Introduction
Fostrets hud sår läker snabbt och scarlessly förrän sent i dräktigheten 1. Fostrets scarless sårläkning präglas av förnyelse av normal vävnad arkitektur och funktion. Övergången från ett scarless till ärrbildning fenotyp sker i den tredje trimestern av graviditeten hos människor och kring embryonala dag 18 (E18) i möss 2,3. I jämförelse med vuxna, är foster sårläkning kännetecknas av snabb epithelialization, bindväv nedfall, och fibroblast migration.
Många studier har erbjudit möjliga förklaringar till fenomenet scarless sårläkning under tidig fosterutveckling. Inflammation är en grundläggande komponent i vuxen sårläkning; dock fetala sår kännetecknas av en brist på akut inflammation 4. Huruvida detta är en konsekvens av den funktionella omognad av immunsystemet under fosterstadier förblir oklart. En färsk studie antydde att skillnader i överflöd, mattaurity och funktion av mastceller i E15 vs E18 fostrets hud kan vara ansvarig för övergången från ett scarless fenotyp, åtminstone i mus 3. Andra studier posit att skillnader i egenskaper och överflöd av foster och vuxna lindade makrofager är ansvariga för reformering av normala extracellulära matrix (ECM) under foster sårläkning 5.
Skillnader i miljöfaktorer under fetal och vuxen utveckling kan också påverka sårläkning. Longaker och kollegor visade att sårvätska från fostret besitter höga nivåer av hyaluronsyra-stimulerande aktivitet jämfört med ingen i vuxen sårvätska 6. Följaktligen kan högre nivåer av hyaluronsyra, en glykosaminoglykan som främjar en mikromiljö som gynnar cellmotilitet och proliferation, i foster sårmiljö vara ansvarig för ärrlösa fenotypen sett under tidig fosterutveckling. Andra bevislinjer pekar på det faktum att fetaostl sårmiljö är relativt hypoxemisk och nedsänkt i steril fostervatten rik på tillväxtfaktorer 7. Dock har inget definitivt svar lämnats för en kritisk händelse eller faktor under embryogenes som utlöser övergången från scarless förnyelse till fibrotisk reparation.
Förstå mekanismerna ansvariga för scarless läkning hos fostret kräver en exakt och reproducerbar modell. Här har vi detalj en reproducerbar modell för foster scarless sårläkning i ryggen E16.5 (scarless) och embryon E18.5 (ärrbildning) mus. Dessutom kan mindre variationer av denna modell användas för att utföra ett antal ytterligare studier, såsom genuttrycksanalys av fetala sår och hud 8,9. Med tanke på att just tidsinställda graviditeter är avgörande för en framgångsrik rekapitulation av denna foster scarless sårläkning modell, vi också detalj våra protokoll för superovulation tids graviditeter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla förfaranden som beskrivs i detta dokument utförs enligt riktlinjer som fastställts av Stanford Administrativ panel för försöksdjurs Care (APLAC).
1. Timed Graviditeter - Superovulation Technique (Figur 1)
OBS: Just timing graviditetslängd av musembryon för fosterkirurgi vid E16.5 och E18.5 är av avgörande betydelse. I detta avsnitt detalj vi våra protokoll för timing mus graviditeter med hjälp gravida ston serum (PMS) och humant koriongonadotropin (HCG) injektioner för att inducera superovulation.
- Spruta honmöss (<5 per bur) intraperitonealt (IP) med 3,0-5,0 internationella enheter (IE) av PMS i en volym av 100 l PBS 1:00 till 3:00 för dag 1.
- Mellan 00:00 och 14:00 på dagen 3 (fyrtiofem till 47 timmar efter PMS injektion), injicera honmöss IP med 3,0-5,0 IE HCG i en volym av 100 l PBS.
OBS: HCG injektion inducerar ägglossning approximativt 12 h efter injektion. - Omedelbart efter HCG injektioner, parar honor med män i åldern 8-16 veckor.
OBS: Vi lägger vanligtvis två honor i en bur av enskilda hanar. - Separata honor från hanar på morgonen den dagen 4 (6:00 till 10:00) och rekord som fostrets ålder E0.5.
OBS: Vaginal pluggar kan kontrolleras vid denna tid; dock inte observationen av en vaginal plugg inte garantera graviditet och honor kan bli gravid när ingen plug observeras. Med tanke på att graviditeten är normalt observeras genom visuell inspektion och / eller palpation vid graviditets åldrar E16.5 och E18.5, kontroll för vaginala pluggar på morgonen dag 4 inte är absolut nödvändigt. Enligt vår erfarenhet, och beroende på stam, ca 30-50% av super-ägglossning honor blir gravid användning av tekniken beskriven här.
pg "/>
Figur 1. Schematisk för Superovulation Technique. Schematisk visar förfarande för superovulation tids graviditeter hos möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Murina Foster Surgery (Dorsal sårskada) på E16.5 och E18.5 embryon (Figur 2)
- Före proceduren, rengöra alla ytor av operationssalen och utrustning med 70% isopropylalkohol. Dessutom sterilisera alla kirurgiska förnödenheter och instrument som kommer att användas i förfarandet genom autoklavering dem. Vissa institutioner kan tillåta efterföljande användning av varm pärla sterilisering. Per drift, använd sterila förpackningar som innehåller gasbinda och kirurgiska instrument.
- Inducera anestesi hos gravida mödrar (fostrets ålder E16.5 eller E18.5) under 2,5% isofluran / syreblandning på 2 L per minut följt av underhållsanestesi vid 1 L per minut.
- Att confast ordentlig anesthetization, se de djupa pedalreflexer på musen undertrycks och placera musen i liggande ställning.
- Applicera en vet oftalmisk salva som Puralube att förhindra ögonirritation eller torrhet under förfarandet.
- Förbered buken genom att administrera en lätt tillämpning av hårborttagningskräm i högst 30 sekunder (Figur 2A).
- Förbered buken för aseptisk kirurgi med povidon-jod och alkohol (figur 2B och 2C).
- Utför mittlinjen laparotomi under mikroskop med hjälp mikro sax (Figur 2D och 2E).
- Försiktigt exponera livmodern och fostret ut för operation (Figur 2F).
- Skölj kirurgiska området med varmt (38 ° C) fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med användning av en trubbig spets nål
OBS: Man kan göras genom att försiktigt böja av spetsen på en stor-nål. (Figur 2G och 2H). - Placera fostret på ett sätt som tillåters full tillgång till dorsum.
- Passera en handväska sträng stygn använder 7-0 nylonsutur genom livmodern ligger över platsen för avsedd dorsal sårskada (Figur 2I). Position handväska sträng över en region av dorsum till vänster eller höger om ryggmärgen, och i en region i livmoderväggen saknar stora blodkärl.
- Gör en 3 mm snitt genom livmoderväggen och fostersäcken i mitten av väskan strängen (figur 2J).
- Skölj incisionsstället med varmt (38 ° C) PBS.
- Använda mikrokirurgisk sax, skär en enda full tjocklek excisional sår, ca 1 mm i längd, i dorsum av fostret.
- Försiktigt blot incisionsstället torka med bomull-tip applikator.
- Spruta in 3 il volym tusch subkutant i sårområdet för att markera platsen för såret (Figur 2K).
- Skölj med varmt (38 ° C) PBS för att säkerställa bläckets har bibehållits inom sårstället.
- Ha kirurgisk assistent Inject varmt (38 ° C) PBS genom trubbig spets 10 G sprutan i fostersäcken som väskan strängen är stängd (figur 2L). Dra tillbaka sprutan som handväska sträng stängning närmar färdigställande (Figur 2 M).
- Återvända försiktigt livmoder i bukhålan (figur 2N).
- Evert hud och bukhinnan.
- Har kirurgisk assistent vattna bukhålan med varmt (38 ° C) PBS.
- Stäng buken snabbt genom häftning hud och bukhinna stängd (figur 2O). Standardlutningen utförs i två skikt; bukhinnan och abdominal muskulatur i ett skikt, subkutan vävnad och hud i det andra skiktet. För omedelbar offer och skörd av fostret, visar vår demonstrations stängning i ett lager.
- Placera djuret under observation i en varm inkubator inställd på 37 ° C i 30 minuter eller tills djuret återfår tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA.
- Inte returna djuret till företaget av andra djur tills den har återhämtat sig helt från förfarandet.
- Efter uppvaknandet från anestesi och under den efterföljande 48 timmar, administrera subkutan injektion av buprenorfin (0,05 mg / kg) var 12 timmar för smärtlindring som behövs utifrån smärtbedömning. Administrera karprofen (5 mg / kg) via subkutan injektion för ytterligare postoperativ smärtlindring efter behov.
- Återgå djur till buren och förse dem med mat och vatten ad libitum.
- Övervaka noga för manifestationer av smärta.
- 48 timmar efter operationen, offra gravid mamma med en överdos av isofluran och skörd sårade fostret. För att göra detta, justera isofluran koncentration till 5% eller högre och bibehålla exponering under 1 minut efter avslutad andning. Bekräfta dödshjälp med halsdislokation. Skörda en oskadade embryo för åldersmatchade kontroll. Sena embryon bör ha en separat metod för dödshjälp förenlig med IACUC rekommendationer, såsom dekapitationsbasis, cervikal dislokation, eller kemisk injektion.
Figur 2. Schematisk för Murine Fetal kirurgi. Allmänna steg för rygg- skadades i E16.5 och E18.5 musembryon. (A) Hårborttagning av mus buken. (B och C) Beredning av mus buken. (D) Mikroskop används för kirurgisk förfarande. (E) Midline laparotomi. (F) Exponering av livmodern. (G) Skapande av trubbig spets nål. (H) Bevattning av livmodern med varm saltlösning. (I) Skapande av handväska sträng sutur. (J) Incision genom livmoder vägg- och 1 mm full tjocklek excisional sår generation. (K) Subkutan injektion av tusch. (L och M) Stängning av handväska sträng sutur. (N och O)Stängning av buken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För histologisk analys bör kutana sår i rygghuden för E16.5 och E18.5 musembryon skördas 48 timmar efter sårskada, fixerades i 4% PFA och paraffininbäddade. I fluorescerande transgena modeller, kan frysförvaring med oktober vara lämplig. Det finns flera fläckar som kan användas för att visualisera cellulära och bindväv arkitektur. Hematoxylin och eosin är en tvåfärgad fläck som färgar kärnor blå och eosinofila strukturer (dvs.., Cytoplasma och extracellulärt kollagen) olika nyanser av rött, rosa och orange. Mallory trikrom är en tre-färg fläck som består av anilin blå, syrafuchsin och orange G, bäst lämpade för att särskilja celler från omgivande bindväv.
Figur 3. Histologi av scarless E16.5 Foster sår. (A) Hematoxylin och eosin stain reveals komplett reepithelialization och en mild ökning i antalet inflammatoriska celler närvarande (pilar). (100x, bar = 100 nm) (B) Eosin fläck visar tusch (pilspetsar) runt regenere hårsäckar (pil) (400x, bar = 25 . ^ m) (C) Mallory trikrom fläck avslöjar en fin retikulär dermalt kollagen mönster med närvaron av en hårsäck (400x; bar = 25 | im). Återges med tillstånd från Colwell et al. 10 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Om rygg- excisionssår är av lämplig storlek (1 mm) och djup (full tjocklek), kommer hematoxylin och eosin färgning avslöjar att E16.5 huden läker med minimal ärrbildning, komplett reepithelialization, och endast en liten ökning av antalet inflammatoriska celler (figur 3A). Dessutom är dessa wounds bör läka med ungefär normal hud arkitektur och innehåller regenere hårsäckar inom platsen för skadan (pilar; Figur 3B). Korrekt tillämpning av india bläck till nyligen skapade såret bör resultera i bläckavsättning på platsen för skadan (pilspetsar, figur 3B). Slutligen bör trikromfläckning avslöja en fin retikulära dermalt kollagen mönster karakteristiskt för oläkta dermis (Figur 3C).
Figur 4. Histologi av ärrbildning E18.5 Foster sår. (A) Hematoxylin och eosin stain avslöjar en ökning av eosinfärgning i dermis vid stället för skadan (pilar). (200x; bar = 50 ^ m) (B) Mallory trikrom fläck visar tät dermalt kollagen (pilar) (400x; bar = 25 | im). Återges med tillstånd från Colwell et al.10
I jämförelse med sår som gjorts vid E16.5, hematoxylin och eosin färgning av dorsala sår gjordes vid E18.5 och skördade 48 timmar efter sårskada bör avslöja en tät ärr med förlust av normal hud arkitektur vid skadestället (Figur 4A). Likaså avslöjar trikromfläckning en tät mönster av oorganiserad kollagen nedfall (pilar; Figur 4B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiska protokollet presenteras här beskriver en excisional modell av foster murina scarless healing först publicerades 2006 av vårt laboratorium 10. Förutom de övriga etablerade modeller av excisional såra 11, incisional modeller av foster murina scarless healing existerar samt 12,13. Undersökningar av foster scarless sårläkning i apa, lamm, kanin, opossum och råtta har rapporterats 14-17. Men möss utgör en idealisk modell för att utforska foster scarless sårläkning på grund av deras jämförelsevis låga per-diem bur kostnad och väldefinierad genomet. Dessutom kan uppnås i tid och rum genetiska förlust / vinst på funktion under fosterutvecklingen med hjälp murina transgena system som erbjuder möjligheter att exakt dechiffrera mekanismerna för scarless reparation.
Trots dessa fördelar, möss presentera vissa tekniska utmaningar under fosterkirurgi på grund av sin ringa storlek. Med tanke på denstressen av anestesi på en gravid mamma, bör stor försiktighet vidtas för att övervaka nivån av isofluran / syrgas administreras. En blandning av 2,5% isofluran / syre vid 2 L per minut följt av underhållsanestesi vid 1 L per minut bör noggrant följas. Avvikelser och fluktuationer i detta kritiska faktorn kan avsevärt påverka sjuklighet. Korrekt placering av väskan strängen suturen representerar den mest tekniskt utmanande aspekten av operationen. Underlåtenhet att placera denna sömmen korrekt kommer att resultera i läckage av fostervatten och PBS efter stängning. En otillräcklig vätskevolymen i livmodern kommer att resultera i trauma på embryon och kan inducera prematur livmodersammandragning. Av detta skäl, är ersättning av fostervatten förloras vid öppnande av livmodern också ett kritiskt steg i detta kirurgiska modell. Man måste vara försiktig för att kontinuerligt mata varm PBS som väskan strängen är stängd. Dessa faktorer krävs betydande felsökning och vi betona att uppmärksamma dessa detaljerkommer att öka sannolikheten för en lyckad operation. Men även de med erfarna kirurgiska händer bör planera för en sjuklighet takt på cirka 40% i E16.5 foster.
Förstå foster scarless sårläkning har värde för translationell medicin syftar till in vivo modulering av fibrinogena beteende under vuxna stadier av utveckling. I jämförelse med vuxna hud, har fostrets hud en utvecklings dermis, minskad draghållfasthet, begynnande hårsäckar, och olika ECM komponenter 2,4. Fetal hud har en förhöjd förhållandet av kollagen typ III till typ I i jämförelse med vuxen hud, färre och mindre mogna mastceller, uttryck av Keratiner 8 och 19, och högre nivåer av hyaluronsyra i jämförelse med vuxen hud 4,9. Genom att dechiffrera mekanismerna bakom scarless läkning hos fostret, kan vi börja att styra de molekylära och cellulära vägar som ansvarar för fibros i vuxen mot en regenerativ fenotyp. Uppkomsten of härstamning spårning och andra genetiska verktyg i musen har öppnat lovande nya vägar för undersökning av fostrets scarless sårläkning. Med tanke på de inneboende höga sjuklighet och för tidig livmodersammandragning i samband med fosterkirurgi, undersökningar av foster scarless hud sårläkning in vivo kräver en noggrann och repeterbar kirurgisk modell. Här har vi detalj en reproducerbar modell för foster scarless sårläkning i ryggen E16.5 (scarless) och embryon E18.5 (ärrbildning) mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett bidrag från NIH bidrag R01 GM087609 (till HPL), en gåva från Ingrid Lai och Bill Shu hedra Anthony Shu (till HPL), NIH bidrag U01 HL099776 (till MTL), den Hagey Laboratoriet för Pediatric regenerativ medicin och The Oak Foundation (till MTL och HPL). GGW stöddes av Stanford School of Medicine, Stanford Medical Scientist Training Program, och NIGMS träningsbidrag GM07365. MSH stöddes av CIRM Clinical Fellow Training Grant TG2-01159. BXH stöddes genom finansiering från Sarnoff Cardiovascular Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-O MONOSOF Suture | eSuture | SN-1647G | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Autoclip 9 mm | Texas Scientific Instruments | 205060 | |
| Insulin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-272-382 | |
| Black Pigment | AIMS | 242 | |
| BD Safety-Lok 3 ml Syringe | BD Biosciences | 309596 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| OPMI-MD Surgical Microscope | Carl Zeiss Surgical Inc | ||
| Pregnant Mares Serum (PMS) | Millipore | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 |
References
- Larson, B. J., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Scarless fetal wound healing: a basic science review. Plastic and reconstructive surgery. 126, 1172-1180 (2010).
- Wilgus, T. A. Regenerative healing in fetal skin: a review of the literature. Ostomy/wound management. 53, 16-31 (2007).
- Wulff, B. C., et al. Mast cells contribute to scar formation during fetal wound healing. The Journal of investigative dermatology. 132, 458-465 (2012).
- Lorenz, H. P., Adzick, N. S. Scarless skin wound repair in the fetus. The Western journal of medicine. 159, 350-355 (1993).
- Longaker, M. T., et al. Wound healing in the fetus. Possible role for inflammatory macrophages and transforming growth factor-beta isoforms. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 2, 104-112 (1994).
- Longaker, M. T., et al. Studies in fetal wound healing. IV. Hyaluronic acid-stimulating activity distinguishes fetal wound fluid from adult wound fluid. Annals of surgery. 210, 667-672 (1989).
- Colombo, J. A., Napp, M., Depaoli, J. R., Puissant, V. Trophic influences of human and rat amniotic fluid on neural tube-derived rat fetal cells. International journal of developmental neuroscience : the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 11, 347-355 (1993).
- Colwell, A. S., Longaker, M. T., Peter Lorenz, H. Identification of differentially regulated genes in fetal wounds during regenerative repair. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16, 450-459 (2008).
- Hu, M. S., et al. Gene expression in fetal murine keratinocytes and fibroblasts. The Journal of surgical research. , (2014).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. An in vivo mouse excisional wound model of scarless healing. Plastic and reconstructive surgery. 117, 2292-2296 (2006).
- Wilgus, T. A., et al. The impact of cyclooxygenase-2 mediated inflammation on scarless fetal wound healing. The American journal of pathology. 165, 753-761 (2004).
- Iocono, J. A., Ehrlich, H. P., Keefer, K. A., Krummel, T. M. Hyaluronan induces scarless repair in mouse limb organ culture. Journal of pediatric surgery. 33, 564-567 (1998).
- Chopra, V., Blewett, C. J., Krummel, T. M. Transition from fetal to adult repair occurring in mouse forelimbs maintained in organ culture. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 5, 47-51 (1997).
- Adzick, N. S., Longaker, M. T. Animal models for the study of fetal tissue repair. The Journal of surgical research. 5, 47-51 (1991).
- Block, M. Wound healing in the new-born opossum (Didelphis virginianam). Nature. 187, 340-341 (1960).
- Longaker, M. T., Dodson, T. B., Kaban, L. B. A rabbit model for fetal cleft lip repair. Journal of oral and maxillofacial surgery : official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 48, 714-719 (1990).
- Longaker, M. T., et al. A model for fetal cleft lip repair in lambs. Plastic and reconstructive surgery. 90, 750-756 (1992).
