデルよりも維持するマウスモデルを容易にする。

肺の再生の他のモデルに比べてマウスPNXモデルへのいくつかの欠点もあります。マウス代償肺の成長はストレッチ¹⁸に大きく依存するが、代償肺が成長高等哺乳動物におけるTHはストレッチと増加した肺血流¹⁹の両方に依存している。ヒト肺の再生可能性が高い、よりこれらの高等哺乳動物の再生のメカニズムと同様であるので、研究者は人間に直接マウスでの調査結果を外挿する注意する必要があります。マウスの呼吸力学は、人間の呼吸力学とは異なります。ヒトでは、エンド呼気は空気の流れがないものでポーズを伴う。ヒトにおけるエンド呼気に、肺補充は低コンプライアンス胸郭の半径方向の牽引によって維持される。マウスの呼吸サイクルが不完全呼気による空気トラッピング少量の結果として、この呼気ポーズを欠いている。マウスは、はるかに高いコンプライアンス胸部ケージを有するので、肺リクルートメント^20を保持し、この空気トラッピングである。マウスモデルの第3の欠点は、その解剖学的構造である。マウスは、単一の左肺葉を有するため、他のであるように、部分的な左PNXは不可能である種。

いくつかの一般的な落とし穴が正常マウスPNXと偽の手順を実行するために、いくつかの重要な節目に避けなければならない。これらの重要な接合部は、気管内挿管、手術野の作成、血管クリップアプリケーション、および偽手術中左肺損傷の回避である。

これらの外科手術を生き残るために失敗するすべてのマウスの剖検は、将来の外科技術の向上に不可欠である。以下では、いくつかの一般的な問題のトラブルシューティングと成功の大きな度合いをもたらす可能性の代替技術を提供する。

成功しました気管カニューレを挿入するための失敗：他の研究室は、直接可視化の²¹の必要性をなくすオロ気管挿管用サスペンションおよびトランス気管照明を利用している。

門の可視化難易度：大、適切に配置開胸ウィンドウを作成する必要が私です左の門を可視化するn個の順。手順の視覚化の際に不十分であるか、血管クリップアプリケータを挿入するための十分なスペースがない場合には、開胸術を長くする必要があり、開創器を再配置する。この手順の間に血のないプーリングがあってはならない。存在する場合、治験責任医師は、彼が左肺に過度の緊張を置き、左肺動脈を引き裂かれているか否かを決定すべきである。

左肺の除去後の出血：この手順の間少し出血があるはずです。不適切にロードされるか、または適用される血管クリップは、出血の最も一般的な原因であり、その左肺動脈からの出血を持つマウスを安楽死されるべきである。出血のこのタイプが発生した場合、血管クリップと企業のアプリケーションを適切にロードは、適用中にも圧力が再び手順を実行する前に確認すべきである。同様に、左胸に血の知見と術後の死がある不適切な血管クリップアプリケーションに起因する可能性が高い。我々の血管クリップ技術の代替は、絹縫合糸結紮ある。

シャム手術中に左肺損傷は：多くの点で、偽手順はPNX手順より外科的スキルの高い学位を必要とします。左肺は、手術部位以下の24のG血管カテーテルの挿入時、または開胸の閉鎖時に、開胸中に負傷することができます。実験の必要性に応じて、偽手術を受けたマウスは、PNXに変換することができる。左肺損傷の別の潜在的な原因は、開胸サイトの閉鎖時にヘルニア左肺の投獄である。左の肺損傷とシャムマウスを安楽死されるべきいずれか、またはそれらの外科的処置は、PNXに変更されました。

復旧後に呼吸窮迫：麻酔からの回復後に呼吸困難が原因の外傷挿管、不十分な疼痛管理、またはunrecoに声門の腫れから来ることができるgnized肺損傷。一般に、追加の鎮痛薬の投与により軽減苦痛がない限り、動物を安楽死されるべきであると決定引き起こす。複数の挿管の試みはインスピレーションと結果の難しさと腫れ声門や声門下につながる可能性があります。声門が下咽頭から分離された後の剖検では、特許声門開口の欠如が明らかであろう。気管内挿管の別のアプローチは、上記に記載されている。不十分な疼痛コントロールは鎮痛剤の追加投与で対処することができる。上述のように偽の外科手術の手順を学習する際に、意図しない左肺損傷は、一般的であり、認識されていない場合には、呼吸困難および実験結果の変化をもたらすことができる。

過度の体重減少と脱水：手術後の過度の体重減少または脱水を経験するマウスは、連結した食道、不十分な疼痛管理、またはフィードまたは飲むことができないことがある場合があります。食道がjをあるUSTの左門に後部、および食道の連結は、任意の脱水マウスに疑うべきである。不適切な疼痛コントロールは立毛、増加攻撃性、または減少し歩行を有するマウスにおいて疑うべきである。開胸は術後1日目にケージの屋根から吊り下げ食料と水に到達するからマウスを防ぐことができます。麻酔から回復後食べて、飲まないマウスは、唯一のより弱いと脱水になります。私たちは、手術後24時間ケージの床の上に湿らせた食べ物を置くことをお勧めします。

結論として、代償肺の成長のマウス肺モデルは、肺の再生の基礎となるメカニズムを解明するための貴重なモデルです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 inch Vascular clip applicator	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon small titanium red clip	Teleflex Medical (WECK)	1201
Narrow pattern 12 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Curved serrated 10 cm Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
Castroviejo needle holder	Fine Science Tools	12565-14
Straight 9 cm Strabismus scissors (blunt tip)	Fine Science Tools	14075-09
Straight 8.5 cm hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Straight, blunt tip Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-12
Skin glue	Gluture	32046
22 G Angiocatheter
24 G Angiocatheter
3 ml Luer lock syringe
4 Short retractors
2 Long retractors
5-0 Prolene on curved cutting needle	Ethicon	8698G
0.5 ml Syringe on 27 G needle
Normal saline
Buprenorphine
Press-n-Seal wrap	Glad Products Company
12 x 12 inch Cork board stack	Office Depot
70% Ethanol
Betadine
Mouse ventilator	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Type 845
Isoflurane vaporizer	OHMEDA	Excel 210 SE
Artificial tear ointment	Puralube	NDC: 17033-211-38