En mus Føtal Skin Model af scarless sårheling

Introduction

Føtal hud sår heler hurtigt, og scarlessly indtil sent i drægtighedsperioden ^1. Føtal scarless sårheling er kendetegnet ved regenerering af normalt væv arkitektur og funktion. Overgangen fra en scarless til ardannelse fænotype forekommer i tredje trimester af graviditeten hos mennesker og omkring fosterdag 18 (E18) i mus ^2,3. I forhold til voksne, er føtal sår reparation præget af hurtig epitelialisering, bindevæv aflejring, og fibroblast migration.

Mange undersøgelser har tilbudt mulige forklaringer på fænomenet scarless sårheling i den tidlige fosterudvikling. Inflammation er et grundlæggende element i voksne sår reparation; imidlertid føtale sår er kendetegnet ved en mangel på akut inflammation ^4. Hvorvidt dette er en følge af den funktionelle umodenhed af immunsystemet under føtale stadier forbliver uklar. En nylig undersøgelse foreslog, at forskelle i overflod, maturity, og funktion af mastceller i E15 vs E18 føtal hud kan være ansvarlig for overgangen fra en scarless fænotype, i hvert fald i musen ^3. Andre undersøgelser postulere, at forskelle i egenskaber og overflod af føtale og voksne sår makrofager er ansvarlige for reformation af normal ekstracellulær matrix (ECM) under føtal sårheling ^5.

Forskelle i miljøfaktorer under føtal og voksen udvikling kan også påvirke sårheling. Longaker og kolleger har vist, at sårvæske fra fosteret besidder høje niveauer af hyaluronsyre-stimulerende aktivitet sammenlignet med ingen i voksen sårvæske ^6. Følgelig kan højere niveauer af hyaluronsyre, en glycosaminoglycan, der fremmer en mikromiljø befordrende for cellemotilitet og proliferation i den føtale sårmiljø ansvarlig for scarless fænotype set i den tidlige fosterudvikling. Andre linjer af beviser peger på, at fetal sårmiljø er relativt hypoxemiske og nedsænket i steril fostervand rig på vækstfaktorer ^7. Der er dog ikke endeligt svar er givet for en kritisk begivenhed eller faktor under embryogenese, der udløser overgangen fra scarless regenerering til fibrotisk reparation.

Forstå de mekanismer ansvarlige for scarless helbredelse i fosteret kræver en præcis og reproducerbar model. Her har vi detaljeret en reproducerbar model af føtalt scarless sårheling i dorsum E16.5 (scarless) og E18.5 (ardannelse) museembryoer. Derudover kan mindre ændringer af denne model anvendes til at udføre en række yderligere undersøgelser, såsom genekspression analyse af føtale sår og hud ^8,9. Da netop timede graviditeter er afgørende for en vellykket sammenfatning af denne føtal scarless sårheling model, vi også detaljer vores protokol for superovulation timed graviditeter.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer er beskrevet i dette dokument, er udført i overensstemmelse med retningslinjer, som Stanford Administrative Panel om Laboratory Animal Care (Aplac).

1. Tidsindstillet graviditeter - Superovulation Teknik (figur 1)

BEMÆRK: Netop timing gestationsalder på museembryoer for føtal kirurgi ved E16.5 og E18.5 er af afgørende betydning. I dette afsnit detalje vores protokol for timing mus graviditeter hjælp drægtige hopper serum (PMS) og human choriongonadotropin (HCG) injektioner at fremkalde superovulation.

1. Injicer hunmus (<5 per bur) intraperitonealt (IP) med 3,0-5,0 internationale enheder (IE) af PMS i et volumen på 100 pi PBS 1:00 til 3:00 for dag 1.
2. Mellem 12.00 og 14:00 af dag 3 (femogfyrre til 47 timer efter PMS injektion), injiceres hunmus IP med 3,0-5,0 IE HCG i et volumen på 100 pi PBS.
   BEMÆRK: HCG injektion inducerer ægløsning ca. 12 timer efter injektion.
3. Umiddelbart efter HCG injektioner, parre hunner med mænd i alderen 8-16 uger.
   BEMÆRK: Vi lægger typisk to hunner i et bur af individuelle hanner.
4. Separate kvinder fra mænd om morgenen den dag 4 (6:00 til 10:00) og optage som fosteralderen E0.5.
   BEMÆRK: Vaginal stik kan kontrolleres på dette tidspunkt; imidlertid observation af en vaginal prop ikke garantere graviditet og hunner kan blive gravid, når ingen plug overholdes. Da graviditet er typisk observeres ved visuel inspektion og / eller palpering ved svangerskabsuge aldre E16.5 og E18.5, kontrol for vaginale propper om morgenen den dag 4 er ikke strengt nødvendigt. Det er vores erfaring, og afhængigt af den stamme, cirka 30-50% af super-ægløsning hunner blive gravid ved hjælp af teknikken beskrevet her.

pg "/>
Figur 1. Skematisk for Superovulation Teknik. Skematisk viser procedure for superovulation timet graviditeter i mus. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

2. Murine Føtal Surgery (Dorsal Anskydning) på E16.5 og E18.5 embryoner (figur 2)

1. Før proceduren, rense alle overflader på operationsstuen og udstyr med 70% isopropylalkohol. Desuden sterilisere alle kirurgiske forsyninger og instrumenter, der vil blive anvendt i proceduren ved autoklavering dem. Nogle institutioner kan tillade efterfølgende brug af varmt perle sterilisation. Per drift, brug sterile pakninger, der omfatter gaze og kirurgiske instrumenter.
2. Fremkald anæstesi hos gravide mødre (føtal alder E16.5 eller E18.5) under 2,5% isofluran / ilt blanding ved 2 L pr min, efterfulgt af vedligeholdelse af anæstesi på 1 l pr min.
3. Til Confast ordentlig bedøvelse, sikre de dybe pedal reflekser med musen undertrykkes og placere musen i liggende stilling.
4. Påfør en dyrlæge oftalmisk salve, såsom Puralube at forebygge øjenirritation eller tørhed under proceduren.
5. Forbered maven ved at administrere en let anvendelse af hårfjerningsmiddel ikke længere end 30 sek (figur 2A).
6. Forbered maven til aseptisk kirurgi med povidon-iod og alkohol (figur 2B og 2C).
7. Udfør midterlinjen laparotomi under mikroskopet med mikrokirurgiske saks (figur 2D og 2E).
8. Udsætte forsigtigt livmoderen og fosteret udvalgt til kirurgi (figur 2F).
9. Skyl kirurgiske område med varmt (38 ° C) phosphatbufret saltvand (PBS) under anvendelse af en stump spids nål
   BEMÆRK: Man kan ske ved forsigtigt at bøje spidsen af ​​en stor kanyle. (Figur 2G og 2H).
10. Placer fosteret på en måde, der tilladers fuld adgang til dorsum.
11. Pass en pung streng søm hjælp 7-0 nylonsutur gennem livmoderen overliggende stedet for påtænkte dorsal såret (figur 2I). Position pung streng over en region dorsum til venstre eller højre for rygmarv, og i et område af livmodervæggen uden store blodkar.
12. Lav en 3 mm snit gennem livmodervæggen og fosterhinden i centrum af pungen streng (figur 2J).
13. Skyl incisionssted med varmt (38 ° C) PBS.
14. Brug mikrokirurgiske sakse, skære en enkelt fuld tykkelse excisional sår, ca. 1 mm i længden, i dorsum af fosteret.
15. Forsigtigt skamplet incisionssted tør med bomuld-tip applikator.
16. Indsprøjtes 3 ​​pi volumen tusch subkutant i sårstedet at markere placeringen af såret (figur 2K).
17. Skyl med varmt (38 ° C) PBS for at sikre blæk er bevaret inden for sårstedet.
18. Har kirurgisk assistent inject varm (38 ° C) PBS gennem stumpe spids 10 G sprøjten i fosterhinden som pung streng er lukket (figur 2L). Træk sprøjten som pung streng lukning nærmer sig sin afslutning (Figur 2 M).
19. Forsigtigt tilbage livmoderen i bughulen (figur 2 N).
20. Evert huden og peritoneum.
21. Har kirurgisk assistent overrisle bughulen med varmt (38 ° C) PBS.
22. Luk maven hurtigt ved hæftning huden og peritoneum lukket (fig 2O). Standarden lukning udføres i to lag; peritoneum og abdominal muskel i ét lag, subkutant væv og hud i det andet lag. For øjeblikkelig offer og høst af fosteret, vores demonstration viser lukning i ét lag.
23. Placer dyret under observation i en varm inkubator ved 37 ° C i 30 minutter, eller indtil dyret kommer tilstrækkelig bevidsthed at opretholde brystleje.
24. Må ikke RETurn dyret til selskab med andre dyr, indtil det er helt efter proceduren.
25. Efter vågner fra anæstesi og under den efterfølgende 48 timer, administrere subkutan injektion af buprenorphin (0,05 mg / kg) hver 12 timer for analgesi efter behov på grundlag af smerte vurdering. Indgives carprofen (5 mg / kg) via subkutan injektion for yderligere post-operativ smertelindring efter behov.
26. Retur dyr til buret og give dem mad og vand ad libitum.
27. Overvåg nøje for manifestationer af smerte.
28. 48 timer efter operationen, ofrer gravide mor med en overdosis af isofluran og høst såret foster. For at gøre dette, justeres isofluran koncentration til 5% eller højere og vedligeholde eksponering i 1 min efter ophør af vejrtrækning. Bekræft eutanasi med cervikal dislokation. Høst en læderet embryo for alder-matchede kontrol. Sene embryoner skal have et separat metode til eutanasi i overensstemmelse med IACUC anbefalinger, såsom decapitation, cervikal dislokation, eller kemisk indsprøjtning.

Figur 2. Skematisk for Murine føtalt Surgery. Generelle trin til dorsal såret i E16.5 og E18.5 musefostre. (A) Depilation af muse maven. (B og C) Fremstilling af muse maven. (D) mikroskop anvendes til kirurgisk procedure. (E) Midline laparotomi. (F) Eksponering af livmoderen. (G) Oprettelse af stump-spids nål. (H) Vanding af uterus med varmt saltvand. (I) Oprettelse af pung streng sutur. (J) snit gennem uterus væg- og 1 mm fuld tykkelse excisional sår generation. (K) Subkutan injektion af tusch. (L og M) Lukning af pung streng sutur. (N og O)Lukning af maven. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Representative Results

For histologisk analyse bør kutane sår i den dorsale hud af E16.5 og E18.5 museembryoer høstes 48 timer efter sårdannelse, fikseret i 4% PFA, og paraffinindstøbt. I fluorescerende transgene modeller, kan kryopræservering med oktober være passende. Der er flere pletter, som kan anvendes til at visualisere celle- og bindevæv arkitektur. Hematoxylin og eosin er en to-farvet plet, pletter kerner blå og eosinofile strukturer (dvs.., Cytoplasma og ekstracellulære collagen) forskellige nuancer af rød, pink og orange. Mallory trichrom er en tre-farve plet består af anilin blå, syrefuschin og orange G, er bedst egnet til at adskille celler fra omgivende bindevæv.

Figur 3. Histologi scarless E16.5 Føtal sår. (A) hematoxylin og eosinfarve reVeals fuldstændig reepitelisering og en svag stigning i antallet af inflammatoriske celler til stede (pile). (100x; bar = 100 um) (B) eosinfarve viser tusch (pilespidser) omkring regenererende hårsækkene (pil) (400x; bar = 25 . um) (C) Mallory trichrom pletten afslører en fin retikulære dermal collagen mønster med tilstedeværelse af en hårsækken (400x; bar = 25 um). Genoptrykt med tilladelse fra Colwell et al. ¹⁰ Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Hvis dorsale Excisionssår er af passende størrelse (1 mm) og dybde (fuld tykkelse), vil hematoxylin og eosin-farvning viser, at E16.5 huden heler med minimal ardannelse, fuldstændig reepitelisering, og kun en lille stigning i antallet af inflammatoriske celler (figur 3A). Desuden er disse wounds bør helbrede med omtrent normal hud arkitektur og indeholder regenererende hårsækkene inden skadestedet (pile; figur 3B). Korrekt anvendelse af tusch til frisk skabt sår bør resultere i blæk aflejring ved skadestedet (pilespidser; figur 3B). Endelig bør trichromfarvning afsløre en fin retikulære dermal collagen mønster karakteristisk for unscarred dermis (figur 3C).

Figur 4. Histologi ardannelse E18.5 Føtal sår. (A) hematoxylin og eosinfarve afslører en stigning i eosinfarvning i dermis på skadestedet (pile). (200x; bar = 50 um) (B) Mallory trichrom plet viser tætte dermal collagen (pile) (400x; bar = 25 um). Genoptrykt med tilladelse fra Colwell et al.¹⁰

I forhold til sår foretaget på E16.5, hematoxylin og eosin farvning af dorsale sår foretaget på E18.5 og høstet 48 timer efter sårdannelse skal afsløre en tæt ar med tab af normal hud arkitektur på skadestedet (figur 4A). Tilsvarende trichromfarvning afslører et tæt mønster af uorganiseret kollagen deposition (pile; figur 4B). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Den kirurgiske protokol præsenteres her beskriver en excisional model af føtalt murine scarless healing først udgivet i 2006 af vores laboratorium ^10. Ud over andre etablerede modeller af excisional såret ^11, incisional modeller af føtal murine scarless healing eksisterer så godt ^12,13. Undersøgelser af føtal scarless sårheling hos aber, lam, kanin, opossum, og rotte er rapporteret ^14-17. Dog udgør mus en ideel model for at udforske føtal scarless sårheling på grund af deres forholdsvis lave pr-diem bur omkostninger og velkarakteriseret genom. Desuden kan tidslige og rumlige genetiske tab / gevinst på funktion opnås under fosterudviklingen hjælp murine transgene systemer, der tilbyder muligheder for præcist dechifrere mekanismer scarless reparation.

På trods af disse fordele, mus præsentere visse tekniske udfordringer i føtal kirurgi på grund af deres lille størrelse. I betragtning af denstress af anæstesi på en gravid mor, skal der udvises stor omhu for at overvåge indholdet af isofluran / oxygen bliver administreret. En blanding af 2,5% isofluran / oxygen på 2 l pr min efterfulgt af vedligeholdelse af anæstesi på 1 l pr min bør nøje overholdes. Afvigelser eller udsving i denne kritiske faktor kan få alvorlige konsekvenser sygelighed. Korrekt placering af tasken sutur repræsenterer den mest teknisk udfordrende aspekt af kirurgi. Manglende placere denne søm korrekt, vil resultere i udsivning af fostervand og PBS post-lukning. En utilstrækkelig mængde væske i livmoderen vil resultere i traumer embryoner og kan inducere tidlig uterin kontraktion. Af denne grund, udskiftning af tabt ved åbning af livmoderen fostervand er også et kritisk trin i denne kirurgiske model. Der skal udvises forsigtighed til løbende skubbe varm PBS som pung streng er lukket. Disse faktorer krævede betydelige fejlfinding og vi understreger, at opmærksomhed på disse detaljervil øge sandsynligheden for en vellykket operation. Men selv dem med erfarne kirurgiske hænder skal planlægge en morbiditet på ca. 40% i E16.5 fostre.

Forståelse føtal scarless sårheling besidder værdi for translationel medicin rettet mod in vivo modulering af fibrogene adfærd under voksne stadier af udvikling. I forhold til voksne hud, føtal hud har et udviklingsland dermis, nedsat brudstyrke, vordende hårsækkene, og forskellige ECM komponenter ^2,4. Føtal hud har en forhøjet forhold mellem kollagen type III til type I i forhold til voksne hud, færre og mindre modne mastceller, udtryk for keratiner 8 og 19, og højere niveauer af hyaluronsyre i forhold til voksen hud ^4,9. Ved at decifrere mekanismerne bag scarless helbredelse i fosteret, kan vi begynde at styre de molekylære og cellulære veje, der er ansvarlige for fibrose i den voksne mod en regenerativ fænotype. Fremkomsten of afstamning sporing og andre genetiske værktøjer i musen har åbnet lovende nye muligheder for undersøgelse af føtal scarless sårheling. I betragtning af de iboende høje sygelighed og for tidlig livmoderen forbundet med føtal kirurgi, undersøgelser af føtalt scarless hud sårheling in vivo kræver en præcis og reproducerbar kirurgisk model. Her har vi detaljeret en reproducerbar model af føtalt scarless sårheling i dorsum E16.5 (scarless) og E18.5 (ardannelse) museembryoer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9 mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058