Introduction
O epitélio olfativo do mouse na cavidade nasal compreende 6-10.000.000 neurônios olfatórios bipolares 1. Cada neurônio olfativo escolhe um dos 1.200 genes de receptores olfativos para expressão. Detecção de odorantes inicia por ligação a um receptor olfactivo 2, que, em seguida, activa adenilil ciclase do tipo III (ACIII) 3 através da proteína G específica olfactiva Gu olf 4 odorante. O aumento resultando em monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) abre uma cíclico (CNG), canal de cátions não seletivos levando a influxo de Ca 2+ e Na +, e, posteriormente, Ca 2+ fechado de nucleotídeo influxo leva à abertura de um Cl Ca 2+ ativado - canal 5,6. O resultante exterior Cl - fluxo é facilitada por uma alta Cl intracelular - concentração mantida constante por Cl - absorção, provavelmente através de Na + / K + / Cl - NKCC1 co-transportador, oCl - / HCO3 - trocador SLC4A1, e transportadores ainda a ser identificados talvez adicionais 6-8.
Neurónios olfactivos bipolares têm axónios, não ramificados individuais que se projectam directamente para o bolbo olfactivo e um dendrito que se estende para a superfície do epitélio e termina como um compartimento especializado, o botão dendrítica. A partir deste botão, 10-30 cílios, que pode atingir um comprimento de até 50-60 mm, emanam no muco que cobre a superfície epitelial 9. As proteínas da cascata de transdução de sinal canónico estão principalmente localizados na membrana destas cílios. O aumento da superfície do epitélio sensorial amplifica a capacidade de detectar odorantes. Devido à densidade de neurônios sensoriais, os cílios se estende desde maçanetas dendríticas vizinhos se misturam. Este entrelaçamento resulta numa mistura aleatória dos cílios de diferentes neurónios, que expressam diferentes tipos de receptores olfactivos, na superfície do epitélio. A célula de detecção ealocação ular de proteínas ciliares que estão presentes em apenas um subconjunto de neurônios sensoriais, portanto, difícil de criosecções. Além disso, a localização precisa de tais proteínas ao longo dos cílios é quase impossível, visto que criocortes são tipicamente mais fina do que o comprimento médio dos cílios.
Para ativar a investigação da ciliar localização de proteínas de membrana até agora descaracterizados em neurônios olfativos, otimizamos um en face preparação técnica que permite a análise detalhada de localização de proteínas em cílios. Resumidamente, o rato é sacrificado ea cabeça dividida perto da linha média. Cornetos nasais, e os ossos frontais são removidos para expor o septo. O septo com a parte olfativa do epitélio de revestimento é solto por cortar todas as conexões para a cavidade nasal. Depois de colocar o septo numa placa de petri cheia com solução de Ringer, o epitélio é descascada und transferido para uma lâmina de vidro revestido. Após uma breve FIXATion passo, os procedimentos imunocoloração pode ser realizada se a manipulação é o mais suave possível para evitar danos do tecido frágil. Nós demonstramos a resolução alcançável através da comparação da coloração de duas proteínas de membrana em diferentes cílios olfactiva em criocortes clássicos e na preparação cara en descrito.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais foram manipulados no Charité University Clinic Jena ou de acordo com as leis Animal Care alemães evitando qualquer sofrimento desnecessário dos animais.
1. Soluções preparação e Dissection Workplace
- Soluções
NOTA: Prepare as soluções a seguir antes de iniciar a dissecção do epitélio.- Soluções para o procedimento de dissecção:
- Preparar a solução de Ringer (pH 7,4) com concentrações de 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, e 10 mM de glucose.
- Preparar uma solução de PBS - / - solução (pH 7,4) com concentrações de 2,68 mM de KCl, 1,47 mM de Na KH 2 PO 4, 136 mM de NaCl, 8,1 mM e 2 HPO 4.
- Prepara-se uma solução fixadora (pH 7,2) com concentrações de 1x PBS - / -, 0,2 mM de CaCl2, 4% de sacarose, e 4% de paraformaldeído. Sacarose na solução fixadora melhora crioseccionamento e pick-up de criosecções. Armazenar a -20 ° C.
- Soluções para o procedimento de coloração
- Preparar uma solução de PBS + / + solução com concentrações de 1x PBS - / -, 0,48 mM de MgCl2, 0,9 mM de CaCl2.
- Prepara-se uma PBST + / + solução com concentrações de 1x PBS + / + e 0,1% de Triton X-100.
- Prepara-se uma solução de bloqueio com concentrações de 1x PBST + / + e 1% de gelatina.
- Soluções para o procedimento de dissecção:
- Local de trabalho
- Para o local de trabalho dissecção, usar um microscópio de dissecação com iluminação brilhante, bem como uma caneta líquido-bloqueador.
- Prepara-se uma placa de Petri, cheia com solução de Ringer, e lâminas de vidro adesivas.
- Obter os seguintes instrumentos cirúrgicos: um par de tesouras cirúrgicas com uma afiada e uma ponta romba, um par de tesouras de Primavera com forma de ponta de linha reta, duas pinças com ponta curvada forma fina e uma lâmina de barbear (
2. Preparação do Septo nasal
- Casa animais em gaiolas aprovados, com acesso regular a alimentos e água e do ciclo de dia / noite adequado.
- Realizar anestesia em um recipiente contendo gaze embebida fechado com 100% de isoflurano e monitor de analgesia, testando reflexos nos pés traseiros. Desde deslocamento cervical pode causar sangue nas cavidades nasais, decapitar diretamente ratos anestesiados.
- Retire a pele para expor o osso de todo o crânio e nariz, e limpar o sangue restante e tecido, cuidadosamente, com uma toalha de papel. Remover o maxilar inferior e os dentes da frente.
- Incisão no osso dorsal do nariz bilateralmente em 1-2 mm de distância paralela à linha de sutura se separar um lado do septo (medial) da maxila (lateralmente). Dividir o nariz com um único corte. Se restos de ossos e conchas ainda estão ligados ao septo, retire-os cuidadosamente para expor o septo completamentesem tocá-lo.
- Remover o osso nasal dorsal deslizando a ponta curvada de uma pinça fina ao longo do lado dorsal do septo, entre o septo nasal e osso. Aplique uma leve pressão sobre o osso, empurre-o para cima e remova-o.
- Para proporcionar o acesso aos dois tecidos do septo, um de cada cavidade, remover cuidadosamente a maxila do outro lado da cabeça. Ao preparar os animais mais velhos (P> 28), remova a ponta do osso frontal que cobre os bulbos olfatórios.
- Identificar o epitélio olfactivo pela sua cor ligeiramente amarela (Figura 1B). O epitélio respiratório na fronteira é branco e mostra o movimento dos cílios móveis que podem ser vistas sob o microscópio de dissecação. Corte ao longo da fronteira entre o epitélio olfativo e respiratória com um par de tesouras de primavera.
- Estender o corte e separar o septo a partir da conexão ventral ao osso vômer. Em seguida, corte ao longo da fronteira entre o septo e lâmina cribrosa do etmoidal Ose. O septo é agora completamente isolada de todas as conexões com a cabeça. Use as posições de corte mostrado na Figura 1C.
3. O isolamento do Olfativo Epithelium para Immunostaining
- Coloque uma lâmina de vidro adesiva na placa de petri cheia com solução de Ringer. Colocá-lo sobre o bordo da placa de petri, de modo que uma metade do vidro encontra-se em solução (Figura 1A) da campainha.
- Use uma pinça para transferir cuidadosamente o etmóide com o epitélio olfativo à placa de Petri. Levantá-lo sem agarrando-o com as pontas fórceps.
- Agarrar a placa perpendicular do osso etmóide com uma pinça e usar uma segunda para remover cuidadosamente o epitélio de um lado do septo. Deslize a ponta curvada entre a placa perpendicular e epitélio de descascar o epitélio off.
- Seja sempre a certeza de identificar o lado ciliar, no caso de o epitélio vira em soluti do Ringerno. Se o epitélio vira, dificilmente é possível identificar o lado ciliar depois. Principalmente, o epitélio enrola com a superfície do ciliar dentro.
- Comparar a forma de tecido inscritos com as posições de corte mostrado na Figura 1C. Agarre o epitélio em uma posição na fronteira e puxe-o para a lâmina de vidro. Não toque no lado do ciliar com a pinça para evitar lesões do tecido.
- Ligue o septo e repetir o procedimento com o epitélio do outro lado.
- Seca-se a lâmina de vidro em torno de ambas as peças de epitélio olfactivo com uma toalha de papel e cercam o tecido com uma caneta líquido-bloqueador.
- Fixar o tecido com solução fixadora 150 uL durante 10 min à TA. No que diz respeito a estabilidade e integridade dos cílios, use tempos de fixação curtos para uma variedade de anticorpos testados. Dentro destes 10 min cílios são fixos, mas provavelmente não o todo tecido epitelial. Assim, visualizar imediato com o microscópio subsequente para os stenção procedimento. No entanto, os tempos de fixador pode variar para anticorpos individuais.
4. Coloração Protocol
NOTA: Lidar com o tecido com muito cuidado para preservar as estruturas ciliares dos neurônios olfatórios. Remover soluções por pipetagem. Não deixe cair quaisquer soluções diretamente no epitélio, como forças mecânicas poderia interromper os cílios bem. Execute todas as etapas na RT se não for indicado o contrário.
- Remover a solução fixadora e lavar 2 vezes com PBS + / +.
- Incubar o epitélio durante pelo menos 1 hora com solução de bloqueio.
- Preparar a solução de anticorpo primário por dissolução do anticorpo em solução (1: 200 para os anticorpos utilizados neste estudo) de bloqueio e centrifugar durante 5 minutos a toda a velocidade para remover quaisquer precipitados.
- Incubar o epitélio com solução de anticorpo numa câmara húmida a 4 ° CO / N.
- Lavar epitélio com PBS + / + durante 5 minutos, pelo menos, 3 vezes.
- Preparar a solução de anticorpo secundário por dissolução do anticorpo em solução (1: 500) de bloqueio e centrifuga-se durante 5 minutos à velocidade máxima.
- Incubar o epitélio com solução de anticorpo secundário durante 1 h numa câmara escura.
- Lavar epitélio com PBS + / + durante 5 minutos, pelo menos, 3 vezes.
- Retirar o líquido-bloqueador com uma lâmina de barbear ou toalha de papel. Lava-se a epitélio com água destilada durante 5 s.
- Preserve o tecido em antifade reagente de montagem.
NOTA: fluorescência de fundo aumenta rapidamente dentro de dias; análise microscópica, o mais tardar dois dias após a incorporação no meio de montagem é, portanto, recomendada. Cuidados especiais devem ser tomados para não apertar o tecido ao pesquisar o plano focal correto, uma vez que pode causar sérios danos à preparação. Devido a fluorescência fora de foco, é recomendável uma investigação mais aprofundada com a microscopia confocal.
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Representative Results
Epitélio olfactivo en preparações cara pode ser utilizado para investigar a localização de proteínas nos cílios dos neurónios sensoriais, o que permite a investigação aprofundada das proteínas cuja localização é claro após análise de criocortes. Este problema pode ser exemplificado no caso da coloração de proteína para Kin IRRE-like 2 (Kirrel2). Kirrel2 (também chamado Neph3) é um membro da superfamília de imunoglobulina (Ig) de proteínas e funções da membrana como uma proteína de adesão homofílica. Foi mostrado desempenhar um papel na orientação axónios no sistema olfactivo, e para ser expressa num subconjunto de neurónios olfactivos em uma maneira dependente da actividade a 10.
Immunostaining para Kirrel2 em um cryosection típica através epitélio olfatório revelou a localização de Kirrel2 nos axônios, soma e dendritos (Figura 2A). Todas as soluções foram preparadas como descrito acima para a preparação en face da técnica. Embora alguns lAbeling aparece na parte superior da camada de mistura composta dos botões dendríticas, ciliar localização permaneceu incerto após análise de criocortes. Alguns neurônios exibiram coloração e em torno de seu botão olfativo, mas cílios individuais eram difíceis de identificar. Em contraste, a en preparação face do epitélio olfactivo realizada de acordo com o protocolo descrito acima demonstrou inequivocamente ciliar localização de Kirrel2 (Figura 2B). Curiosamente, Kirrel2 só foi expressa em cílios de um relativamente pequeno subconjunto de neurônios olfativos, embora a análise de criosecções manchadas mostraram expressão em uma porcentagem muito maior de neurônios. Além disso, a preparação rosto en não apenas demonstrar coloração ciliar em geral, mas revelou variações nos padrões de expressão ciliares que variam de neurônios com muitos cílios longos para os neurônios com apenas alguns curto cílios. Em algumas células, Kirrel2 foi detectado no botão dendrítica, mas não nos cílios que se estendem a partir deste botão. A c ause e relevância funcional deste achado ainda não foi esclarecido, mas ilustra o potencial da preparação rosto en para fornecer novos insights sobre localização de proteínas no sistema olfativo.
Além disso, foi realizada uma imunomarcação para o receptor olfactivo mOR-EG, que exibe forte expressão ciliar 11. O receptor já é claramente identificável na camada ciliar em criocortes (Figura 3A). No entanto, a análise das características detalhadas tais como o número de cílios por botão ou o comprimento dos cílios indivíduo não é possível. Usando a preparação en face, a identificação dos cílios de neurónios que expressam o receptor olfactivo é facilmente possível (Figura 3B, C). A preparação en cara pode ser realizada com os animais de diferentes idades. Até mesmo os cílios de animais pré-natais foram coradas e visualizados (Figura 3D) com sucesso.
content "> En preparações cara, portanto, representam uma ferramenta adequada para analisar a morfologia ciliar e da localização de proteínas ciliares bem conhecidas em detalhe.
Figura 1. Preparação da cabeça de rato. (A) Arranjo do local de trabalho de dissecação. Uma placa de Petri é preenchida com a solução de Ringer e mantém uma lâmina de vidro adesiva. Os instrumentos cirúrgicos são recomendados para a preparação en cara. (B) Depois de retirar a metade da cabeça de rato, o septo é exposto. O septo é revestido com epitélio olfatório (OE) e epitélio respiratório (RE). OB: bolbo olfactivo, V:. Vomeronasal (C) Para isolar a parte do septo alinhados com o epitélio olfactivo, o septo corte ao longo das linhas demonstrado com um par de tesouras finas. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Comparação de Kirrel2 immunostaining em criosecções e en preparações rosto. (A) imagem confocal (projeção máxima), de 60 (P60) cryosection dia pós-natal histoquímica para Kirrel2 revela localização de proteínas em neurônios olfatórios. Puxadores olfativos único show coloração forte e Kirrel2 localização em cílios é assumido (asterisco), mas incerto. (B) imagem confocal (projeção máxima) de um epitélio olfativo P65 en preparação rosto apresenta coloração Kirrel2 claro em cílios de um subconjunto de neurônios olfatórios . (As barras de escala, 10 fim)9 / "target =" _ 52299fig2large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Comparação de Mor-EG immunostaining em criosecções e en preparações rosto. (A) imagem confocal (projeção máxima) de um cryosection P60 histoquímica para o receptor olfativo Mor-EG. Ciliar localização já é detectável. (B) imagem confocal de um P65 en preparação rosto histoquímica para o receptor olfativo Mor-EG. Mor-EG é fortemente expresso no cílios de um subconjunto de neurônios olfatórios. Em contraste com os criocortes, características ciliares relação ao tempo, do número de cílios e por botão de localização exacta da proteína pode ser analisada. (C) Maior ampliação da área de box em (B). (D) Confocimagem al de um dia embrionário 18 (E18) en preparação rosto histoquímica para o receptor olfativo Mor-EG. A coloração dos cílios pode ser visto claramente. (barras de escala, 10 �) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
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