Introduction
Fetal cilt yaraları gebelik 1 sonlarına kadar hızlı ve scarlessly iyileşir. Fetal skarsız yara onarımı, normal doku yapısının ve fonksiyonunun rejenerasyonu ile karakterize edilir. yara izi fenotip bir Scarless geçiş insanlarda ve farelerde 2,3 embriyonik günde 18 (E18) etrafında gebeliğin üçüncü trimesterde ortaya çıkar. Yetişkin karşılaştırıldığında fetal yara onarım hızlı epitelizasyonu, bağ dokusu birikimi, ve fibroblast göç ile karakterize edilir.
Birçok çalışma erken fetal gelişim sırasında skarsız yara iyileşmesinin olay için olası açıklamalar teklif var. Enflamasyon yetişkin yara tamir temel bileşenidir; Ancak fetal yaralar akut inflamasyon 4 olmaması ile karakterize edilir. Bu İster fetal aşamalarında bağışıklık sisteminin fonksiyonel olgunlaşmamış bir sonucudur belirsiz kalır olduğunu. Yeni yapılan bir çalışmada önerdi bolluk, mat farklılıklarurity ve E18, fetal deri genel E15 mast hücre fonksiyonu, en azından bir fare 3'te skarsız fenotip geçiş sorumlu olabilir. Diğer çalışmalar özellikleri ve fetal ve erişkin yara makrofajlar bolluğu farklılıklar fetal yara onarımı 5 esnasında normal dışı matriks (ECM) reform sorumlu olduklarını varsaymak.
Fetal ve erişkin gelişimi sırasında çevresel faktörlerin farklılıklar da yara onarım etkileyebilir. Longaker ve arkadaşları fetus, yara sıvısı 6 yara sıvısında yetişkin hiçbirine kıyasla hiyalüronik asit uyarıcı aktivitesi yüksek seviyelerde sahip olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak fetal yara ortamında hiyalüronik asit, hücre motilitesi ve çoğalması için elverişli bir mikro-teşvik eden bir glikozaminoglikan, seviyelerinin erken cenin gelişimi sırasında görülen skarsız fenotipinden sorumlu olabilir. Feta gerçeği kanıtlar noktasının diğer hatlarıl yara ortamı nispeten hipoksemikti ve büyüme faktörleri 7 zengin steril amniyotik sıvı batmış olduğunu. Ancak, kesin bir cevap fibrotik onarım skarsız rejenerasyon geçişi tetikler embriyogenez sırasında kritik bir olay ya da faktörü sağlanmıştır.
Fetusta skarsız şifa için mekanizmalar sorumlu anlama kesin ve tekrarlanabilir bir model gerektirir. Burada detay E16.5 (skarsız) ve E18.5 (skar) fare embriyoları sırtında fetal skarsız yara iyileşmesi bir tekrarlanabilir bir model. Buna ek olarak, bu modelin küçük varyasyonlar Fetal yaraların ve deri 8,9 gen ekspresyon analizi gibi ileri çalışmalar, bir dizi gerçekleştirmek için kullanılabilir. Tam zamanlı gebelikler bu fetal skarsız yara iyileşmesi modeli başarılı recapitulation için kritik olduğunu göz önüne alındığında, biz süperovulasyon zamanlanmış gebeliklerde de detay bizim protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu yazıda anlatılan tüm işlemler Laboratuar Hayvan Bakımı Stanford İdari Paneli (APLAC) tarafından oluşturulan kurallara göre yapılır.
1. Zamanlı Gebelikler - Süperovulasyon Tekniği (Şekil 1)
NOT: Kesinlikle E16.5 E18.5 ve fetal cerrahi fare embriyoları gebelik yaşı zamanlama kritik önem taşımaktadır. Superovulasyon neden hamile kısrakların serum (PMS) ve insan koryonik gonadotropin (HCG) enjeksiyonları kullanarak fare gebeliklerin zamanlama bizim protokol bu bölümde detaylı olarak.
- 1:00 ve 1 gün için 3:00 arasında, 100 ul PBS hacminde PMS'nin 3,0-5,0 uluslararası ünitedir (IU) ile dişi farelere (kafes başına <5) intraperitonal olarak (İP) enjekte edilir.
- 12:00 ve 3. gün (kırk beş PMS enjeksiyonundan sonra saat 47), 2:00 arasında, 100 ul PBS hacminde HCG 3,0-5,0 IU dişi fareler IP enjekte edilir.
NOT: HCG enjeksiyonu endükleyicisi yumurtlama yaklaşık 12 saat sonrası enjeksiyon. - Hemen HCG enjeksiyonları sonrasında 8-16 hafta yaş arası erkeklerde ile kadın dostum.
NOT: Biz genellikle bireysel erkeklerin bir kafese iki kadın yerleştirin. - Fetal yaş E0.5 olarak - (10:00 6:00) ve kayıt günün 4 sabahı erkeklerden ayrı kadın.
NOT: Vajinal fişler şu anda kontrol edilebilir; Ancak, bir vajinal fiş gözlem gebelik garanti etmez ve hiçbir fiş gözlenen zaman kadın hamile olabilir. Gebelik gün 4 sabahı vajinal fişleri kontrol, gebelik yaşları E16.5 E18.5 ve görsel muayene ve / veya palpasyonla genellikle gözlemlenebilir olduğu göz önüne alındığında kesinlikle gerekli değildir. Bizim deneyimimizde, ve zorlanma bağlı olarak, süper ovulasyon kadınların yaklaşık% 30-50 burada açıklanan tekniği kullanılarak gebe.
pg "/>
Şekil Süperovulasyon Tekniği 1. şematik. Farelerde superovulation zamanlı gebeliklerde şematik gösteren prosedürü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
2. Murin Fetal Cerrahi E16.5 E18.5 ve Embryolarının üzerinde (Dorsal Yaralama) (Şekil 2)
- İşlem öncesi,% 70 izopropil alkol ile ameliyathane ve ekipman tüm yüzeylerini temizleyin. Buna ek olarak, onları otoklav ile prosedüründe kullanılacak tüm cerrahi malzemeleri ve aletleri sterilize. Bazı kurumlar sıcak boncuk sterilizasyon sonraki kullanımına izin verebilir. Operasyon Başına, gazlı bez ve cerrahi aletler, steril paketleri kullanın.
- Dakikada başına 1 L bakım anestezi ardından dk başına 2 L% 2.5 izofluran / oksijen karışımı altında gebe annelerin anestezi (fetal yaş E16.5 E18.5 veya) neden olur.
- ConFirma uygun Anesthetization, fare derin pedal refleksleri bastırılmış sağlamak ve yüzüstü pozisyonda fare koyun.
- Puralube prosedürü sırasında göz tahrişine veya kuruluğunu önlemek için böyle bir veteriner oftalmik merhem sürün.
- Artık 30 sn (Şekil 2A) için tüy dökücü krem ışık uygulaması tatbik edilmesiyle karın hazırlayın.
- Povidon-iyot ve alkol (Şekil 2B ve 2C) ile aseptik cerrahi karın hazırlayın.
- Mikrocerrahi makas (Şekil 2B ve 2E) kullanarak mikroskop altında orta hat laparotomi gerçekleştirin.
- Yavaşça cerrahi (Şekil 2F) için seçilen rahim ve fetus maruz.
- Bir kör uçlu iğne kullanılarak sıcak (38 ° C), fosfat tamponlu tuz (PBS) ile cerrahi alanı yıkayınız
NOT: Bir dikkatli bir şekilde büyük çaplı iğne ucu bükülmesiyle yapılabilir. (Şekil 2G ve 2H). - Izin şekilde fetus yerleştirinsırtında tam erişim s.
- Amaçlanan dorsal yaralama (Şekil 2I) site örten rahim içinden 7-0 naylon sütür kullanarak bir çanta dize dikiş geçirin. Pozisyon kese sol veya omurilik sağındaki sırtı bir bölge üzerinde dizisi ve büyük kan damarlarının yoksun uterus duvarına bir bölgede.
- Çanta dize (Şekil 2J) merkezinde rahim duvarı ve amniyon kesesi yoluyla 3 mm kesi yapmak.
- Sıcak (38 ° C) PBS ile kesi sitesini yıkayınız.
- Mikrocerrahi makas kullanarak, fetusun sırtında, tek bir tam kalınlıkta eksizyonel yara, uzunluğu yaklaşık 1 mm kesti.
- Yavaşça leke kesi sitesi pamuk uçlu aplikatör ile kurulayın.
- Yaranın konumunu (Şekil 2K) işaretlemek için yara içine 3 ul hacmi Hindistan mürekkep subkutan enjekte edilir.
- Mürekkep yara site içinde muhafaza edilmiştir sağlamak için ılık (38 ° C) PBS ile sulayın.
- Cerrahi asistanı i varnject çanta dizesi olarak amniyon kesesi içine künt uçlu 10 G şırınga aracılığıyla sıcak (38 ° C) PBS (Şekil 2L) kapalıdır. Çanta dize kapatma tamamlama (Şekil 2M) yaklaştığında olarak şırınga geri çekin.
- Yavaşça karın boşluğuna (Şekil 2N) içine rahim döndürür.
- Evert cilt ve periton.
- Sıcak (38 ° C) PBS ile karın boşluğuna cerrahi asistanı sulamak var.
- Cilt ve periton zımbalama hızla kapatmak karın (Şekil 2O) kapalı. standart kapama iki kat yapılmaktadır; periton ve ikinci tabaka içinde bir tabakanın, subkutan doku ve deride karın kası. Acil fedakarlık ve fetusun hasat için, bizim gösteri, bir katmanda kapatılmasını gösterir.
- 30 dakika süre ile ya da hayvan sternum yatma muhafaza edilmesi için yeterli bilinci yerine kadar 37 ° C'ye ayarlanmış sıcak bir kuluçka makinesi içinde gözlem altında hayvan yerleştirin.
- Ret etmeyintamamen prosedür kurtarıldı kadar diğer hayvanların şirkete hayvan urn.
- Anestezi ve sonraki 48 saat boyunca uyanırken, buprenorfin subkutan enjeksiyonu (0.05 mg / kg) ağrı değerlendirmesine göre gerektiğinde analjezi için her 12 saat yönetmek. Gerektiğinde ek bir post-operatif ağrı tedavisi için deri altı enjeksiyon yoluyla Karprofen (5 mg / kg) uygulayınız.
- Kafes hayvanları dönün ve gıda ve su ad libitum ile bunları sağlamak.
- Ağrı belirtileri yakından izleyin.
- 48 saat ameliyat sonrası, izofluran ve hasat yaralı fetusun aşırı dozda hamile anne kurban. Bunu yapmak için,% 5 ya da daha yüksek bir izofluran konsantrasyonunu ayarlamak ve nefes kesildikten sonra 1 dakika için maruz kalma korumak. Servikal dislokasyon ile ötenazi onaylayın. Yaş uyumlu kontrol için bir yarasız embriyo Hasat. Geç embriyolar gibi IACUC tavsiyeleri, tutarlı ötenazi ayrı bir yöntem olmalıdır decizye, servikal dislokasyon veya kimyasal enjeksiyon.
Şekil 2. şematik Kemirgen Fetal Cerrahi. E16.5 E18.5 ve fare embriyoları yaralama dorsal Genel adımlar. (A) fare karın Depilasyon. (B ve C) fare karın hazırlanması. (D) Mikroskop cerrahi için kullanılan rahim içinden çanta dize dikiş prosedürü. (E) orta hat laparotomi. (F) uterusun Pozlama. künt uçlu iğne (G) oluşturulması. ılık tuzlu su ile rahim (H) Sulama. (I) oluşturulması. (J) Kesi Duvar ve 1 mm kalınlıkta tam eksizyonel yara nesil. (K) Hindistan mürekkep cilt altı enjeksiyonu. (L ve M) kese dize dikiş kapatılması. (N ve O)Karın Kapatma. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histolojik analiz için, E16.5 ve E18.5 fare embriyolarından sırt derisinde deri yaraları 48 saat% 4 PFA içinde sabit sonrası yaralanma, ve parafin gömülmüş hasat edilmesi. Floresan transgenik modellerde, Ekim ile dondurulması uygun olabilir. Hücresel ve bağ dokusu mimarisi görselleştirmek için kullanılan olabilir birkaç lekeler vardır. Hematoksilen ve eozin mavi çekirdekleri ve eozinofilik yapıları (yani., Sitoplazma ve hücre dışı kollajen) kırmızı, pembe, turuncu ve çeşitli tonlarında lekeleyen bir iki renkli leke. Mallory trikrom anilin mavisi, asit fuşin ve turuncu G, bağ dokusu hücreleri çevreleyen ayırt etmek için en uygun oluşan üç renkli leke.
Şekil 3. Scarless E16.5 Fetal Yaralar Histoloji. (A) Hematoksilen ve eozin leke yenidenveals tam reepithelialization ve inflamatuar hücrelerin sayısında hafif bir artış mevcut (oklar). çubuk = 25; (100x; çubuk = 100 mikron) (B) Eosin leke yenileyici saç köklerinin (ok) (400x civarında Hindistan mürekkep (ok başları) gösterir . bar = 25 mikron); um) (C) Mallory trikrom leke saç folikülü (400x varlığı ile ince retiküler dermal kollajen desen ortaya koymaktadır. Colwell ark. 10 izniyle bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Sırt kesik yarası uygun büyüklükte (1 mm) ve derinliği (tam kalınlık) ise, hematoksilin ve eozin boyama, enflamatuar sayısının en az yaralanma, tam reepithelialization ve sadece küçük bir artış ile bu E16.5 cilt iyileştirici ortaya koyacaktır hücreleri (Şekil 3A). Ayrıca, bu wounds yaklaşık normal deri mimarisi ile iyileşir ve yaralanma site içinde saç köklerinin yenileyici içermelidir (oklar, Şekil 3B). Taze oluşturulan yaraya Hindistan mürekkep Uygun uygulama yaralanma yerinde (Şekil 3B ok başları) mürekkep birikimi yol açmalıdır. Son olarak, Trikrom Nedbesiz dermis (Şekil 3C) ince bir retiküler dermal kollajen desen özelliği açığa çıkarmalıdır.
Şekil 4. Skar E18.5 Fetal Yaralar Histoloji. (A) Hematoksilen ve eozin leke yaralanma yerinde dermis eozin boyama artış (oklar) ortaya koymaktadır. (200x; çubuk = 50 mikron) (B) Mallory trikrom leke yoğun dermal kolajen (oklar) (400x gösterir; çubuğu = 25 um). Colwell ark izni ile yayımlanmaktadır.10
E16.5, hematoksilen ve sırt yaraları E18.5 yapılan ve yaralanma (Şekil 4A) yerinde, normal deri mimarisi kaybı ile yoğun bir yara açığa çıkarmalıdır 48 saat sonrası yaralama hasat eozin boyama yapılan yaralarda karşılaştırıldığında. (Oklar; Şekil 4B) Benzer şekilde, Trikrom dağınık kollajen birikimi yoğun bir desen ortaya koymaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan cerrahi protokol öncelikle laboratuvar 10 tarafından 2006 yılında yayınlanan fetal kemirgen skarsız şifa bir eksizyonel modelini açıklar. Eksizyonel yaralama 11 diğer kurulan modellere ek olarak, fetal kemirgen skarsız şifa insizyonel modelleri de 12,13 var. Maymun, koyun, tavşan, Chalk ve sıçan fetal skarsız yara iyileşmesinin araştırmalar 14-17 olarak bildirilmiştir. Ancak, fareler nedeniyle nispeten düşük başına diem kafes maliyeti ve iyi karakterize genom fetal skarsız yara iyileşmesini keşfetmek için ideal bir model temsil eder. Ayrıca, fonksiyonun zamansal ve mekansal genetik kayıp / kazanç tam skarsız onarım mekanizmalarını deşifre kemirgen transgenik sistemler sunan imkanlarını kullanarak embriyonik gelişimi sırasında elde edilebilir.
Bu avantajlara rağmen, fareler nedeniyle küçük boyutu fetal cerrahi sırasında bazı teknik zorluklar. VerilmişHamile bir anne üzerinde anestezi stresi, büyük bakım izofluran / oksijen seviyesini yönetilen izlemek için alınmalıdır. Dakika başına 1 L korunması için genel anestetikler, ardından dakika başına 2 L% 2.5 izofluran / oksijen karışımı dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır. Bu kritik faktör sapmalar veya dalgalanmalar önemli ölçüde morbidite etkileyebilir. Çanta dize dikiş Uygun yerleştirme ameliyatı teknik olarak en zor yanını temsil eder. Bu doğru dikiş yerleştirmek için başarısızlık amniyotik sıvı ve PBS sonrası kapanış sızıntı neden olacaktır. Rahim içinde sıvı bir yetersiz hacim embriyolar travma neden olur ve erken rahim kasılması neden olabilir. Bu nedenle, rahim açılması üzerine kayıp amniyotik sıvının değiştirilmesi de bu cerrahi modelde kritik bir adımdır. Bakım çanta dize kapalı olarak sürekli sıcak PBS çıkarmak için alınmalıdır. Bu faktörler önemli sorun giderme gerekli ve biz bu ayrıntıları da dikkat vurgulamakBaşarılı bir ameliyat olasılığını artıracaktır. Ancak, hatta deneyimli cerrahi elleri olanlar E16.5 fetuslarda yaklaşık% 40 morbidite oranı planlamalısınız.
Fetal skarsız yara iyileşmesini anlama gelişme yetişkin evrelerinde fibrojenik davranış in vivo modülasyonu amaçlayan öteleme tıp değerini tutar. Yetişkin deriye kıyasla, fetus deri geliştirme deri, düşük gerilme mukavemeti, oluşmakta olan saç folikülleri ve farklı ECM bileşenleri 2,4 sahiptir. Fetal cilt yetişkin deri 4,9 karşılaştırıldığında, yetişkin deri, daha az sayıda ve daha az gelişmiş mast hücreleri, keratin 8 ve 19, ve hiyalüronik asit yüksek seviyelerde ifadesi ile karşılaştırıldığında, tip I kolajen tip III yüksek bir orana sahiptir. Fetusta skarsız şifa yatan mekanizmaları deşifre ederek, bir rejeneratif fenotip doğru yetişkin fibrozis sorumlu moleküler ve hücresel yollar yönlendirmek için başlayabilirsiniz. çıkması ofare f izleme soy ve diğer genetik araçlar fetal skarsız yara iyileşmesi soruşturma umut verici yeni yollar açtık. Morbidite ve fetal cerrahi ile ilişkili erken rahim kasılması doğal olarak yüksek oranları göz önüne alındığında, fetal skarsız cilt araştırmalar in vivo şifa hassas ve tekrarlanabilir cerrahi modeli gerektirir yara. Burada detay E16.5 (skarsız) ve E18.5 (skar) fare embriyoları sırtında fetal skarsız yara iyileşmesi bir tekrarlanabilir bir model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu eser (HPL için) NIH hibe R01 GM087609, (MTL) (HPL için) Anthony Shu, NIH hibe U01 HL099776 onuruna Ingrid Lai ve Bill Shu bir Hediyesi, Hagey Laboratuvarı için bir hibe ile kısmen desteklenmiştir Pediatrik Rejeneratif Tıp ve (MTL ve HPL için) Meşe Vakfı. GGW Tıp Stanford School, Stanford Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı tarafından desteklenen ve NIGMS eğitim hibe GM07365 oldu. MSH CIRM Klinik Fellow Eğitim Hibe TG2-01159 tarafından desteklenmiştir. Gxy Sarnoff Kardiyovasküler Vakfı fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-O MONOSOF Suture | eSuture | SN-1647G | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Autoclip 9 mm | Texas Scientific Instruments | 205060 | |
| Insulin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-272-382 | |
| Black Pigment | AIMS | 242 | |
| BD Safety-Lok 3 ml Syringe | BD Biosciences | 309596 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| OPMI-MD Surgical Microscope | Carl Zeiss Surgical Inc | ||
| Pregnant Mares Serum (PMS) | Millipore | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 |
References
- Larson, B. J., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Scarless fetal wound healing: a basic science review. Plastic and reconstructive surgery. 126, 1172-1180 (2010).
- Wilgus, T. A. Regenerative healing in fetal skin: a review of the literature. Ostomy/wound management. 53, 16-31 (2007).
- Wulff, B. C., et al. Mast cells contribute to scar formation during fetal wound healing. The Journal of investigative dermatology. 132, 458-465 (2012).
- Lorenz, H. P., Adzick, N. S. Scarless skin wound repair in the fetus. The Western journal of medicine. 159, 350-355 (1993).
- Longaker, M. T., et al. Wound healing in the fetus. Possible role for inflammatory macrophages and transforming growth factor-beta isoforms. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 2, 104-112 (1994).
- Longaker, M. T., et al. Studies in fetal wound healing. IV. Hyaluronic acid-stimulating activity distinguishes fetal wound fluid from adult wound fluid. Annals of surgery. 210, 667-672 (1989).
- Colombo, J. A., Napp, M., Depaoli, J. R., Puissant, V. Trophic influences of human and rat amniotic fluid on neural tube-derived rat fetal cells. International journal of developmental neuroscience : the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 11, 347-355 (1993).
- Colwell, A. S., Longaker, M. T., Peter Lorenz, H. Identification of differentially regulated genes in fetal wounds during regenerative repair. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16, 450-459 (2008).
- Hu, M. S., et al. Gene expression in fetal murine keratinocytes and fibroblasts. The Journal of surgical research. , (2014).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. An in vivo mouse excisional wound model of scarless healing. Plastic and reconstructive surgery. 117, 2292-2296 (2006).
- Wilgus, T. A., et al. The impact of cyclooxygenase-2 mediated inflammation on scarless fetal wound healing. The American journal of pathology. 165, 753-761 (2004).
- Iocono, J. A., Ehrlich, H. P., Keefer, K. A., Krummel, T. M. Hyaluronan induces scarless repair in mouse limb organ culture. Journal of pediatric surgery. 33, 564-567 (1998).
- Chopra, V., Blewett, C. J., Krummel, T. M. Transition from fetal to adult repair occurring in mouse forelimbs maintained in organ culture. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 5, 47-51 (1997).
- Adzick, N. S., Longaker, M. T. Animal models for the study of fetal tissue repair. The Journal of surgical research. 5, 47-51 (1991).
- Block, M. Wound healing in the new-born opossum (Didelphis virginianam). Nature. 187, 340-341 (1960).
- Longaker, M. T., Dodson, T. B., Kaban, L. B. A rabbit model for fetal cleft lip repair. Journal of oral and maxillofacial surgery : official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 48, 714-719 (1990).
- Longaker, M. T., et al. A model for fetal cleft lip repair in lambs. Plastic and reconstructive surgery. 90, 750-756 (1992).
