Abstract
Регулирование синтеза белка представляет собой ключевой точкой управления в клеточный ответ на стресс. В частности, регуляторные элементы осторожным РНК было показано, что позволит селективного перевода специфических мРНК, которые, как правило, кодируют белки, необходимые для конкретной реакции на стресс. Выявление этих мРНК, так и характеристики регуляторных механизмов, ответственных за селективного перевода был в авангарде молекулярной биологии в течение некоторого времени. Полисом профилирование является краеугольным метод в этих исследованиях. Цель полисом профилирования является захват трансляции мРНК путем иммобилизации активно перевод рибосомы на различных транскриптов и отделить полученные с помощью ультрацентрифугирования полирибосомы на градиенте сахарозы, что позволяет обеспечить различие между высоко переведенных транскриптов и плохо переведенных из них. Они могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью традиционных биохимических и молекулярных методов биологии. Важно отметить, что объединение рolysome профилирование с высокой пропускной геномных подходов позволяет крупномасштабного анализа поступательного регулирования.
Introduction
Регулирование синтеза белка (трансляция) является одним из ключевых клеточный процесс, который тесно связан с клеточной выживаемости. Учитывая, что перевод потребляет более 50% энергии клетки, это не удивительно, что перевод жестко регулируется и что возмущения в переводе не хорошо переносится. И наоборот, многие аномальные клеточные процессы требуют, чтобы перевод Приборы и выход перевод (т.е. протеом) должны быть изменены. Это часто бывает в различных реакция на стресс и болезненных состояний, и, вероятно, лучше всего иллюстрируется в рак. Ключевым преимуществом поступательного контроля является способность клеток к быстро перепрограммировать выход белка в ответ на различные внешние и внутренние триггеры, тем самым прекрасно механизм настройки, который склоняет чашу весов между выживания и гибели клеток 1.
Два аспекта поступательного контроля особенно интересны; понимание природы нормативной тесhanism (ы) и контрольные элементы, которые позволяют для конкретного перевода, а также определение специфических мРНК и их белковых продуктов, которые участвуют в клеточном ответе на конкретном триггера, вызвавшей селективного перевода в первую очередь. Полисом профилирование является метод, который позволяет эффективно изучение обоих процессов.
Общая цель технике полисом профилирования является изучение и количественную оценку перевода состояние специфических мРНК в различных клеточных условиях. Принцип метода заключается в захвате перевод мРНК путем '' замораживания '' активно перевод рибосомы на различных транскриптов и отделить получившиеся полирибосомы ультрацентрифугированием на градиенте сахарозы, что позволяет проводить различие между высоко переведенных транскриптов (связанного несколько рибосом) и плохо переведены те (обязательность одного или двух рибосом). В данном конкретном протоколе, циклогексимид антибиотик, который связывается с60S субъединицы рибосомы и блокирует высвобождение деацетилированного тРНК из рибосомы E сайта 2, применяется для подавления рибосом перемещение и тормозить рибосомы на переводе мРНК. Тем не менее, другие блокирующие агенты, такие как эметина, что перевод также блокирует удлинение 3, могут быть использованы.
В отличие от западной блоттинга и 35 S-метионина методов маркировки, которые измеряют конечный результат процесса перевода, полисом профилирование имеет преимущество измерения рибосомы ассоциацию с активно-переводных мРНК, что позволяет более детального изучения механизмов перевода в различных условиях. Следовательно, способ может быть легко адаптирован к специально изучать различные режимы перевода 4-6, белки факторов, участвующих в регуляции перевода 7-9 стрессовых условиях, влияющих на белковый синтез 1,10,11 или эффекты мРНК структур, таких как IRES или вверх по течению открытые рамки считывания на белковой синтезаторетезы 12-14. В настоящее время, полисом профилирования приложения, даже шире, с использованием ДНК-микрочипов 15 или следующего поколения секвенирования 16,17 анализа полисом-связанные мРНК.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Замечание по работе с РНК: Возьмите стандартные меры предосторожности для защиты от деградации РНК по РНКаз. Используйте перчатки, советы барьер пипеток, РНКазы Пластик и химикаты на всех этапах протокола. Используйте сверхчистого или DEPC-очищенной воды для всех решений. Дезактивации любых подозреваемых поверхностей с РНКазы инактивации решения следующей протоколом производителя.
1. Подготовка решений.
- Приготовления 500 мл основной раствор (0,3 М NaCl;. 15 мМ MgCl 2 6H 2 O; 15 мМ Трис-HCl, рН 7,4). Смешайте с помощью мешалки, пока раствор не станет прозрачным и проходить через 0,45 мкм фильтр. Хранить при комнатной температуре.
- Подготовьте 10 и 50% растворы сахарозы и 60% Chase решение следующим образом:
- Для 10% раствор сахарозы (в / о), в 50 мл центрифужную пробирку добавляют 5 г сахарозы и заполнить до 50 мл базового раствора. 50% раствор сахарозы (вес / объем), в трубке рекламу 50 мл центрифужнуюd 25 г сахарозы и заполнить до 50 мл базового раствора.
- Для 60% (вес / объем) раствор Chase, в 50 мл центрифужную пробирку добавляют 30 г сахарозы и заполнить до 50 мл с основным раствором. Добавить 100 мкл насыщенного бромфеноловым синий раствор (добавить бромфенола голубого к воде, пока не более растворится; центрифуга для осаждения нерастворенный порошок) в 60% -ном растворе погони. Смешайте с помощью вихрь и проверить полного растворения.
- Хранить растворы при 4 ° С до использования.
- Подготовка РНК буфера для лизиса. Приготовьте этот буфер свежий на день эксперимента. Подготовка 500 мкл буфера для лизиса РНК для каждого образца. К 1 мл основной раствор добавляют 10 мкл тритона Х-100 (1% [объем / объем] окончательным), 1 мкл 100 мг / мл в ДМСО циклогексимид (CHX, 0,1 мг / мл) и окончательное 3,5 мкл Rnasin (140 U / мл). Смешайте с помощью вихрь. Держите на льду.
Примечание: Циклогексимид обладает высокой токсичностью и могут вызвать мутации. Избегать контакта с кожей и вдыхания. Чтобы избежать обработки в виде порошка слишком часто, подготовительныеявляются большее количество 100 мг / мл в ДМСО складе, аликвоты и хранить при -80 ° С для длительного хранения. Продолжайте работать запас при -20 ° С. - В день эксперимента, подготовить Сахароза + СНХ Solutions добавлением СНХ (конечная концентрация 0,1 мг / мл) до нужного объема 10% и 50% раствора сахарозы (~ 7 мл каждого раствора в градиенте).
2. Подготовка градиент сахарозы с использованием автоматизированной Gradient Maker
- Поверните градиента производитель '' на '' и выровнять пластину, которая будет содержать градиенты (criticalstep!) Нажмите на '' Done '', когда пластина выравнивается.
- Выберите в меню градиента программу, которая будет работать:
- Нажмите '' ГРАД '' и выберите '' списке ''.
- Выберите "SW41".
- Просмотрите список и выберите ''10 - 50% градиент - 11 шагов "программу" по прессепо кнопке '' RUN ''.
- Поместите коническую Ультрацентрифуга трубку (SW-41 трубки, 14 х 89 мм) в маркер блока и использовать предоставленный прекрасно трубки маркер проследить след на трубе вдоль верхней ступени Маркер блока. Поместите трубки в примерочной стойку на устойчивую поверхность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот знак будет руководство начинка для наслоения 10 и 50% сахарозы решения. - Прикрепите два предоставленную канюли для двух 10 мл шприцев и мыть с помощью пипетки вверх и вниз с теплой дистиллированной водой, содержащей РНКазы инактивации решение. Обязательно удалите все следы воды впоследствии.
- Заполните один из шприцы с 10% сахарозы + СНХ и вставить канюлю в нижней части ультрацентрифужную пробирку. Аккуратно распределить 10% раствор сахарозы, пока он идет только мимо знака, поданная на трубе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырей. Если пузырьки образуют, слегка постучите трубку, чтобы вытеснить их. - Заполните другой шприц с 50% сахарозы + СНХ, протрите дополнительную жидкость отс вытирают и осторожно вставить канюлю в нижней части ультрацентрифужную пробирку. Осторожно обойтись 50% раствор сахарозы, пока не достигнет точно в цель. Быстро и плавно извлечь канюлю.
Примечание: 10% сахарозы должна подниматься в трубке и образуют мениск в верхней части. Если нет, то добавить больше 10% -ный раствор сахарозы на поверхности. - Вставьте прилагаемый колпачок, слегка наклонив Ультрацентрифуга трубку и вытесняя все пузырьки воздуха. Удалить лишнюю жидкость в резервуаре колпачка с micropipet.
- Протрите излишки жидкости вдоль стенки трубы и место на градиент производителя пластины.
- Нажмите кнопку '' RUN ''.
ПРИМЕЧАНИЕ: Планшет будет наклонять на определенный угол, пауза 5 секунд и поворотов, чтобы сформировать градиент начнется. - Когда градиент формирование завершено (около 2 мин, устройство подает звуковой сигнал), аккуратно удалите ультрацентрифугу (ы), место на стойке и быстро удалить крышку в восходящем движении, чтобы избежать нарушения gradieнт.
- Держите градиент (ы) на льду. Не беспокоить! В качестве альтернативы, градиенты держать в течение ночи при 4 ° С.
- Кроме того, использование двух камерный градиент производителя сделать градиенты следующим образом:
- Промыть трубопровод и градиент производитель раствором РНКазы инактивации и РНКазы воды.
- Добавить 5 мл 50% сахарозы + СНХ к проксимальной камеры градиентного производителя и гарантировать, что любой воздух между двумя камерами удаляется.
- Добавить 5 мл 10% сахарозы + СНХ в дистальной камеры градиента производителя.
- Добавляют 0,5 мл 50% сахарозы + СНХ к нижней части конической центрифужной пробирке (SW-41 трубки, 14 х 89 мм) и поместить в держатель трубки.
- Включите мешалкой, помещенной в проксимальных камеры, открытых стоп-краны и депозитов градиента на скорости, установленной на "3" (о 1мл / мин).
- Место градиент (ы) на льду. Не беспокоить.
Примечание: градиенты могут быть сохранены в течение ночи при 4 ° С.
3. лизиса клеток и Ультрацентрифугирование.
- Поместите SW-41 ротор и ведра на 4 ° С и набор центрифуги до 4 ° С.
- Пластина клеток в соответствующей плотности клеток в ростовой среде, по крайней мере 24 ч до лизиса.
- Готовят аликвоту (20 мл на 150 мм пластины) из питательной среды, содержащей 0,1 мг / мл СНХ.
- Выдержите клетки в СНХ + СМИ (20 мл на 150 мм пластины) в течение 3 мин при 37 ° C / 5% CO 2, чтобы арестовать и стабилизировать полисом.
- Работа быстро, аспирация СМИ из пластин, место пластин на льду и мыть клетки один раз 10 мл ледяной холод фосфатным буферным раствором (PBS: 137 мм NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4) дополнить с CHX (конечной концентрации 0,1 мг / мл), стараясь, чтобы пипетка медленно вниз SIDе чашки стены, чтобы свести к минимуму подъем клеточный монослой.
- Аспирируйте PBS и добавляют дополнительные 10 мл PBS + СНХ к каждой пластине, очистить клетки с сотовым подъемника и передавать полный объем от обеих пластин к 50 мл центрифужную пробирку на льду. Сохранение 1 мл клеточной суспензии в пробирке на льду в течение нисходящего анализа белков.
- Центрифуга 50 мл трубки из клеток при 300 х г при 4 ° С в течение 10 мин.
- Удалить все PBS и ресуспендируют осадок в 500 мкл ледяного буфера для лизиса РНК.
- Передача клеточной суспензии в 2 мл микроцентрифужных трубки.
- Пипетка вверх и вниз, чтобы лизировать клетки и инкубируют на льду в течение 10 мин при периодическом вортексе.
- Центрифуга на 2000 мкг при 4 ° С в течение 5 мин для осаждения ядер.
- Трансфер супернатант в новую 2 мл микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга на 17000 мкг при 4 ° С в течение 5 мин для осаждения остатков клеток.
- Трансфер супернатант в новую 2 мл микроцентрифужных трубки и использовать 2 мкл для измеренияОптическую плотность при 260 нм (использование в качестве буфера для лизиса пустым).
- Удалить 50 мкл (10% от общего числа) из каждого образца для анализа общей РНК. ПРИМЕЧАНИЕ Lysate может храниться при -80 ° С до использования.
- Аккуратно загрузите равные единицы A260 на каждый градиентах сахарозы (мин 10 OD, оптимальных 25 OD, в максимальном объеме 500 мкл;. Разбавить концентрированную лизата с дополнительным буфером для лизиса при необходимости).
- Обеспечить градиенты в пределах 0,1 г друг с другом до ультрацентрифугированием.
- Центрифуга градиенты на 39000 оборотов в минуту (260343 х г) в течение 1,5 ч при 4 ° С.
- Во spindown держать ротора тормоза, а выключить его во время торможения, когда он достигает 1000 оборотов в минуту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг минимизирует нарушения градиентов, вызванных резкими изменениями ускорения, как щеточные головки связаться ротор во время торможения.
Примечание: Эта процедура лизис клеток оптимизирован для двух 150 мм субконфлюентные (~ 70-80%) сливной пластин HEK293 клеток на градиенте и объемы, используемые возможно, должны быть скорректированы для различных клеточных линий.
4. Градиент Фракционирование Система Instrument Set-до.
- Настройка прибора и пустые Индекс Spectrophotometer водой следующим образом:
- Включите компонентов и дайте лампе прогреться в течение по крайней мере 15 мин.
- Убедитесь, коллектор фракций устанавливается на методе «полисом» (пресс значок папки дважды; возвращение стрелка дважды, чтобы вернуться на главный экран).
- Убедитесь, что клапан на коллектор фракций устанавливается тратить (стрелка, указывающая на мусорном значок бен). Поместите 250 мл колбу Эрленмейера, содержащую дистиллированную воду под сбора отходов трубки.
- Выберите следующие параметры на самописце: Set Чувствительность набрать в "SET ФАРЫ И ОПТИКА"; установить фильтр шума переключатель '1,5'; установить Peak разделитель режимов в положение OFF,; установить Chart быстрого набора '30 см / час "(5 см / 10 мин); установить Базовый Отрегулируйте диск (на верхней части спектрофотометра устройства) для "MAX открыть '.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно: программа цифрового рекордера можно использовать вместо самописец. На компьютере, нажмите на кнопку "начать". Окно приобретение откроет: под гоМеню е параметры, снимите флажок Pause графика. Под Scaling, установить ограничения на графике, чтобы -10 и 100 (может быть изменен на лету во время работы). Нажмите на кнопку Сохранить, чтобы создать новый файл и записать пробег. - Поместите шприц и ствол в насосе и затянуть на место (использование при условии винтов и шестигранного ключа).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не затягивайте. - Наполните шприц Chase решения с помощью '' REV '' команду на быстрой скорости. Поместите насос в вертикальном положении и преследовать воздух через трубку при помощи команды '' FORWARD ''. Используйте только быстро для этого функции и моет.
- Установите ультрацентрифужную пробирку, наполненную РНКазы без воды.
- Пирс ультрацентрифужную пробирку с канюлей, пока два пометками видны (дозирующее отверстие расположено между этими двумя метками) и начать шприцевой насос на '' Руководство '' по 6,0 мл / мин.
- Когда вода проходит через проточную ячейку (при сХасэ решение заполняет 1/3 трубки), скорость переключения в переменной и устанавливается на 1,0 мл / мин.
- При скорости потока 1,0 мл / мин, отрегулировать Базовый диск Регулировка на спектрофотометре, пока напряжение на графике не равен нулю (+/- 0,5 единиц).
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте воды выход из отходов трубки в колбу. - Установите требуемую чувствительность к '0,5' или '1.0' АС.
ПРИМЕЧАНИЕ: 1.0 AU лучше работает для 10 единиц ОП в градиентом 10 мл. Если ОП ниже, чем 10, '0,5' чувствительность может быть использован для повышения сигнала. - Нажмите кнопку Auto Baseline и отрегулировать базовые настройки на 10% отметки на самописце, повернув Recorder смещение диска (дополнительно при использовании цифрового диктофона).
- После того, как стабильный базовый достигается, включите переключатель насоса в положение OFF, и дерево Быстрый набор на 60 см / ч при использовании аналогового самописец или "OFF" при использовании цифрового диктофона.
- Восстановление Chase решение путем переключения насоса "REПоложение V '(в случае необходимости можно увеличить скорость потока обратно к 6,0 мл / мин ... НЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ быстрого), пока он не достигнет первого метку на пирсинг канюли.
- Удалить центрифужную пробирку и преследовать любые воздушные пузыри внутри канюли, запустив немного Чейз решения по нему. Протрите этап пирсинг в чистоте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые остаточная вода может просачиваться из проточной ячейки.
5. Градиент фракционирование и сбор проб.
- Установка и прокалывают центрифужную пробирку, содержащую градиенте сахарозы.
- Поместите одиннадцать 2 мл микроцентрифужных пробирок в коллектор фракций позиций лотка 1-11, так что колпачки не выступают вверх. Заменить "'труба # 1' 'на данный момент с' 'отходов трубы' 'для сбора жидкости осталось в НКТ коллектора.
- Установите управления насосом диск для "Manual" и расход на шприцевой насос на "6,0 мл / мин ' Нажмите на иконку 'Play' на коллектор фракций. Как только рука достигнет первой трубки, нажмите кнопку '' пауза '' (это будет позиционировать руку и открыть фракции-раздаточного клапана).
- Запустите насос с помощью команды '' FORWARD '' и контролировать самописец ручку. Когда она начинает отклонения вверх (указывая, что образец, проходящий через ячейку потока спектрофотометра), быстро заменить '' отходов трубу '' с '' трубка # 1 ''.
- Когда первая капля собирают, быстро переключаться команды на "дистанционный пуск / остановка ',' 'Variable (1,0 мл / мин)' 'и нажмите' 'Play' 'значок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Насос теперь управляется с помощью интерфейса фракция коллектора и 1 мл фракции будут собираться каждые мин. - С этой точки зрения, показания A260 появится на цифровой интерфейс рекордера (или аналог диаграммы Рекордаг). Убедитесь, что '' Запись '' при нажатии кнопки на программное обеспечение!
- После синий Чейз Решение попадает в собирающий трубку или последний трубу (как правило, трубка 11), нажмите значок 'Stop'.
ПРИМЕЧАНИЕ: распределительный клапан должен перейти к клапану отходов. - Хранить фракций на льду до тех пор, пока все градиенты были фракционируют. В конце дня фракций можно хранить при -80 ° С до белка или выделения РНК. Если белок и РНК анализ необходим, разделить каждую фракцию пополам (500 мкл каждый для белков и анализа РНК).
6. Промойте
ПРИМЕЧАНИЕ: (это необязательный шаг должны быть выполнены, только если несколько градиенты должны быть собраны).
- Погрузите отходов трубку в колбу Эрленмейера, содержащей ~ 50 мл сверхчистой воды и обратного насоса при скорости потока 6 мл / мин.
- Остановите насос, когда Чейз Решение достигает первого знака Oн пирсинг канюли.
- Снимите центрифужную пробирку, преследовать любое воздух из канюли и очистить сцену пронзительный.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые остаточная вода может просачиваться из проточной ячейки. - Повторите процедуру фракционирования, начиная с шага 5.1.
7. окончательной очистки.
- Отключите трубку насоса из нижней части пирсингу и накачать Chase решение в 50 мл центрифужную пробирку, используя настройки быстрого потока. Хранить Chase растворе при 4 ° С, как это может быть повторно использована.
- Подключите трубки насоса к системе труб 3 пути и закрыть клапан, ведущий к шприцу. Подключение одну трубку с помощью шприца на 50 мл, заполненной дистиллированной водой, а другой трубки к основанию прошивного стана.
- Установите Ультрацентрифуга трубку, используемую для гашения шаг и пройти по крайней мере, 50 мл дистиллированной воды через спектрофотометра и сбор трубки (переход на меню сбора на интерфейсе, нажав на '' Starт / Пауза '' значок).
- Снимите трубку, шприц (используйте шестигранный ключ, чтобы удалить винты) и все другие съемные компоненты и тщательно вымыть с помощью теплой водопроводной воды, а затем промыть особо чистой воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте особую осторожность при мытье поршня, цилиндр, трубки и пирсинг канюли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь шприца стекло с осторожностью! Храните все компоненты от пыли. - Протрите нижнюю часть проточной кювете с мягкой ткани, смоченной в дистиллированной воде. Протрите лоток коллектор фракций и любые другие области, в которых, возможно, была пролита сахарозы.
8. Выделение РНК из сахарозы фракций.
- Подготовка 50 мкл раствора протеиназы К на каждые 1 мл фракции сахарозы (37,5 мкл 10% ДСН, 7,5 мкл 0,5 М ЭДТА, 1 мкл Glycoblue, 4 мкл 20 мг / мл протеиназы К).
- В 2 мл с плоским дном трубки, инкубировать 1 мл фракции сахарозы с 50 мкл раствора протеиназы К при 55 ° Св течение 1 ч (при использовании 500 мкл фракции регулировать объем раствора протеиназы К, соответственно).
- Добавить равный объем фенола: хлороформа: изоамилового спирта (125: 24: 1, предпочтительно от кислой (рН 4,5), чтобы свести к минимуму загрязнение ДНК) к фракции сахарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить дополнительные 200 мкл хлороформа, фракций 7-10, потому что они тяжелее и фазы могли быть перевернутой.
ПРИМЕЧАНИЕ: фенол / хлороформ может вызывать ожоги при контакте и вдыхании. Носите халат, защитные очки, и использовать fumehood. - Вихревой ~ 30 сек и центрифуге при максимальной скорости в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Снимите ~ 80-90% водной фазы (не прикасайтесь межфазного которые могут содержать геномной ДНК) и место в новой трубки.
- Добавить равный объем хлороформа, и повторите шаг 8,4.
- Удалить водную фазу будьте осторожны, избегайте интерфазу.
- Добавить объем 1:10 3 М ацетата натрия, рН 5,2 (альтернативно 5 М ацетата аммония может быть использована).
- Добавить 1,5 объемов охлажденного, ABSOLUТе этанол и вихрь в течение 15 сек.
- Осадок в течение ночи при -20 ° С (или 1 ч при -80 ° С, если в спешке).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть оставлены в -20 ° C в течение более, если это необходимо. - Центрифуга при максимальной скорости в течение 30 мин при 4 ° С.
- Промыть гранулу с 1 мл охлажденного РНКазы 70% этанола.
- Воздух сухой гранул и ресуспендируют в 20 мкл РНКазы воды.
- Количественная общей РНК с помощью спектрофотометрии, чтобы обеспечить адекватное выход и чистоту (на основе А260 / соотношении 280) и перейти к стандартной анализа RT-КПЦР 14, используя равные объемы каждой фракции и ПЦР праймеров, специфичных к мРНК (ов), представляющие интерес.
9. Выделение белков из сахарозы фракций.
- В дополнение к РНК, белки могут быть выделены и идентифицированы в отдельных фракций полисом, а также. Используйте один из многих отличных протоколов, доступных для изоляции белка, например 18.
Representative Results
Недавно мы описан новый роль в супрессора Pdcd4 качестве селективного перевода ингибитора IRES-укрывательство мРНК, кодирующих апоптоза ингибиторы XIAP и Bcl-XL 12. Полисом профилирование был ключевой метод, чтобы продемонстрировать конкретные участие Pdcd4 в IRES-опосредованного перевода. Клетки НЕК293 временно трансфицировали истощать эндогенные уровни Pdcd4 (1А) и затем подвергают полисом Профиль Анализ. Мы наблюдали, что снижение уровней Pdcd4 не нарушить глобальную сотовую перевод, судя по отсутствия изменений в профиль полисом, когда по сравнению siCTRL и siPDCD4 обработанных клеток (рис 1B). Аналогичным образом, полисом распределение не-IRES варианта XIAP 19 не изменилась между обработанными и необработанными клетками (рис 1в). В отличие от этого, полисом распределение двух IRES-укрывательстве мРНК, XIAP и Bcl-XL, был значительно изменен. При отсутствии РDCD4 распределение этих двух мРНК сдвигается в тяжелых ribopolysomes (рис 1D, E). Так как это не сопровождается изменениями в стационарных уровней XIAP и Bcl-XL мРНК (рис 1F) Эти результаты показывают, усиливается перевод XIAP и Bcl-XL в клетках с пониженными уровнями Pdcd4, которое в дальнейшем подтверждено Западной промокательной (рис 1G).
Рисунок 1:. Полисом профилирование идентифицирует Pdcd4 как селективный ингибитор XIAP и Bcl-XL перевода (А) НЕК293 клетки обрабатывали Pdcd4 миРНК или управления (CTRL), ненацеливании миРНК, лизировали и подвергали Вестерн-блот-анализа анти-Pdcd4 и анти-нуклеолина антитела проверить степень Pdcd4 нокдауна. (B) Pdcd4 был сбит как в (А) иКлеточные лизаты подвергают полисом профилирование. Представитель профиль полисом показан на верхней панели; Распределение XIAP не-IRES (С), Bcl-XL (D), и XIAP IRES (Е) мРНК по отношению к количеству GAPDH показан как процент от общего мРНК (% мРНК) в каждой фракции. (F) Устойчивый -состояние уровни мРНК измеряли с помощью ОТ-кПЦР в Pdcd4 миРНК или управления (CTRL) миРНК обработанных клеток. (G) лизаты из (А) были также подвергнуты Вестерн-блоттинга с анти-XIAP, анти-Bcl-XL, и анти-нуклеолина антитела. (NB. Данные представлены на рисунке 1 были первоначально опубликованы в 12) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Polysomal профилирование является мощным средством, что позволяет для количественной оценки состояния перевода специфических транскриптов в различных условиях лечения. Это очень простая техника, в принципе, все же это требует нескольких шагов исполнения, некоторые из которых имеют решающее значение для получения хороших профилей полисом. Эти ключевые шаги: 1) с помощью РНКазы химических веществ и Пластик, 2) подготовка хороших сахарозы градиенты (в нашем опыте 10-50% сахарозы градиенты работают лучше всего для эффективного решения 40 / 60S субъединицы и мРНК с связанных рибосом), и 3 ) с использованием клеток, которые экспоненциально растущих и не более 80% сливной для того, чтобы захватить самые высокие темпы перевода. Этот последний шаг должны быть приняты во внимание при выполнении процедуры, длинные клеток, таких как ген нокдауна или сверхэкспрессии, так что количество клеток к пластине будет функцией от того, сколько клетки будут сливающийся в конечной точке.
В результатах изложеТед здесь, полисом анализ профиля является важным инструментом для оценки Pdcd4 роль в регуляции трансляции из МРСЭ-укрывательстве мРНК XIAP и Bcl-XL 12. Тот факт, что мы не наблюдали каких-либо изменений в общих профилей полисом на Pdcd4 бросовым (рис 1В) позволил нам сделать вывод, что Pdcd4 не нарушить глобальную сотовую перевод в условиях эксперимента. Мы рядом используется анализ RT-КПЦР определить распределение XIAP и Bcl-XL мРНК в клетках, обработанных Pdcd4 или контроля миРНК. КПЦР является методом выбора для анализа профилей полисом, в отличие от стандартного RT-PCR или нозерн-блоттинга, потому что это дает возможность количественной, а не полуколичественного анализа распределения мРНК и для обнаружения тонких сдвигов в эффективности между трансляционной обработок. Используя эту технику, мы смогли показать, что распределение XIAP и Bcl-XL мРНК (выражено в виде процента от общего мРНК-мишени через грadient) был значительно смещен в тяжелых полирибосом (мРНК с большим количеством рибосом, связанных с ними) после Pdcd4 нокдауна (рис 1D, E), что свидетельствует об увеличении перевода этих мРНК. Это было далее подтверждено увеличением XIAP и Bcl-XL уровней белка, но не в их стационарных уровней РНК (рис 1F, G). Важно отметить, что распределение полисом от не-IRES варианта XIAP был неизменным между обработанной и необработанной клеток (рис 1в). В качестве альтернативы, поступательное эффективность может быть представлен как отношение содержания мРНК в полисом (обычно фракций от 5 до 10) по сравнению с monosomes (обычно фракций от 2 до 4) 14.
Использование элементов управления на протяжении протокола важно при проверке любой полисом профилирования результат, как пики, наблюдаемые из значений оптической плотности при 254 нм не могут самостоятельно отнести к рибосомной РНК (моющего средстваы, такие как Triton X-100 сильно поглощают в этой области спектра и может скрывать 40 / 60S пики в верхней части градиента). Пустые градиенты без лизата и / или лизата с буфером должны быть запущены, чтобы определить относительный вклад буферов к поглощению при 254 нм. Артефактного высшие структуры порядка могут также привести к ошибочным интерпретациям полисом, где есть фактически ни (например, "псевдо-полисом" 20). Секвестрации магний (используется в течение всей процедуры, чтобы стабилизировать 80S рибосомы) с двухвалентным катионом хелатора ЭДТК добавлен в лизатах и в буфер градиент (20 мМ в течение 15 мин) будет вызывать разделение рибосомы на составные малых (40S) и большие (60S ) подразделения. Таким образом, если пики абсорбции, записанные на 260 нм, действительно полисом, лечение ЭДТА разрушится профиль таким образом, чтобы один максимум будет наблюдаться в верхней части градиента, который соответствует освободить мРНК и рибосомных единиц (данные не показаны). Совпадающийс ЭДТА-индуцированной распада профиль, все конкретные цели, проанализированных кПЦР теперь должны быть найдены в верхней части градиента.
Число рибосом, связанных с мРНК не всегда является показателем того, насколько эффективно, что особенно мРНК переводится. В самом деле, есть определенные условия, в которых активное перевод на полисом становится застопорились 21,22 котором читатель должен быть в курсе. Определение или нет стенограммы активно занимаются с переводом оборудования может быть сделано путем) обработки образца с пуромицином, который в отличие от ЭДТА, вызывает «стоки» рибосом, которые активно транслокации через мРНК, или б) обработки образца с homoharringtonine который ингибирует транслокацию только первый рибосомы на стартовый кодон, снова вызывая «стоки» о любых последующих транслокации рибосомы.
Использование контрольных транскриптов для анализа КПЦР также имеет важное значение. Selecции транскриптов, которые не зависят от различных условий обработки, таких как некоторых генов домашнего хозяйства (GAPDH, актин, тубулин, нуклеолина), рибосомных мРНК (18S, RPL13A) или в данном случае не-IRES варианте XIAP IRES, играет важную роль в проверки, если эффект лечения на перевод специфичен или обобщить. Эти контрольные транскрипты можно использовать для нормализации распределение анализируемых мРНК, как было сделано здесь (XIAP и Bcl-XL мРНК были нормализованы к GAPDH мРНК и выражали как процент от общего содержания мРНК, представленной на сумму содержания мРНК в каждой фракции ) или, альтернативно, целевые и контрольные мРНК может быть выражена как абсолютных значений и показаны отдельно. КПЦР анализ входных лизатов (обычно 10% от общего объема) является еще одним шагом, который будет контролировать для распределения специфических мРНК. В идеале, содержание мРНК транскрипта определенного во входном лизата должна быть сопоставима с суммой содержания мРНК во всех проанализированных 10 фракций. В конце концов, Необязательный шаг для контроля фенола: шаг хлороформом является шип каждый полисом фракции с в пробирке транскрипции репортера мРНК (например, CAT, хлорамфеникол ацетилтрансферазу), которые будут впоследствии количественно кПЦР и даже может быть использован для нормализации Данные 14.
Как и в любой технике, полисом профилирование представляет некоторые ограничения. Тот факт, что, как правило, не менее 10 фракций (более тонкие изменения в эффективности перевода может потребоваться 20 или более) должны быть собраны, чтобы иметь хорошие дистрибутивы полисом делает этот шаг ограничения, в том смысле, что только максимум 4 образцов может быть проанализированы в то время, чтобы иметь возможность удобно обрабатывать экстракции РНК и КПЦР анализ 40 образцов и 4 управления вводом сразу. Размер выборки можно легко добавить с сколько стенограммы должны быть проанализированы и сколько КПЦР повторяет сделать, и это может быть дорогостоящим. Другим ограничением в КПЦР основе polysomal профилированиянализ в том, что это может быть сделано только на кандидата на основе подхода (где транскрипты, которые будут проанализированы, как известно заранее) и не может быть применен для генома анализа перевода. Тем не менее, в начале 21-го века, исследователи начали допрашивать их polysomal РНК в геномной уровне с использованием ДНК-микрочипов 15 и совсем недавно с следующего поколения секвенирования 16,17. В этой мощной подхода, polysomal профилирование выполняется, как описано в данном протоколе исключением того, что вместо выполнения КПЦР анализ отдельных фракций, monosomes фракций (как правило, фракция 2-4) и полисом фракций (обычно фракции) объединяются вместе и вариации в глобальном переводе проанализированы по ДНК микрочипов или целого генома РНК последовательности. Поэтому при таком подходе, можно оценить все мРНК, распределение сдвигов от полисом для monosomes (уменьшение в переводе) или наоборот (увеличение в переводе) на определенном удовольствияния. Проверка и количественное определение конкретного распределения мРНК полисом может быть сделано путем кПЦР. Еще более мощным использование принципа polysomal профилирования является рибосома профилирование. Дальнейшее расширение высокая пропускная этой техники недавно сообщалось, что позволяет для одновременного наблюдения сотен полисом фракций 23. Это обеспечивает явное преимущество при зондировании поступательные КПД мутантных коллекций или в крупных экранов РНК-интерференции. Рибосомы профилирование является метод, который использует преимущества следующего поколения последовательности на карту фрагменты РНК, защищенные рибосом (рибосом следы), участвующих в синтезе белков 24,25. В этой технике, рибосома транслокации может быть подавлено с циклогексимидом (обратимой) или эметина (необратимой) с последующим лизисом клеток и гидролиза РНКазой с получением популяции рибосом следов. Рибосомы обогащены, общая РНК выделяют, и загрязнение рибосомальная и митохондриальная рибосомальной РНК удаляется.РНК следы примерно 26-28 нуклеотидов изолированы, обратной транскрипции, превращается в библиотеке кДНК и последовательность 26. В отличие от стандартного полисом профилирования, этот подход не только определяет конкретные мРНК, которые поступательно регулируется, но также дает мРНК-конкретную информацию при разрешении кодонов, такие как точное оккупации и плотности рибосом вдоль определенного транскрипта. Это особенно интересно для мРНК с конкретными видами перевода, таких как IRES-укрывательстве мРНК, так как это может дать больше информации о том, где на стенограмме рибосомы вербовки происходит.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
