Abstract
Regulatie van de eiwitsynthese is een belangrijk controlepunt in cellulaire respons op stress. In het bijzonder werden discreet RNA regulerende elementen getoond om selectieve translatie van specifieke mRNA's die coderen voor eiwitten typisch benodigd voor een bepaalde stressrespons. Identificatie van deze mRNAs, evenals de karakterisering van regulerende mechanismen die selectieve vertaling is bij het front van moleculaire biologie enige tijd. Polysoom profilering is een hoeksteen methode in deze studies. Het doel van polysoom profilering is om mRNA translatie vangen door het immobiliseren actief vertalen van ribosomen op verschillende transcripties en scheiden de resulterende polyribosomen door ultracentrifugatie op een sucrose gradiënt, waardoor een onderscheid tussen zeer vertaalde transcripts en slecht vertaald Ones. Deze kunnen vervolgens verder worden gekarakteriseerd door traditionele biochemische en moleculair biologische methoden. Belangrijker nog, een combinatie van polysome profilering met high throughput genomische benadering zorgt voor een grootschalige analyse van translationele regulatie.
Introduction
Regulering van eiwitsynthese (translatie) is een belangrijk cellulair proces dat nauw verbonden is met cellulaire overleving. Gezien het feit dat de vertaling verbruikt meer dan 50% van de energie cel, is het niet verwonderlijk dat de vertaling goed is geregeld en dat verstoringen in de vertaling niet goed verdragen. Omgekeerd, zijn vele afwijkende cellulaire processen vereisen dat de vertaling machines en vertaling uitgang (dwz proteoom) moeten worden aangepast. Dit is vaak het geval in diverse stressrespons en ziektetoestanden en is waarschijnlijk het best geïllustreerd in kanker. Een belangrijk voordeel van translationele controle het vermogen van cellen om snel herprogrammeren het eiwit output in respons op verschillende externe en interne triggers, waardoor fine tuning mechanisme tips het evenwicht tussen celoverleving en dood 1.
Twee aspecten van translationeel controle zijn bijzonder interessant; begrip van de aard van de regulerende mechanism (s) en controle-elementen die het mogelijk maakt specifieke translatie en identificatie van specifieke mRNA's en hun eiwitproducten die deelnemen aan de cellulaire respons op de specifieke trigger die selectief vertaling opgewekt in de eerste plaats. Polysoom profilering is een techniek die effectieve studie van beide processen mogelijk maakt.
De algemene doelstelling van de polysoom profilering techniek is om te studeren en te kwantificeren De vertaling staat van specifieke mRNA's onder verschillende cellulaire condities. Het principe van de techniek is het mRNA translatie vangen door '' bevriezen '' actief vertalen van ribosomen op verschillende transcripties en scheiden de resulterende polyribosomen door ultracentrifugatie op een sucrose gradiënt, waardoor een onderscheid tussen zeer vertaalde transcripts (door meerdere ribosomen gebonden) en slecht vertaald die (één of twee ribosomen gebonden). In dit protocol, het antibioticum cycloheximide dat bindt aan de60S ribosomale subunit en blokkeert de afgifte van gedeacetyleerde tRNA van het ribosoom E site 2, wordt gebruikt om ribosoom translocatie te remmen en kraam ribosomen vertalen mRNA. Echter, andere blokkerende middelen zoals emetine dat ook blokkeert translatie verlenging 3, kan worden gebruikt.
Anders dan de western blotting en 35S-methionine labeling technieken die de uiteindelijke uitvoer van het vertaalproces meten polysoom profilering heeft het voordeel meten ribosomen associatie met actief-vertaald mRNA, waardoor een meer gedetailleerde studie van vertaalmechanismen onder verschillende omstandigheden. Derhalve kan de methode gemakkelijk worden aangepast om specifiek bestuderen verschillende modi vertaling 4-6, eiwitten factoren betrokken bij regulatie vertaling 7-9, stress omstandigheden die eiwitsynthese 1,10,11 of de effecten van mRNA structuren zoals IRES of stroomopwaarts open reading frames op eiwit synthESIS 12-14. Tegenwoordig polysoom profileren toepassingen zelfs ruimer met het gebruik van DNA microarrays 15 of next-generation sequencing 16,17 tot polysomen-geassocieerde mRNA te analyseren.
Protocol
Opmerking: Een opmerking over het werken met RNA: Neem standaard voorzorgsmaatregelen om te beschermen tegen RNA afbraak door RNases. Gebruik handschoenen, barrière pipet tips, RNase vrij plasticware en chemicaliën in alle stappen van het protocol. Gebruik ultrapuur of DEPC-behandeld water voor alle oplossingen. Ontsmet elk vermoeden van oppervlakken met RNase inactivatie oplossing volgens het protocol van de fabrikant.
1. Voorbereiding van Solutions.
- Bereid 500 ml basische oplossing (0,3 M NaCl;. 15 mM MgCl2 6H 2 O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Meng met behulp van een roerstaafje totdat de oplossing helder is en door een 0,45 pm filter. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Bereid 10 en 50% sucrose en 60% oplossingen Chase oplossing als volgt:
- 10% sucrose-oplossing (w / v) in een 50 ml centrifugebuis 5 g sucrose en vul tot 50 ml met basische oplossing. 50% sucrose oplossing (w / v) in een 50 ml centrifugebuis advertentied 25 g sucrose en vul tot 50 ml met Basic Solution.
- 60% (w / v) Chase oplossing in een 50 ml centrifugebuis 30 g sucrose en vul tot 50 ml met basische oplossing. Voeg 100 ul van verzadigde broomfenolblauw-oplossing (voeg broomfenolblauw te water tot niet meer zal oplossen; centrifuge om het onopgelost poeder pellet) tot de 60% achtervolging oplossing. Meng met behulp van een vortex en controleer volledig oplossen.
- Winkeloplossingen bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Bereid RNA lysisbuffer. Bereid deze buffer vers op de dag van het experiment. Bereid 500 ul van RNA lysisbuffer voor elk monster. Aan 1 ml van basische oplossing wordt 10 pl Triton X-100 (1% [v / v] def), 1 ui van 100 mg / ml cycloheximide in DMSO (CHX, 0,1 mg / ml uiteindelijk) en 3,5 ui RNasin (140 U / ml). Meng met behulp van een vortex. Houden op het ijs.
OPMERKING: Cycloheximide is zeer giftig en kunnen mutaties veroorzaken. Vermijd contact met de huid en bij inademing. Om te voorkomen dat de behandeling van de poedervorm te vaak, prepzijn een grotere hoeveelheid van 100 mg / ml voorraad in DMSO, hoeveelheid en bewaar bij -80 ° C voor lange termijn opslag. Blijf werken voorraad bij -20 ° C. - De dag van het experiment bereid Sucrose + CHX oplossingen door toevoeging CHX (eindconcentratie van 0,1 mg / ml) om het gewenste volume van 10% en 50% sucrose-oplossing (~ 7 ml van elke oplossing per gradiënt).
2. Voorbereiding van sucrosegradiënt behulp van een geautomatiseerd Gradient Maker
- Draai de gradiënt maker '' ON '' en het niveau van de plaat die de hellingen zal houden (criticalstep!) Klik op '' OK '' als plaat wordt genivelleerd.
- Selecteer in het menu de gradiënt programma uit te voeren:
- Druk op '' GRAD '' menu en selecteer '' LIST ''.
- Selecteer "SW41".
- Blader door de lijst en selecteer de ''10 - 50% helling - 11 stappen' 'programma door de persing van de 'RUN' 'knop'.
- Plaats een conische ultracentrifuge buis (SW-41 buis, 14 x 89 mm) in de Marker Block en gebruik de meegeleverde fijne buis marker om een merk op te sporen op de buis langs de bovenste trede van het Marker Block. Plaats de buisjes in een passende rek op een stabiele ondergrond.
OPMERKING: Dit merkteken zal de vulling gids voor gelaagdheid de 10 en 50% sucrose oplossingen. - Bevestig de twee meegeleverde canule om twee 10 ml spuiten en wassen door en neer te pipetteren met warm gedestilleerd water met RNase inactivatie oplossing. Zorg ervoor dat u alle sporen van water achteraf te verwijderen.
- Vul een van de spuiten met 10% sucrose + CHX en plaats de canule onderaan de ultracentrifuge buis. Afzien zachtjes 10% sucrose oplossing totdat het gaat net voorbij de stempel op de buis.
OPMERKING: Vermijd het maken van bubbels. Als er bellen te vormen, tik dan zachtjes buis om ze te verdringen. - Vul de andere spuit met 50% sucrose + CHX, veeg extra vloeistof afmet een doekje en breng dan canule aan de onderkant van de ultracentrifuge buis. Afzien voorzichtig de 50% sucrose oplossing totdat het precies de markering bereikt. Snel en soepel te verwijderen van de canule.
OPMERKING: De 10% sucrose moeten stijgen in de buis en vormt een meniscus op de bovenkant. Zo niet, voeg meer 10% sucrose oplossing op het oppervlak. - Plaats de meegeleverde dop door het kantelen van de ultracentrifuge buis lichtjes en het verplaatsen van alle luchtbellen. Verwijder het teveel aan vloeistof in het reservoir van de dop met een micropipet.
- Veeg de overtollige vloeistof langs de buiswand en de plaats op de gradiënt maker plaat.
- Druk op de 'RUN' 'knop'.
OPMERKING: De plaat zal kantelen bij de opgegeven hoek, pauze voor 5 sec en de rotaties te vormen van de helling begint. - Wanneer gradiënt formatie compleet is (ongeveer 2 min, zal de machine een geluidssignaal), verwijder voorzichtig de ultracentrifuge (s), plaats op rek en snel te verwijderen dop in een opwaartse beweging om te voorkomen dat het verstoren van de Gradient.
- Houd gradiënt (s) op het ijs. Niet storen! Als alternatief gradiënten houden overnacht bij 4 ° C.
- U kunt ook gebruik maken van een twee kamer gradiënt maker om gradiënten te maken als volgt:
- Rinse slangen en gradiënt maker met RNase inactivatie oplossing en RNase-vrij water.
- Voeg 5 ml van 50% sucrose + CHX om proximale kamer van gradiënt maker en ervoor te zorgen dat alle lucht tussen de twee kamers is verwijderd.
- Voeg 5 ml van 10% sucrose + CHX tot distale kamer van gradiënt maker.
- Voeg 0,5 ml van 50% sucrose + CHX naar onderkant van een conische centrifugebuis (SW-41 buis, 14 x 89 mm) en plaats in de buishouder.
- Schakel roerder in proximale kamer, geopend stop-lullen en borg gradiënt te hebben op de snelheid ingesteld op "3" (ongeveer 1 ml / min).
- Plaats gradiënt (s) op het ijs. Niet storen.
OPMERKING: Verlopen kan 's nachts worden bewaard bij 4 ° C.
3. Cell Lysis en Ultracentrifugatie.
- Plaats SW-41 rotor en bakken bij 4 ° C en ingesteld centrifuge tot 4 ° C.
- Cellaag op de juiste celdichtheid in de groeimedia ten minste 24 uur voorafgaand aan lysis.
- Bereid een aliquot (20 ml per 150 mm plaat) groeimedium dat 0,1 mg / ml CHX.
- Incubeer cellen in CHX + medium (20 ml per 150 mm plaat) gedurende 3 min bij 37 ° C / 5% CO 2 arrestatie en stabiliseren polysomen.
- Snel werkende, aspireren media uit platen, plaats platen op ijs en was cellen eenmaal met 10 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4) aangevuld met CHX (uiteindelijke concentratie van 0,1 mg / ml) en voorzichtig om langzaam pipet beneden de side van de schotel muur opheffing van de cel monolaag minimaliseren.
- Zuig PBS en voeg nog eens 10 ml PBS + CHX aan elke plaat, schraap cellen met een cel lifter en breng het totale volume van beide platen naar een centrifugebuis van 50 ml op ijs. Behoud 1 ml celsuspensie in een microfuge buis op ijs downstream eiwitanalyse.
- Centrifugeer de 50 ml buis cellen bij 300 g bij 4 ° C gedurende 10 min.
- Verwijder alle PBS en resuspendeer pellet in 500 pl ijskoude RNA lysisbuffer.
- Overdracht celsuspensie een 2 ml microcentrifugebuis.
- Pipet op en neer te lyseren cellen en incubeer op ijs gedurende 10 min met af en vortexen.
- Centrifugeer bij 2000 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten om kernen te pelletiseren.
- Breng supernatant naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis.
- Centrifugeer bij 17.000 xg bij 4 ° C gedurende 5 min celresten pellet.
- Transfer supernatant naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis en gebruik 2 pl te metenoptische dichtheid bij 260 nm (gebruik lysis buffer als blanco).
- Verwijder 50 pi (10% van het totaal) van elk monster voor analyse van totaal RNA. OPMERKING lysaat kan worden opgeslagen bij -80 ° C totdat het nodig is.
- Laden voorzichtig gelijk A260 eenheden op elke sucrose gradiënten (min 10 OD, optimaal 25 OD, in een maximaal volume van 500 pl;. Verdunnen geconcentreerde lysaat met extra lysis buffer indien nodig).
- Zorgen gradiënten op 0,1 g elkaar voor ultracentrifugatie.
- Centrifugeer gradiënten bij 39.000 rpm (260.343 x g) gedurende 1,5 uur bij 4 ° C.
- Tijdens spindown houden rotor rem op en zet hem uit bij vertragen met het 1.000 tpm bereikt.
OPMERKING: Deze stap minimaliseert dat verstoringen van de gradiënten veroorzaakt door abrupte veranderingen in de versnelling als de opzetborstels contact op met de rotor tijdens het remmen.
OPMERKING: De cel lysis procedure is geoptimaliseerd voor twee 150 mm subconfluente (~ 70-80% confluent) platen van HEK293 cellen per gradiënt en de gebruikte hoeveelheden moet worden aangepast voor verschillende cellijnen.
4. Gradient Fractionering System Instrument Set-up.
- Set-up van het instrument en blanco de spectrophotometer met water als volgt:
- Zet de onderdelen en laat de lamp op te warmen gedurende minstens 15 min.
- Zorg ervoor fractie collector is ingesteld op de 'polysoom' methode (persmap pictogram tweemaal; return pijl twee keer om terug te keren naar het startscherm).
- Zorg ervoor dat de klep op de fractie collector is ingesteld op (pijl naar prullenbak pictogram) verspillen. Plaats een erlenmeyer van 250 ml met gedestilleerd water onder de afvalinzameling buis.
- Selecteer de volgende instellingen op de recorder: Set gevoeligheid draaiknop om 'SET LAMP en optica'; ingesteld Noise filter schakelaar op '1.5'; ingesteld Peak separator draaiknop om 'OFF'; set Grafiek speed dial '30 cm / uur "(5 cm / 10 min); ingesteld Baseline Adjust knop (op de top van de spectrofotometer eenheid) om 'MAX OPEN'.
OPMERKING: Optioneel: Een digitale recorder software kan worden gebruikt in plaats van de recorder. Op de computer, klikt u op 'Start'. Een overname venster zal openen: onder thmenu e-opties, uitvinken Pauze graphics. Onder Scaling, grenzen van de grafiek tot -10 en 100 (kan gewijzigd worden on-the-fly tijdens run). Klik op de knop Opslaan om een nieuw bestand aan te maken en op te nemen van de run. - Plaats de spuit en vat in de pomp en plaats aan te draaien (gebruik bijgeleverde schroeven en inbussleutel).
OPMERKING: Niet te vast aandraaien. - Vul de spuit met Chase Solution met behulp van de '' REV '' opdracht bij RAPID snelheid. Plaats de pomp in verticale positie en jagen lucht door de slang met behulp van de '' VOORUIT '' commando. Gebruik alleen RAPID voor deze functie en wast.
- Installeer een ultracentrifuge buis gevuld met RNase-vrij water.
- Pierce de ultracentrifuge buis met de canule tot de twee zwarte stippen zichtbaar (de verdeelopening ligt tussen deze twee markeringen) en start injectiepomp naar '' Manual 'bij 6,0 ml / min.
- Als het water door de stroomcel (bij chase oplossing vult 1/3 van de buis), schakelaar snelheid variabele en op 1,0 ml / min.
- Bij een stroomsnelheid van 1,0 ml / min, pas de Baseline Pas knop op de spectrofotometer totdat de spanning op de kaart op nul (+/- 0,5 eenheden).
OPMERKING: Neem water exit uit het afval buis in de erlenmeyer. - Stel de gewenste gevoeligheid voor '0.5' of '1.0' AU.
OPMERKING: 1.0 AU beste werkt voor 10 OD-eenheden in een gradiënt van 10 ml. Wanneer OD kleiner is dan 10 '0,5' gevoeligheid kan worden gebruikt om het signaal te versterken. - Druk op de Auto Baseline-knop en stel de basislijn instellen naar de 10% markering op de kaart recorder door de Recorder offset wijzerplaat (optioneel bij gebruik van de digitale recorder).
- Zodra een stabiele basislijn wordt bereikt, zet de schakelaar pomp op 'OFF' en de Chart Snelkeuze tot 60 cm / uur bij gebruik van de analoge recorder of 'UIT' bij gebruik van de digitale recorder.
- Recover de Chase Solution door over te schakelen pomp 'REV 'positie (indien nodig kan men debiet terug tot 6,0 ml / min te verhogen ... NIET GEBRUIKEN RAPID) totdat het de eerste stempel op de piercing canule bereikt.
- Verwijder centrifugebuis en jaagt eventuele luchtbellen in de canule door het uitvoeren van een klein beetje van de Chase Solution doorheen. Veeg de piercing podium schoon.
OPMERKING: Sommige restwater kan lekken uit de stroom cel.
5. Gradient Fractionering en verzamelen van monsters.
- Installeer en doorboren de centrifuge buis met de sucrose gradiënt.
- Plaats elf 2 ml microcentrifugebuisjes in de fractie collector tray posities 1-11 zodanig dat de doppen niet boven uitsteken. Vervang '' tube # 1 '' voor nu met een '' waste tube '' om van de vloeistof uit de collector buis te verzamelen.
- Stel de pompregeling draaiknop om 'Handmatig' en debiet op de injectiepomp te '6,0 ml / min' Druk op het pictogram 'Play' op de fractie collector. Zodra de arm de eerste buis bereikt, drukt u op de 'pauze' knop '' (dit is de arm te positioneren en open de-fractie afgiftekraan).
- Start de pomp met behulp van de '' vooruit '' command en bewaken Grafiek recorder pen. Als het begint afbuigen naar boven (wat aangeeft dat monster is die door de stroom cel van de spectrofotometer), snel te vervangen '' afval buis '' met '' tube # 1 ''.
- Wanneer de eerste druppel wordt verzameld, snel schakelen opdrachten om 'Remote start / stop', '' Variable (1,0 ml / min) '' en druk op '' Play '' icoon.
OPMERKING: De pomp wordt nu bestuurd door de fractie collector interface en 1 ml fracties zal elke min worden verzameld. - Vanaf dit punt, zal A260 lezingen verschijnen op de digitale recorder interface (of de analoge grafiek recorder). Zorg ervoor dat de '' Record 'knop op de software wordt gedrukt!
- Na de blauwe Chase Solution komt in de verzamelbuis of de laatste buis (meestal buis 11), drukt u op de 'Stop' icoon.
OPMERKING: De afgeefventiel moet schakelen om het afval klep. - Blijf fracties op ijs totdat alle gradiënten werden gefractioneerd. Aan het eind van de dag fracties kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C voorafgaand aan eiwit of RNA isolatie. Als eiwit en RNA analyse vereist, verdeeld in elke fractie de helft (500 pi elk voor eiwitten en RNA analyse).
6. Was
OPMERKING: (dit is een optionele stap om alleen worden uitgevoerd als er meerdere gradiënten moeten worden verzameld).
- Dompel het afval buis in de erlenmeyer met ~ 50 ml ultrapuur water en het ombuigen van de pomp met behulp van een 6 ml / min debiet.
- Stop de pomp wanneer de Chase Solution het eerste merk o bereiktn de piercing canule.
- Verwijder de centrifugebuis, jagen alle lucht uit de canule en het reinigen van de piercing podium.
OPMERKING: Sommige restwater kan lekken uit de stroom cel. - Herhaal de fractionering procedure vanaf stap 5.1.
7. Final Clean up.
- Koppel de pomp slang van de bodem van de piercer en pomp het Chase oplossing in een 50 ml centrifugebuis met de snelle stroom instelling. Bewaar de Chase oplossing bij 4 ° C als het kan worden hergebruikt.
- Sluit pompslang naar een 3-weg leidingsysteem en sluit de klep leidt naar de spuit. Sluit één buis in een 50 ml injectiespuit gevuld met gedestilleerd water en de andere buis naar de basis van de boor.
- Installeer de ultracentrifuge buis gebruikt voor de blanking stap en passeren ten minste 50 ml gedestilleerd water door de spectrofotometer en de collectie buis (schakelaar aan collectie menu op de interface door te klikken op de '' Start / Pause '' icoon).
- Verwijder buis, spuit (gebruik inbussleutel om de schroeven te verwijderen) en alle andere verwisselbare componenten en grondig wassen met warm water uit de kraan en spoel na met ultrapuur water.
OPMERKING: Wees extra voorzichtig bij het wassen van de zuiger, cilinder, slangen en piercing canule.
OPMERKING: Ga voorzichtig met de glazen cilinder met zorg! Bewaar alle onderdelen uit de buurt van stof. - Veeg bodem van stroomcel met een zachte tissue bevochtigd met gedestilleerd water. Veeg de fractie collector tray en alle andere gebieden waar de sucrose kan zijn gemorst beneden.
8. Isolatie van RNA uit sucrose Breuken.
- Bereid 50 ui proteïnase K oplossing voor elke 1 ml van sucrose fractie (37,5 pl 10% SDS, 7,5 ui 0,5 M EDTA, 1 ui Glycoblue, 4 ui van 20 mg / ml Proteinase K).
- In 2 ml platbodem buis, incubeer 1 ml sucrose fractie met 50 ui proteïnase K-oplossing bij 55 ° Cgedurende 1 uur (bij gebruik van 500 ul fracties volume aanpassen van Proteïnase K oplossing dienovereenkomstig).
- Voeg een gelijk volume fenol: chloroform: isoamylalcohol om het sucrose fracties (125:: 24 1, bij voorkeur zure (pH 4,5) om DNA besmetting te minimaliseren).
OPMERKING: Voeg een extra 200 ul van chloroform aan fracties 7-10, omdat ze zijn zwaarder en fasen kon krijgen omgekeerd.
OPMERKING: fenol / chloroform kan brandwonden bij aanraking en inademing. Draag laboratoriumjas, veiligheidsbril, en gebruik een zuurkast. - Vortex ~ 30 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder ~ 80-90% van de waterfase (niet interphase aanraken die genomische DNA kunnen bevatten) en plaats in de nieuwe buis.
- Voeg een gelijk volume van chloroform en herhaal stap 8.4.
- Verwijder waterfase voorzichtig om interfase vermijden.
- Voeg 1:10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2 (alternatief 5 M ammoniumacetaat worden gebruikt).
- Voeg 1,5 volumes van gekoelde, absolute ethanol en vortex gedurende 15 seconden.
- Neerslaan overnacht bij -20 ° C (of 1 uur bij -80 ° C als in een rush).
OPMERKING: De monsters kunnen in worden gelaten -20 ° C langer indien nodig. - Centrifuge bij maximale snelheid gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Was de pellet met 1 ml koud RNase-free 70% ethanol.
- Lucht droog de pellet en resuspendeer in 20 ul van RNase-vrij water.
- Kwantificeren totaal RNA spectrofotometrisch voldoende opbrengst en zuiverheid (gebaseerd op A260 / 280 ratio) garanderen en ga standaard RT-qPCR analyse 14 met gelijke volumes van elke fractie en PCR primers specifiek voor het mRNA (s) van belang.
9. Isolatie van Eiwitten uit sucrose Breuken.
- Naast RNA kunnen eiwitten worden geïsoleerd en geïdentificeerd in afzonderlijke fracties polysoom ook. Gebruik een van de vele uitstekende protocollen beschikbaar voor het eiwit afzonderlijk, bijvoorbeeld 18.
Representative Results
We hebben recent beschreven een nieuwe rol van de tumor suppressor PDCD4 als een selectieve remmer vertaling van IRES-herbergen mRNAs coderend apoptotische remmers XIAP en Bcl-xL 12. Polysoom profilering was een belangrijke techniek om de specifieke rol van PDCD4 in IRES-gemedieerde translatie tonen. HEK293 cellen werden transient getransfecteerd om endogene niveaus van PDCD4 (Figuur 1A) afbreken en vervolgens onderworpen aan profiel analyse polysoom. We observeerden dat het verminderen van niveaus PDCD4 geen ongunstige wereldwijde cellulaire translatie, zoals beoordeeld door gebrek van veranderingen in het polysoom profiel bij vergelijking siCTRL en siPDCD4 behandelde cellen (Figuur 1B). Evenzo polysoom distributie van niet-IRES variant van XIAP 19 onveranderd tussen behandelde en onbehandelde cellen (figuur 1C). Daarentegen polysoom verdeling van de twee IRES-herbergen mRNAs, XIAP en Bcl-xL werd significant veranderd. Aangezien PDCD4 de verdeling van deze twee mRNA wordt verschoven in zwaar ribopolysomes (figuur 1D, E). Aangezien dit niet wordt gekenmerkt door veranderingen in steady-state niveaus van XIAP en Bcl-xL mRNA (Figuur 1F) Deze resultaten demonstreren verbeterde vertaling van XIAP en Bcl-xL in cellen met verminderde PDCD4 niveaus, die verder werd bevestigd door Western blotting (Figuur 1G).
Figuur 1:. Polysoom profilering identificeert PDCD4 als selectieve remmer van XIAP en Bcl-xL vertaling (A) HEK293 cellen werden behandeld met siRNA PDCD4 of control (CTRL), niet-targeting siRNA, gelyseerd en onderworpen aan Western blot analyse met anti-PDCD4 en anti-nucleoline antilichamen verifiëren mate van PDCD4 Knock-down. (B) PDCD4 werd neergeslagen als in (A) encellysaten werden onderworpen aan profilering polysoom. Vertegenwoordiger polysoom profiel wordt weergegeven in het bovenste paneel; verdeling van de XIAP niet-IRES (C), Bcl-xL (D), en XIAP IRES (E) mRNAs opzichte van die van GAPDH wordt weergegeven als het percentage van de totale mRNA (% mRNA) in elke fractie. (F) Steady -State mRNA niveaus werden gemeten met RT-qPCR in PDCD4 siRNA of besturing (CTRL) siRNA behandelde cellen. (G) De lysaten van (A) werden ook onderworpen aan Western blot analyse met anti-XIAP, anti-Bcl-xL, en anti-nucleoline antilichamen. (NB. De gegevens in figuur 1 werden oorspronkelijk gepubliceerd in 12) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Polysomale profilering is een techniek die het mogelijk maakt voor de kwantificering van de stand van de vertaling van specifieke transcripten in verschillende behandelingsomstandigheden. Het is een zeer eenvoudige techniek in principe nog verscheidene stappen uitgevoerd, waarvan sommige kritisch voor het produceren van goede polysoom profielen vereist. De belangrijkste stappen zijn: 1) met RNase-vrij chemicaliën en plasticware, 2) het bereiden goed sucrose gradiënten (in onze ervaring een 10-50% sucrose gradiënten beste werken voor efficiënt oplossen 40 / 60S subeenheden en mRNAs met gebonden ribosomen) en 3 ) met cellen die exponentieel groeien en niet meer dan 80% confluent om de hoogste vertaling vangen. Deze laatste stap moet rekening worden gehouden bij het doen van lange cel behandelingen, zoals gentherapie knockdown of overexpressie, waardoor het aantal cellen plaat een functie van hoeveel de cellen confluent worden bij het eindpunt is.
In de resultaten presented hier, polysoom profiel analyse is een belangrijk instrument voor de beoordeling PDCD4 rol in de vertaling regulering van de IRES-herbergen mRNA XIAP en Bcl-xL 12. Het feit dat we geen verandering in de algemene polysoom profielen op PDCD4 knock-down (Figuur 1B) heeft gehouden, konden we concluderen dat PDCD4 niet aantasten wereldwijde cellulaire vertaling onder de voorwaarden van het experiment. We vervolgens gebruikte RT-qPCR analyse om de verdeling van de XIAP en Bcl-xL mRNA in cellen behandeld met PDCD4 of controle siRNA bepalen. qPCR is een voorkeursmethode voor het analyseren polysoom profielen, in tegenstelling tot standaard RT-PCR of Northern blotting, omdat het zorgt voor een kwantitatieve plaats semi-kwantitatieve analyse van mRNA distributie en voor het detecteren van subtiele veranderingen in translationele efficiency tussen behandelingen. Met deze techniek konden we aantonen dat de verdeling van de XIAP en Bcl-xL mRNA (uitgedrukt als percentage van totaal doelwit-mRNA in de gradient) was significant verschoven in zwaar polyribosomen (mRNAs met een groot aantal ribosomen verbonden hen) na PDCD4 neerhalen (figuur 1D, E), hetgeen wijst op een toename vertaling van deze mRNAs. Dit werd verder bevestigd door een toename XIAP en Bcl-xL eiwit niveaus maar niet in de steady-state-RNA (Figuur 1F, G). Belangrijk is dat de polysoom verdeling van de niet-IRES variant van XIAP onveranderd tussen behandelde en onbehandelde cellen (figuur 1C). Als alternatief zou translationele efficiëntie worden gepresenteerd als een verhouding van mRNA gehalte in polysomen (fracties meestal 5 tot 10) versus monosomes (gewoonlijk fracties 2-4) 14.
Het gebruik van controles in de hele protocol is belangrijk bij het valideren van elke polysoom profileren resultaat, zoals pieken waargenomen uit metingen van de absorptie bij 254 nm kan niet op zichzelf worden toegeschreven aan ribosomaal RNA (detergents, zoals Triton X-100 sterk absorberen in dit gebied van het spectrum en kunnen 40 / 60S pieken bij de top van de gradiënt verduisteren). Blanco verlopen zonder lysaat en / of lysaat buffer moeten worden uitgevoerd om de relatieve bijdrage van de buffers aan de absorptie te bepalen op 254 nm. Artefact hogere orde structuren kan leiden tot foutieve interpretaties van polysomen waar er in feite geen (bijvoorbeeld "pseudo-polysomen" 20). Sekwestrerende magnesium (gebruikt in de procedure 80S ribosomen stabiliseren) met tweewaardige kationen chelator EDTA toegevoegd aan lysaten en de gradiënt buffer (20 mM gedurende 15 minuten) wordt de scheiding van het ribosoom veroorzaken in zijn samenstellende kleine (40S) en grote (60S ) subeenheden. Dus als absorptie pieken opgenomen bij 260 nm inderdaad polysomen, EDTA behandeling het profiel zodat een maximum wordt waargenomen boven in verloop dat overeenkomt met vrij mRNA en ribosomaal eenheden instorten (data niet getoond). Samenvallendmet-EDTA veroorzaakte ineenstorting van het profiel, alle van de specifieke doelen van qPCR geanalyseerd moet nu gevonden worden op de top van de helling.
Het aantal ribosomen verbonden met een mRNA is niet altijd een indicatie van hoe efficiënt dat specifieke mRNA wordt vertaald. Inderdaad, er zijn specifieke contexten waarin actieve vertaling op polysomen raakt vastgelopen 21,22 die de lezer bewust van moet zijn. Bepalen of transcripten actief betrokken bij de vertaling werktuig worden uitgevoerd door a) het behandelen van het monster met puromycine, die in tegenstelling EDTA veroorzaakt 'run-off' ribosomen die actief translokatie over een mRNA, of b) het behandelen van het monster met homoharringtonine die translocatie van alleen de eerste ribosoom bij de start codon remt, waardoor opnieuw 'run-off' van een downstream translocerende ribosomen.
Het gebruik van mRNA voor qPCR analyse is ook kritisch. De Selectie van transcripten die niet worden beïnvloed door verschillende behandelingsomstandigheden zoals sommige housekeeping genen (GAPDH, actine, tubuline, nucleoline), ribosomale mRNA (18S, Rpl13a) of in dit geval de niet-IRES variant van de XIAP IRES is belangrijk verifiëren of de behandeling het effect op de vertaling is specifiek of gegeneraliseerd. Deze mRNA kan worden gebruikt om de verdeling van de geanalyseerde mRNA zoals hier gedaan normaliseren (XIAP en Bcl-xL mRNA werden genormaliseerd tot GAPDH mRNA en uitgedrukt als percentage van het totale mRNA gehalte vertegenwoordigd door de som van mRNA gehalte in elke fractie ) of als alternatief, kan doelstellingen en controle mRNA's worden uitgedrukt in absolute waarden en afzonderlijk weergegeven. qPCR analyse van de invoer lysaten (gewoonlijk 10% van het totale volume) is een stap die voor de controle van specifiek mRNA. Idealiter dient het mRNA gehalte van een specifiek transcript in de input lysaat vergelijkbaar met de som van mRNA gehalte in alle 10 fracties geanalyseerd worden. EindelijkEen optionele stap om te controleren voor de fenol: chloroform-extractie wordt iedere polysoom fractie piek bij een in vitro getranscribeerd reporter mRNA (zoals CAT, chlooramfenicol acetyltransferase), die vervolgens zullen worden gekwantificeerd door qPCR en kan zelfs worden gebruikt voor het normaliseren gegevens 14.
Zoals bij elke techniek, de polysoom profilering presenteert een aantal beperkingen. Het feit dat gewoonlijk minimaal 10 fracties (subtielere verschuivingen in translatie efficiëntie noodzakelijk kunnen 20 of meer) worden verzameld om mooie polysoom distributies maakt deze stap beperkt, in die zin dat slechts een maximum van 4 monsters kunnen worden tegelijkertijd geanalyseerd kunnen gemakkelijk hanteren RNA extractie en qPCR analyse van 40 monsters en 4 invoerregelaars tegelijk. De steekproefomvang kan gemakkelijk oplopen met hoeveel afschriften moeten worden geanalyseerd en hoeveel qPCR repliceert te doen, en dit kan kostbaar zijn. Een andere beperking van een qPCR-gebaseerde polysomale profilering van eenNALYSE is dat het alleen kan worden uitgevoerd op een kandidaat benadering (waarbij de transcripten te analyseren tevoren niet bekend) en kan niet worden toegepast genoom-brede analyse van de vertaling. Echter, aan het begin van de 21 ste eeuw, begonnen de onderzoekers om hun polysomale RNA ondervragen op een genomische niveau met behulp van DNA microarrays 15 en meer recent met de next-generation sequencing 16,17. In deze krachtige benadering wordt polysomale profilering uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol, behalve dat in plaats van het uitvoeren van qPCR analyse van individuele fracties, monosomes fracties (gewoonlijk fractie 2-4) en Polysomen fracties (gewoonlijk fracties) worden samengevoegd en variaties in wereldwijde vertaling geanalyseerde door DNA microarray of hele genoom RNA sequencing. Vandaar dat met deze aanpak, is het mogelijk om te beoordelen alle mRNA's waarvan de distributie verschuift van polysomen naar monosomes (afname in vertaling) of vice-versa (toename in vertaling) op een specifieke traktatiement. Validatie en kwantificatie van mRNA polysomen verdeling kan gedaan worden met qPCR. Een nog krachtiger gebruik van het polysomale profilering principe ribosoom profilering. Verder hoge doorvoer uitbreiding van deze techniek werd onlangs dat maakt gelijktijdige controle van honderden polysoom fracties 23. Dit verschaft een duidelijk voordeel bij sonderen translationele efficiëntie van mutant verzamelingen of grootschalige RNAi screens. Ribosoom profilering is een techniek die gebruik maakt van next generation sequencing om RNA-fragmenten beschermd door ribosomen (ribosoom voetafdrukken) betrokken bij de eiwitsynthese 24,25 in kaart. In deze techniek kan ribosoom translocatie worden geremd met cycloheximide (reversibel) of emetine (irreversibele) gevolgd door cellysis en RNase digestie een populatie van ribosoom voetafdrukken opleveren. Ribosomen zijn verrijkt, totaal RNA wordt geïsoleerd en verontreinigende ribosomale en mitochondriale ribosomale RNA wordt verwijderd.RNA voetafdrukken van ongeveer 26-28 nucleotiden zijn geïsoleerde, reverse getranscribeerd, omgezet in een cDNA-bibliotheek en de sequentie 26. In tegenstelling tot standaard polysoom profilering, deze aanpak niet alleen identificeert specifieke mRNA's die translationeel worden gereguleerd, maar levert ook mRNA-specifieke informatie op codon resolutie, zoals de exacte bezetting en de dichtheid van ribosomen langs een specifieke transcript. Dit is vooral van belang voor mRNA's met specifieke vormen van vertalingen, zoals IRES-herbergen mRNA's, omdat het meer informatie over waar op het transcript ribosoom-recruitment plaatsvindt kon geven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
