Introduction
De muis reukepithelium in de nasale holte 6-10.000.000 bipolaire olfactorische sensorische neuronen 1. Elke olfactorische neuron kiest één van 1200 geurstof receptor genen voor expressie. Detectie van geurstoffen begint met geurstof binding aan een olfactorische receptor 2, die vervolgens activeert adenylylcyclase type III (ACIII) 3 via de olfactorische specifieke G-eiwit Ga-olf 4. De resulterende toename in cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) opent een cyclisch nucleotide-gated (CNG), selectieve kation kanaal leidt tot influx van Ca2 + en Na + en Ca2 + influx vervolgens leidt tot het openen van een Ca2 + geactiveerde Cl - kanaals 5,6. De resulterende uiterlijke Cl - flux wordt vergemakkelijkt door een hoge intracellulaire Cl - concentratie onderhouden door gestage Cl - opname, waarschijnlijk via de Na + / K + / Cl - cotransporter NKCC1, deCl - / HCO3 - wisselaar SLC4A1, en misschien extra nog worden geïdentificeerd transporteurs 6-8.
Bipolaire olfactorische neuronen enkele onvertakte axonen die rechtstreeks uitsteken in de bulbus olfactorius, en een dendriet die zich uitstrekt tot het oppervlak van het epitheel en eindigt als een gespecialiseerde compartiment, de dendritische knop. Uit deze knop, 10-30 cilia, die een lengte van 50-60 urn te bereiken, uitgaan in de mucus die de epitheliale oppervlak 9. Eiwitten van de canonieke signaaltransductiecascade hoofdzakelijk gelokaliseerd in het membraan van deze trilharen. De verhoogde sensorische oppervlak van het epitheel bevordert het vermogen om geurstoffen detecteren. Door de dichtheid van sensorische neuronen, cilia uitstrekt van naburige dendritische knoppen vermengen. Deze vermenging resulteert in een willekeurig mengsel van cilia van verschillende neuronen, die verschillende soorten olfactorische receptoren op het oppervlak van het epitheel. De detectie en celular toewijzing van ciliaire eiwitten die slechts in een subset van sensorische neuronen is derhalve in cryosecties moeilijk. Bovendien is de precieze lokalisatie van dergelijke eiwitten aan de trilharen nauwelijks mogelijk, aangezien vriescoupes typisch dunner dan de gemiddelde lengte van de cilia.
Het onderzoek van ciliaire lokalisatie van tot dusver ongekarakteriseerde membraaneiwitten in olfactorische neuronen mogelijk te maken, hebben we geoptimaliseerd een eigen gezicht voorbereiding techniek die de gedetailleerde analyse van eiwit lokalisatie in trilharen toelaat. In het kort wordt de muis opgeofferd en het hoofd te splitsen in de buurt van de middellijn. Turbinates, nasale, en frontale beenderen zijn verwijderd om het septum bloot. Het septum met het olfactorische gedeelte van de voering epitheel wordt losgedraaid snijden van alle verbindingen met de neusholte. Na het zetten van het septum in een petrischaal gevuld met Ringer-oplossing, wordt het epitheel afgepeld und overgebracht naar een gecoate glasplaatje. Na een korte fixation stap kunt immuunkleuring procedures worden uitgevoerd als de behandeling is zo zacht mogelijk om beschadiging van de fragiele weefsel te voorkomen. We tonen de haalbare resolutie door het vergelijken van de kleuring van twee verschillende membraaneiwitten in olfactorische trilharen in de klassieke cryosecties en in de eigen gezicht te zijn beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierlijke procedures werden behandeld aan de Charité of Universiteitskliniek Jena in overeenstemming met de Duitse Animal Care wetten geen onnodig lijden van de dieren voorkomen.
1. Voorbereiding Solutions en Dissection Workplace
- Oplossingen
OPMERKING: Bereid de volgende oplossingen voordat dissectie van het epitheel.- Oplossingen voor de dissectie procedure:
- Bereid Ringer's oplossing (pH 7,4) met concentraties van 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 10 mM glucose.
- Bereid een PBS - / - oplossing (pH 7,4) met concentraties van 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2PO 4, 136 mM NaCl, en 8,1 mM Na2 HPO 4.
- Bereid een fixatief (pH 7,2) met concentraties van 1 x PBS - / -, 0,2 mM CaCl2, 4% saccharose en 4% paraformaldehyde. Sucrose in de fixeeroplossing verbetert cryosnijden en pick-up van vriescoupes. Bewaren bij -20 ° C.
- Oplossingen voor de kleuringsprocedure
- Bereid een PBS + / + oplossing met concentraties van 1 x PBS - / -, 0,48 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2.
- Bereid een PBST + / + oplossing met concentraties 1x PBS + / + en 0,1% Triton X-100.
- Bereid een blokkerende oplossing met een concentratie van 1x PBST + / + en 1% gelatine.
- Oplossingen voor de dissectie procedure:
- Werkplaats
- Voor de dissectie werkplek gebruik een dissectie microscoop met heldere verlichting, en een vloeistof-blocker pen.
- Bereid een petrischaal, gevuld met Ringer's oplossing en lijm objectglaasjes.
- Vraag de volgende chirurgische instrumenten: een paar van chirurgische schaar met een scherpe en een stompe punt, een paar van de lente schaar met rechte tip vorm, twee pincet met fijne gebogen tip vorm en een scheermesje (
2. Voorbereiding van het neustussenschot
- Huis dieren in goedgekeurde kooien met regelmatige toegang tot voedsel en water en de juiste dag / nacht cyclus.
- Voeren anesthesie in een gesloten bak met een gaasje gedrenkt met 100% isofluraan en beeldscherm analgesie door het testen achterste voet reflexen. Sinds cervicale dislocatie bloed in neusholten waardoor direct onthoofden verdoofde muizen.
- Verwijder de huid tot op het bot van de gehele schedel en neus bloot te leggen, en veeg de resterende bloed en weefsel weg grondig met een papieren handdoek. Verwijder de onderkaak en de voortanden.
- Incise de dorsale bot van de neus bilateraal 1-2 mm afstand evenwijdig aan de hechting aan een zijde van het septum (mediaal) scheiden van de bovenkaak (lateraal). Splitsing van de neus met een enkele cut. Als het bot restanten en turbinates zijn nog aan het septum, verwijder deze voorzichtig aan het septum volledig blootzonder het aan te raken.
- Verwijder de dorsale neusbeen door het schuiven van de fijne gebogen punt van een pincet langs de dorsale zijde van het septum, tussen septum en neusbeen. Oefen lichte druk uit op het bot, duw hem omhoog en verwijder deze.
- Om toegang tot de twee septale weefsels, één van elke holte voorzien, verwijder de bovenkaak van de andere kant van de weg. Bij de voorbereiding van oudere dieren (P> 28), verwijder de punt van de frontale bot die de olfactorische bollen.
- Identificeer de reukepitheel door de lichtgele kleur (Figuur 1B). De aangrenzende respiratoire epitheel is wit en toont beweging van beweeglijke trilharen die zichtbaar onder de stereomicroscoop. Snijd langs de grens tussen olfactorische en respiratoire epitheel met een paar fijne lente schaar.
- Verleng de snit en scheiden het septum van de ventrale verbinding met de vomer bot. Snijd vervolgens langs de grens tussen het septum en de lamina cribrosa van de Os ethmoïdalee. Het septum is nu volledig geïsoleerd van alle verbindingen met het hoofd. Gebruik de snijposities figuur 1C.
3. Isolatie van de reukepitheel voor Immunokleuring
- Een lijm glasplaatje in de petrischaal gevuld met Ringer-oplossing. Plaats deze op de rand van de petrischaal, zodat de helft van het glas ligt in de Ringer-oplossing (figuur 1A).
- Gebruik een tang om de zeefbeen zorgvuldig over te dragen aan de reukepitheel naar de petrischaal. Til het zonder grijpen het met de tang tips.
- Pak de plaat loodrecht van de zeefbeen met een pincet en gebruik een tweede voorzichtig verwijderen epitheel van de ene zijde van het septum. Schuif de gebogen tip tussen de loodrechte plaat en epitheel aan het epitheel pellen.
- Zorg er steeds voor de ciliaire kant te identificeren, voor het geval dat het epitheel klapt in de Ringer-solutiop. Als het epitheel draait, is het nauwelijks mogelijk om de ciliaire kant daarna identificeren. Meestal, het epitheel rolt met de ciliaire oppervlak binnen.
- Vergelijk de ingeschreven weefsel vorm met de snijposities weergegeven in figuur 1C. Pak het epitheel op een plaats bij de grens en trek het op het glaasje. Raak de ciliaire kant niet aan met de tang om letsels van het weefsel te voorkomen.
- Draai het septum en herhaal de procedure met het epitheel van de andere kant.
- Droog het objectglaasje rond beide stukken reukepitheel met een papieren handdoek en omringen het weefsel met een vloeibaar-blocker pen.
- Bevestig het weefsel met 150 pi fixatief gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wat cilia stabiliteit en integriteit, gebruik korte fixatietijden voor verschillende geteste antilichamen. Binnen deze 10 min trilharen zijn vast, maar waarschijnlijk niet de hele epitheel weefsel. Aldus direct visualiseren met de microscoop na de sTaining procedure. Echter mogelijk fixeermiddel variëren van afzonderlijke antilichamen.
4. kleuringsprotocol
OPMERKING: ga het weefsel heel goed naar ciliaire structuren van de olfactorische sensorische neuronen te behouden. Verwijder oplossingen door pipetteren. Gebruik geen oplossingen direct op het epitheel te laten vallen, zoals mechanische krachten de fijne trilharen kunnen verstoren. Voer alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.
- Verwijder de fixeeroplossing en was 2 maal met PBS + / +.
- Incubeer het epitheel ten minste 1 uur met blokkeeroplossing.
- Bereid primaire antilichaam oplossing door oplossen van het antilichaam in blokkerende oplossing (1: 200 voor de antilichamen die in deze studie) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij volle snelheid om eventuele neerslag te verwijderen.
- Incubeer het epitheel met antilichaam oplossing in een vochtige kamer bij 4 ° CO / N.
- Was epitheel met PBS + / + 5 min minstens 3 keer.
- Bereid secundair antilichaam oplossing door oplossen van het antilichaam in blokkerende oplossing (1: 500) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij volle snelheid.
- Incubeer het epitheel met secundaire antilichaam oplossing gedurende 1 uur in een donkere kamer.
- Was epitheel met PBS + / + 5 min minstens 3 keer.
- Verwijder de vloeistof-blokker met een scheermesje of papieren handdoek. Was het epitheel met gedestilleerd water gedurende 5 s.
- Behoud van het weefsel in antifade montage reagens.
OPMERKING: Achtergrond fluorescentie neemt snel binnen een paar dagen; microscopische analyse uiterlijk 2 dagen na inbedding in montage medium wordt daarom aanbevolen. Speciale aandacht moet niet worden genomen om het weefsel knijpen bij het zoeken van de juiste brandvlak, omdat het beperkt de bereiding beschadigen. Als gevolg van out-of-focus fluorescentie, wordt verder onderzoek met confocale microscopie aanbevolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reukepitheel en face preparaten kunnen worden gebruikt om de lokalisatie van eiwitten te onderzoeken in de cilia van sensorische neuronen, waardoor het gedetailleerd onderzoek van eiwitten waarvan lokalisatie onduidelijk na analyse van vriescoupes. Dit probleem kan worden geïllustreerd bij de kleuring voor Kin van IRRE-achtig eiwit 2 (Kirrel2). Kirrel2 (ook wel Neph3) is een lid van de immunoglobuline (Ig) superfamilie van membraaneiwitten en functioneert als een homofiele adhesie eiwit. Het werd aangetoond een rol in axon-begeleiding spelen in het olfactorische systeem, en worden uitgedrukt in een subset van olfactorische neuronen in een activiteit afhankelijke wijze 10.
Immunokleuring voor Kirrel2 in een typisch cryosectie door reukepitheel geopenbaard lokalisatie van Kirrel2 in axonen, soma en dendrieten (Figuur 2A). Alle oplossingen werden bereid zoals hierboven beschreven voor de bereiding en face techniek. Hoewel sommige lAbeling wordt bovenop de laag uit de dendritische knoppen, ciliaire lokalisatie onzeker na analyse van vriescoupes. Sommige neuronen tentoongesteld kleuring in en rond hun olfactorische knop, maar enkele trilharen waren moeilijk te identificeren. Daarentegen, en face voorbereiding van de reukepitheel uitgevoerd volgens de hierboven beschreven protocol ondubbelzinnig bleek ciliaire lokalisatie van Kirrel2 (figuur 2B). Interessant was Kirrel2 alleen tot uitdrukking in de trilharen van een relatief klein deel van de olfactorische neuronen, hoewel analyse van gebrandschilderd cryosecties toonde expressie in een veel groter percentage van de neuronen. Bovendien heeft het een eigen gezicht voorbereiding niet alleen aantonen ciliary kleuring in het algemeen, maar geopenbaard variaties in ciliaire expressie patronen, variërend van neuronen met vele lange trilharen om neuronen met slechts enkele korte trilharen. In sommige cellen, werd Kirrel2 gedetecteerd in de dendritische knop, maar niet in cilia zich vanaf deze knop. De c ause en functionele relevantie van deze bevinding moet nog worden opgehelderd, maar het illustreert het potentieel van de eigen gezicht voorbereiding tot nieuwe inzichten in eiwit lokalisatie te bieden in het olfactorische systeem.
Daarnaast voerden we een immunostaining voor de olfactorische receptor MOR-EG, dat een sterke ciliaire expressie 11 vertoont. De receptor is reeds duidelijk herkenbaar in de ciliaire laag in cryosecties (figuur 3A). Niettemin analyse van de gedetailleerde kenmerken zoals het aantal cilia per knop of de lengte van individuele cilia niet mogelijk. De en face, identificatie van cilia van neuronen tot expressie de olfactorische receptor eenvoudig mogelijk is (figuur 3B, C). De eigen gezicht preparaat kan worden uitgevoerd met dieren van verschillende leeftijden. Zelfs cilia van prenatale dieren succesvol gekleurd en gevisualiseerd (Figuur 3D).
content "> En face preparaten daarom een middel geschikt om de ciliaire morfologie en de lokalisatie van bekende ciliaire eiwitten in detail geanalyseerd.
Figuur 1. Voorbereiding van de muis hoofd. (A) Opstelling van de dissectie werkplek. Petrischaal is gevuld met Ringer-oplossing en heeft een zelfklevende glasplaatje. De chirurgische instrumenten worden aanbevolen en face bereiding. (B) Na het verwijderen van de helft van de muis kop, wordt het septum blootgesteld. Het septum is bekleed met reukepitheel (OE) en respiratoire epitheel (RE). OB: reukkwab V:. Vomeronasale orgaan (C) het gedeelte van het septum bekleed met reukepitheel isoleren, snijd het septum langs aangetoond lijnen met een paar fijne schaar. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Vergelijking van Kirrel2 immunostaining in cryosecties en een eigen gezicht voorbereidingen. (A) image confocale (maximaal projectie) van een postnatale dag 60 (P60) cryosectie immunostained voor Kirrel2 onthult eiwit lokalisatie in olfactorische sensorische neuronen. Single olfactorische knoppen tonen een sterke kleuring en Kirrel2 lokalisatie in trilharen wordt aangenomen (asterisk), maar onzeker. (B) confocale afbeelding (maximaal projectie) van een P65 reukepitheel en face stof vertoont duidelijke Kirrel2 kleuring in cilia van een subset van olfactorische sensorische neuronen . (Schaalbalken, 10 pm)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Vergelijking van MOR-EG immunostaining in cryosecties en een eigen gezicht voorbereidingen. (A) image confocale (maximaal projectie) van een P60 cryosectie immunostained voor de olfactorische receptor MOR-EG. Ciliaire lokalisatie is al waarneembaar. (B) confocale beeld van een P65 en face voorbereiding immunostained voor de olfactorische receptor MOR-EG. MOR-EG sterk uitgedrukt in cilia van een subset van olfactorische sensorische neuronen. In tegenstelling tot vriescoupes, cilia kenmerken betreffende lengte, aantal cilia per knop en identificatie eiwit lokalisatie kan worden geanalyseerd. (C) Hogere vergroting van het boxed gebied (B). (D) ConfocAl beeld van een embryonale dag 18 (E18) en face voorbereiding immunostained voor de olfactorische receptor MOR-EG. Kleuring van cilia duidelijk zichtbaar. (Schaal bars, 10 pm) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
