Introduction
Musen olfaktoriske epitel i næsehulen omfatter 6-10.000.000 bipolære olfaktoriske sensoriske neuroner 1. Hver olfaktoriske neuron vælger en af 1.200 odorantreceptor gener til ekspression. Påvisning af lugtstoffer starter med lugtstof binding til en olfaktorisk receptor 2, som derefter aktiverer adenylylcyclase type III (ACIII) 3 via olfaktoriske specifikke G-protein Ga olf 4. Den resulterende stigning i cAMP (cAMP) åbner en cyklisk nukleotid-gated (CNG), ikke-selektive kationkanal fører til tilstrømningen af Ca 2+ og Na +, derefter Ca 2+ tilstrømning fører til åbning af en Ca2 + aktiveret Cl - kanal 5,6. Den resulterende udad Cl - flux lettes af en høj intracellulær Cl - koncentration opretholdes ved steady Cl - optagelse, sandsynligvis via Na + / K + / Cl - cotransporter NKCC1 denCl - / HCO3 - varmeveksler SLC4A1, og måske yderligere endnu ikke identificerede transportører 6-8.
Bipolære olfaktoriske neuroner har enkelt, uforgrenede axoner, der strækker direkte til lugtekolben, og dendritceller, der strækker sig til overfladen af epitelet og slutter som en specialiseret rum, dendritiske knop. Fra denne knop, 10-30 cilier, som kan nå en længde på op til 50-60 um, hidrører i slim dækker epiteloverfladen 9. Proteiner af den kanoniske signaltransduktionskaskade hovedsagelig lokaliseret i membranen af disse cilier. Den øgede sensoriske overflade af epitelet forstærker evnen til at detektere lugtstoffer. På grund af tætheden af sensoriske neuroner, cilier der strækker sig fra de tilstødende dendritiske drejeknapper blande. Denne sammenblanding resulterer i en tilfældig blanding af cilier fra forskellige neuroner, der udtrykker forskellige former af olfaktoriske receptorer på overfladen af epitelet. Påvisningen og celleular tildeling af ciliære proteiner, som kun er til stede i en undergruppe af sensoriske neuroner er derfor vanskeligt i kryosektioner. Derudover nøjagtig lokalisering af sådanne proteiner langs cilia er næppe muligt, eftersom kryosektioner typisk tyndere end den gennemsnitlige længde af cilier.
For at muliggøre undersøgelse af ciliær lokalisering af hidtil karakteriserede membranproteiner i olfaktoriske neuroner, vi optimeret en en face forberedelse teknik, der gør det muligt detaljeret analyse af protein lokalisering i cilier. Kort fortalt er musen aflivet, og hovedet delt nær midterlinjen. Turbinates, nasal og frontale knogler fjernes for at blotlægge septum. Skillevæggen med olfaktoriske del af foringen epitel løsnes ved at skære alle forbindelser til næsehulen. Efter at skillevæggen i en petriskål fyldt med Ringers opløsning, epitel skrælles und overført til et overtrukket objektglas. Efter en kort fixation trin kan immunfarvning procedurer udføres, hvis håndteringen er så skånsom som muligt for at undgå skader på skrøbelige væv. Vi viser den opnåelige opløsning ved at sammenligne farvningen af to forskellige membranproteiner i olfaktoriske cilier i klassiske kryosektioner og i en face, der er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev håndteret på Charité eller Universitetsklinikken Jena i overensstemmelse med tyske Animal Care love undgå enhver unødig lidelse for dyrene.
1. Forberedelse Solutions og Dissection Arbejdsplads
- Løsninger
BEMÆRK: Forbered følgende løsninger, før du starter dissektion af epitel.- Løsninger til dissektion procedure:
- Forbered Ringers opløsning (pH 7,4) med koncentrationer på 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 og 10 mM glucose.
- Forbered en PBS - / - opløsning (pH 7,4) med koncentrationer på 2,68 mM KCI, 1,47 mM KH 2 PO 4, 136 mM NaCl og 8,1 mM Na 2 HPO 4.
- Forbered en fiksativ opløsning (pH 7,2) med koncentrationer af 1x PBS - / -, 0,2 mM CaCl2, 4% saccharose og 4% paraformaldehyd. Saccharose i fikseringsopløsning forbedrer kryosektionering og afhentning af kryosektioner. Opbevares ved -20 ° C.
- Løsninger til farvningsproceduren
- Forbered en PBS + / + opløsning med koncentrationer af 1x PBS - / -, 0,48 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2.
- Forbered en PBST + / + opløsning med koncentrationer af 1x PBS + / + og 0,1% Triton X-100.
- Forbered en blokerende opløsning med koncentrationer af 1x PBST + / + og 1% gelatine.
- Løsninger til dissektion procedure:
- Arbejdsplads
- For dissektion arbejdspladsen, bruge et dissektionsmikroskop med lyse belysning, samt en væske-blokker pen.
- Forbered en petriskål, fyldt med Ringers opløsning og klæbende objektglas.
- Opnå følgende kirurgiske instrumenter: et par kirurgiske sakse med en skarp og en stump spids, et par af forårets saks med lige spids facon, to pincet med fin buet spids form og et barberblad (
2. Forberedelse af næseskillevæggen
- Hus dyr i godkendte bure med regelmæssig adgang til mad og vand og passende dag / nat cyklus.
- Udfør anæstesi i en lukket beholder indeholdende gaze gennemvædet med 100% isofluran og monitor analgesi ved at teste bageste fod reflekser. Da cervikal dislokation kan forårsage blod i næsehulen direkte halshugge bedøvede mus.
- Fjern huden for at blotlægge knoglen af hele kraniet og næse, og aftørre resterende blod og væv grundigt med en papirserviet. Fjern den nederste kæbe og den forreste tænder.
- Incise den dorsale knogle af næsen bilateralt i 1-2 mm afstand parallelt suturlinjen at adskille den ene side af skillevæggen (medialt) fra maxilla (lateralt). Split næsen med et enkelt snit. Hvis knoglerester og turbinates stadig er fastgjort til septum, fjerne disse omhyggeligt at blotlægge skillevæggen fuldstændigtuden at røre den.
- Fjern den dorsale nasal knogle ved at skubbe den fine buede spids af en pincet langs den dorsale side af skillevæggen mellem skillevæg og nasal knogle. Påfør et let tryk på knoglen, skubbe den op og fjerne det.
- At give adgang til de to septumdefekter væv, en fra hvert hulrum, forsigtigt fjerne overkæben af den anden side af hovedet. Ved udarbejdelsen af ældre dyr (P> 28), fjerne spidsen af frontal knoglen, der dækker de olfaktoriske pærer.
- Identificer lugteepitelet ved sin let gullig farve (figur 1B). De tilgrænsende respiratorisk epitel er hvid og viser bevægelse af motile cilier, der kan ses under dissektionsmikroskop. Skær langs grænsen mellem olfaktoriske og respiratorisk epitel med et par fine forår saks.
- Forlæng snittet og adskille skillevæggen fra den ventrale forbindelse til vomer knogle. Derefter skæres langs grænsen mellem skillevæggen og lamina cribrosa af Os etmoidale. Skillevæggen er nu fuldstændig isoleret fra alle forbindelser til hovedet. Brug skærepositioner vist i figur 1C.
3. Isolering af lugteepitelet for Immunfarvning
- Placer en klæbende objektglas i petriskålen fyldt med Ringers opløsning. Det anbringes på kanten af petriskålen, således at den ene halvdel af glasset ligger i Ringers opløsning (figur 1A).
- Brug en pincet til forsigtigt at overføre ethmoid knogle med lugteepitelet til petriskålen. Løft det uden at snuppe den med tangen tips.
- Tag den vinkelrette plade af ethmoid knogle med en pincet og bruge en anden til forsigtigt at fjerne epitel fra den ene side af skillevæggen. Skub den buede spids mellem den vinkelrette plade og epithel at skrælle epithelet af.
- Vær altid sikker på at identificere den ciliære side, i tilfælde af epitel flips i Ringers solutipå. Hvis epitel flips, er det næppe muligt at identificere den ciliære side bagefter. Meste epitelet ruller op med den ciliære overflade inde.
- Sammenlign indskrevet væv form med de skærende positionerne vist i figur 1C. Grib epithelet ved en position ved grænsen og træk det på objektglasset. Rør ikke ved ciliære side med pincet for at undgå læsioner i vævet.
- Drej skillevæggen og gentag proceduren med epitel fra den anden side.
- Tør objektglasset omkring begge stykker af olfaktoriske epitel med en papirserviet og omslutte vævet med en væske-blokker pen.
- Fastgør vævet med 150 pi fikseringsopløsning i 10 minutter ved stuetemperatur. Vedrørende cilier stabilitet og integritet, anvende korte fikseringstidspunkter for en række testede antistoffer. Inden disse 10 min cilier er faste, men sandsynligvis ikke hele epitel væv. Således øjeblikkelig visualisere med mikroskopet efter de sTaining procedure. Fastgørelse gange kan dog variere for de enkelte antistoffer.
4. Farvning protokollen
BEMÆRK: Håndter vævet meget omhyggeligt for at bevare ciliære strukturer af olfaktoriske sensoriske neuroner. Fjern løsninger ved pipettering. Tab ikke nogen løsninger direkte på epitel, som mekaniske kræfter kunne forstyrre den fine cilier. Udfør alle trin ved stuetemperatur, hvis ikke andet er angivet.
- Fjern fikseringsopløsning og vaskes 2 gange med PBS + / +.
- Inkubér epithelet i mindst 1 time med blokerende opløsning.
- Forbered primære antistof opløsning ved at opløse antistoffet i blokerende opløsning (1: 200 for antistofferne anvendt i denne undersøgelse) og centrifugeres i 5 minutter ved fuld hastighed for at fjerne eventuelle bundfald.
- Inkuber epithelet med antistof opløsning i et fugtigt kammer ved 4 ° CO / N.
- Vask epitel med PBS + / + i 5 minutter mindst 3 gange.
- Forbered sekundært antistof opløsning ved at opløse antistoffet i blokerende opløsning (1: 500) og centrifugeres i 5 minutter ved fuld hastighed.
- Inkuber epithelet med sekundært antistof opløsning i 1 time i et mørkt kammer.
- Vask epitel med PBS + / + i 5 minutter mindst 3 gange.
- Fjern væsken-blokker med et barberblad eller en papirserviet. Vask epithelet med destilleret vand i 5 s.
- Bevare vævet i antifade monterings reagens.
BEMÆRK: baggrundsfluorescens stiger hurtigt i dage; mikroskopiske analyse senest 2 dage efter indlejring i montering medium anbefales derfor. Særlig forsigtighed skal tages ikke at presse vævet, når du søger den rette brændplan, da det alvorligt kan skade præparatet. På grund af out-of-fokus fluorescens, er yderligere undersøgelser med konfokal mikroskopi anbefales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lugteepitel en face præparater kan anvendes til at undersøge lokalisering af proteiner i cilia af sensoriske neuroner, tillade detaljeret undersøgelse af proteiner, hvis lokalisering er uklar efter analyse af kryosektioner. Dette problem kan eksemplificeres i tilfælde af farvning for Kin af IRRE-lignende protein 2 (Kirrel2). Kirrel2 (også kaldet Neph3) er et medlem af immunoglobulin (Ig) superfamilie af membranproteiner og fungerer som en homofil adhæsion protein. Det viste sig at spille en rolle i axon-vejledning i det olfaktoriske system og til at blive udtrykt i en delmængde af olfaktoriske neuroner i en aktivitet afhængig måde 10.
Immunfarvning for Kirrel2 i en typisk kryosektion gennem lugteepitel viste lokalisering af Kirrel2 i axoner, soma og dendritter (figur 2A). Alle opløsninger blev fremstillet som beskrevet ovenfor for en face fremstillingsteknik. Selv om nogle labeling vises oven på laget består af de dendritiske drejeknapper, ciliaere lokalisering fortsat usikker efter analyse af kryosektioner. Nogle neuroner udviste farvning i og omkring de olfaktoriske knop, men enkelt cilier var vanskelige at identificere. I modsætning hertil en face fremstilling af lugteepitelet udført ifølge den ovenfor beskrevne protokol entydigt viste ciliære lokalisering af Kirrel2 (figur 2B). Interessant nok blev Kirrel2 kun udtrykt i cilier af et relativt lille delmængde af olfaktoriske neuroner, selvom analyse af farvede kryosektioner viste ekspression i en langt større procentdel af neuroner. I øvrigt har en face forberedelse ikke blot demonstrere ciliær farvning i almindelighed, men afslørede variationer i ciliære ekspressionsmønstre spænder fra neuroner med mange lange cilier til neuroner med kun få kort cilier. I nogle celler blev Kirrel2 påvist i dendritiske knop, men ikke i cilier strækker sig fra denne knap. Den c ABrug og funktionel relevans af dette fund er endnu ikke klarlagt, men det illustrerer potentialet i en face forberedelse til at give ny indsigt i protein lokalisering i det olfaktoriske system.
Desuden har vi gennemført en immunfarvning for olfaktoriske receptor Mor-EG, som udviser stærk ciliær udtryk 11. Receptoren allerede klart kan identificeres i det ciliære lag i kryosektioner (figur 3A). Ikke desto mindre er en analyse af de detaljerede karakteristika såsom antallet af cilier pr knop eller længden af individuelle cilier er ikke mulig. Brug af en face forberedelse, identifikation af cilier fra neuroner udtrykker det olfaktoriske receptor er let muligt (figur 3B, C). Den en face præparat kan udføres med dyr i forskellige aldre. Selv cilia fra prænatale dyr lykkedes farves og visualiseret (figur 3D).
indhold "> en face præparater udgør derfor et værktøj velegnet til at analysere den ciliære morfologi og lokaliseringen af velkendte ciliære proteiner i detaljer.
Figur 1. Fremstilling af muse hovedet. (A) Placering af dissektion arbejdspladsen. Petriskål fyldes med Ringers opløsning og har en klæbende objektglas. De kirurgiske instrumenter anbefales til en face forberedelse. (B) Efter fjernelse af den ene halvdel af muse hovedet, er skillevæggen udsættes for. Skillevæggen er belagt med olfaktoriske epitel (OE) og respiratorisk epitel (RE). OB: lugtekolben, V:. Vomeronasale organ (C) for at isolere den del af skillevæggen foret med olfaktoriske epitel, skæres skillevæggen langs de påviste linjer med et par fine sakse. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Sammenligning af Kirrel2 immunfarvning i kryosektioner og en face præparater. (A) Konfokal billede (maksimal projektion) af en postnatal dag 60 (P60) kryosektion immunofarvet for Kirrel2 afslører protein lokalisering i olfaktoriske sensoriske neuroner. Single olfaktoriske drejeknapper viser stærk farvning og Kirrel2 lokalisering i cilier antages (stjerne), men usikker. (B) Konfokal billede (maksimal projektion) af en P65 lugteepitel en face forberedelse udviser klar Kirrel2 farvning i cilier af en delmængde af olfaktoriske sensoriske neuroner . (Scale barer, 10 um)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Sammenligning af Mor-EG immunfarvning i kryosektioner og en face præparater. (A) Konfokal billede (maksimal projektion) af en P60 kryosektion immunofarvet for olfaktoriske receptor MOR-EG. Ciliaere lokalisering er allerede påviselige. (B) Konfokal billede af en P65 en face forberedelse immunofarvet for olfaktoriske receptor MOR-EG. MOR-EG udtrykkes kraftigt i cilier af en delmængde af olfaktoriske sensoriske neuroner. I modsætning til kryosnit, cilia egenskaber vedrørende længde, antallet af cilier pr knop og nøjagtig proteinlokalisering kan analyseres. (C) Højere forstørrelse af den indrammede areal i (B). (D) Confocal billede af en embryonisk dag 18 (E18) en face forberedelse immunofarvet for olfaktoriske receptor MOR-EG. Farvning af cilier kan tydeligt ses. (Scale barer, 10 um) Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
