Abstract
생체 내에 현미경 (IVM)을 실시간으로 라이브 동물의 다양한 생물학적 이벤트의 시각화, 모니터링 및 정량을 가능하게 한 강력한 광학 영상 기술이다. 이 기술은 크게 생리적 프로세스 및 특정 기관의 병원체 매개 현상에 대한 우리의 이해를 전진했다.
이 연구에서, IVM은 마우스 간인가하고, 프로토콜 설계 상으로 생체 내 간 순환계를 개별 용기 간 적혈구 (RBC)의 속도를 측정한다. 간 장기 특성을 다른 용기 아형을 시각화 및 혈액 유속 측정을 수행하기 위해 C57BL / 6 마우스에게 정맥 내 간 - 관련 맥관 라벨 형광 플라즈마 시약으로 주입된다. IVM은 관심의 특정 용기 생체 실시간, RBC 속도의 측정에 가능하게한다. 이 방법을 설정하면하는 것이 가능하게됩니다생리적, 병리 적 조건에서 간 혈류 역학 조사. 궁극적으로,이 촬상 계 방법론 L.의 영향을 연구를 위해 중요한 것 간 혈류 역학에 donovani 감염.
이 방법은 다른 감염성 모델 마우스 기관에 적용될 수있다 또한 혈류에 미치는 영향을 정량함으로써 염증에 대한 약물의 효과의 임상 테스트를 미리하도록 확장 될 수있다.
Introduction
장기 별 혈역학는 포유류의 기관의 중요한 생리적 기능입니다. 혈액의 흐름에 이상이 염증의 결과 및 장기 부전 1의 표시 일 수있다. 따라서, 혈류 조직의 구조와 기능은 병리 생리 학적 조건 하에서 분석을위한 임계 파라미터로서 나타난다. 일반적으로 특정 기관에 혈액 흐름을 분석하기 위해 사용 된 기술은 기술 자체의 분해능 한계 등 여러 한계를 포함 (예를 들어 혈류 도플러 촬상) 당 혈액 만 (양의 절대 혈류 측정을위한 용량 기관) (예를 들어, 빛 간섭 단층 촬영)와 혈관 2,3의 크고 이질적인 인구에서 속도의 평균 변화의 측정을 제공하는 장치. 간의 순환 시스템은 크기, 구조와 기능에 이질적인 다른 선박의 하위 유형을 연결합니다. 에이 연구, 생체 내에 현미경 (IVM) 이미징 기술은 고해상도 실시간으로 생체 내 간 혈류 역학을 평가하기 위해 적용되고 평행 간 기관을 구성하는 개별 혈관의 특성을 밝히기 위해서. 이 강력한 광학 이미징 기술의 최근 발전은 연구자가 높은 공간 및 시간 해상도에서 살아있는 동물에서 동적 데이터를 수집 할 수있다. 직접적인 시각화 및 생체 내에서 특이적이고 신속한 생물학적 과정의 실시간 모니터링을 허용함으로써 IVM 이미지 개별 혈관 연구원 수있는 독특한 기회를 제공하고, 측정하고 특별히 선택된 내의 단일 적혈구의 속도 (RBC)를 정량화 간 선박.
본 연구에서 우리는 간에서 혈역학 hepatotropic 슈만 편모충 기생충에 의한 감염 마우스의 영향을 조사하기 위하여 마우스의 간에서 IVM 기법을 구현 하였다. L. donovani내장 리 슈만 편모충 증, 급성 온 만성 염증 반응을 특징으로하는 질환 및 중증 간 및 비장 등의 여러 기관에 존재하는 병변을 담당 에이전트이다. 내장 슈만 편모충 증의 실험 마우스 모델에서 간 감염 자체 해결 비장 감염 4 진보적 인 반면이다. 아직 완전히 이해되지 않은 개별 기관에 대하여 리 슈만 편모충 감염이 결과. 병적 인 상태에서 간 및 비장 혈역학의 조사는 호스트 기생충 상호 작용과 질병 발병 새롭게 조명한다.
우리의 실험 모델 시스템은 노광 및 간 intravasculature의 표지 특정 형광 염료의 정맥 주사를받은 마취 된 마우스의 간을 이미징에 기초한다. 간은 내 생명 현미경 유리한 기관이다. 작은 incisio을 수행 한 후n은 복부, 간은 부드럽게 외부화 된 후 심장 박동과 호흡으로 인해 어떤 모션 아티팩트를 감소시키는 것을 목표로 커버 슬립에 젖은 거즈에 배치합니다. 간 후, 현미경 렌즈의 시야 내에 배치된다. IVM 연구를위한 두 개의 광자 현미경의 사용을 필요로 비장과 림프절에 비해 간암의 이점은 최대 침투 깊이와, 종래의 공 초점 현미경의 사용을 허용 그 균질 3D 구조 / 해부학에 놓여 약 50 μm의, 생체 내에 현미경 영상 5-8합니다.
본 연구는 개개 혈관 RBC 속도와 혈류 속도의 정량적 측정을위한 두 개의 독립적 인 촬상 방법을 설명한다. 첫번째 방법에서, 간 혈류량은 시간 차원 XY 양방향 모드를 사용하여 획득된다. 그 결과 xyt 데이터는 individ의 추적을 허용 무료 ImageJ에 소프트웨어의 MtrackJ 플러그인을 사용하여 분석시간이 지남에 따라 연간 적혈구. 두번째 방법에서, 하나의 혈관이 선택되고, 그 대응하는 혈류는 공 초점 레이저 주사 현미경의 라인 주사 빠른 획득 모드를 사용하여 분석된다. 관심의 용기 축선을 통해 중심 축을 따라 높은 주파수에서 스캔됩니다. 혈액 유속이어서 표지 된 어두운 적혈구와 혈장 사이의 형광 표지 된 콘트라스트의 차이에 기초하여 정량화된다. 스캔 라인을 따라 얻은 적혈구와 혈장의 형광 강도가 줄무늬를 얻는 시간에 대해 도시되고, 각도가있는 개별 RBC의 속도에 비례한다.
이 문서의 목적은 간 개별 혈관 내 이미징을위한 간단하고 재현 가능한 방법 및 측정 혈류 속도를 제공하고, 마우스 수술, IVM 그리고 속도의 정량 분석의 성공적인 성능에 대한 기본적인 도구를 사용할 수 있도록하는 것이다 개별 적혈구. 티그의 접근 방식은 연구자가 병적 인 상태에서 혈액 속도에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.
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Protocol
윤리 문 : 모든 동물 연구가 엑스 - 마르세유 Université, 프랑스의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 가이드 라인 및 프로토콜에 따라 수행되었다. 8에서 여성 C57BL / 6 마우스 - 오래된 10 주 상업적 Décret N ° 8 87-848 년 10 월 19 일 1987 년 파리의 규칙에 따라 획득 및 처리 하였다. L.를 사용하는 모든 실험 donovani LD1S 기생충은 프랑스와 유럽 연합 (EU) 법률에서 바이오 안전성 규정에 따라 실시 하였다.
L. 1. 마우스 감염 donovani Promastigote 기생충
- L.의 유지 보수를 위해 시험 관내 배양 배지를 준비 donovani의 promastigote 기생충, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- M199 매체를 사용합니다. (30 분 동안 56 ℃에서 열 - 불 활성화)를 10 % 소 태아 혈청 M199 배지를 보충하는 25mM HEPES pH가 6.9, 12 mM의 NaHCO3를, 1 밀리미터 GLUtamine, RPMI 16,040 비타민 믹스, 10mM의 엽산, 100 mM의 아데노신, 7.6 mM의 헤민, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신.
- 문화는 25cm 2 통풍이 플라스크에 26 ° C에서 완전한 M199 배지 10ml에 기생충을 LD1S.
- 연속 차동 원심 분리 단계를 사용하여, metacyclic 형태로 충실 promastigote 기생충의 인구를 준비합니다.
- 중반 로그 위상 기생충 문화를 수확. hemocytomer에 계산합니다. 완전한 M199 배지 10ml에 5 × 5 기생충 / ㎖를 재현 탁. 그들은 (약 5-6일에서) 말 고정상에 도달 할 때까지 혐기성 조건에서 기생충 문화를 성장.
- 비 metacyclic 기생충 펠렛 뜨는을 복구하고 10 분 동안 26 ° C에서 2,500 XG에 다시 스핀 26 ° C에서 10 분 동안 1,200 XG에서 LD1S 문화를 스핀.
참고 :이 최종 펠렛은 매우 metacyclic promastigote 기생충에 충실. - 1의 펠렛을 재현 탁PBS의 00 μL. V 및 혈구를 사용하여 기생충을 계산 : 25 % 글루 타르 알데히드와 1/100 V를 고정을위한 작은 나누어지는을 제거합니다.
- PBS에 1 × 10 1백분의 7 μL로 농축-metacyclic 기생충 인구를 희석. 마취 된 쥐의 꼬리 정맥에 기생충 현탁액을 주사 30 G 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 (아래 참조). 대조군의 경우, 꼬리 정맥에 100 ㎕의 PBS를 주입.
2. 외과 적 치료
- 30 분 동안 70 % 에탄올로 살균 소독제 분무 작업 공간과 모든 수술기구를 소독.
- 125 ㎎ / ㎏의 케타민 12.5 밀리그램 / PBS에 희석 kg 자일 라진을 함유하는, 동물의 중량에 따라 마취 용액을 준비한다.
- 마우스를 달아 복강 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 마취의 적절한 투여 량을 주입.
- 따뜻한 마우스를 유지하고 마우스가 완전히 anesthe 있는지 확인진행하기 전에 발 패드를 집어 HSV 공간. 60 분마다 마우스의 마취 용액 반 도즈를 재 주입.
- 마우스의 복부를 면도하고 Vetedine로 청소. 복부의 왼쪽에있는 흉부 케이지 아래의 피부와 근육의 작은 절개를합니다.
- 다만 열린 영역 아래 복부에 촉촉한 거즈 조각을 놓습니다. 간을 노출하고 거즈에 놓습니다. 간 위의 촉촉한 거즈의 다른 조각을 놓습니다.
- 장소는 24 X 60mm 2-150 μm의 두께 coverslip에, 시아 노 아크릴 레이트 결합 현미경 시각화를위한 간에, 금속 프레임에.
- 젖은 거즈로 마우스의 눈을 보호합니다.
- 촬상 세션 후, 경부 탈구에 의해 동물의 마취를 안락사.
간 아키텍처 3. 생체 내에 현미경 이미징
- 에 장착 반전 촛점 현미경 생체 내에 현미경 실험을 수행hermostatic 실, 아포 크로매틱 63X 오일 글리세린 침지 목표 (NA 1.4), 아르곤 (488 ㎚)와 헬륨 네온 (543 nm의, 633 nm의) 레이저 및 청색 다이오드 (405 나노 미터)을 제어.
- 목적에 간 얼굴을 덮고있는 커버 슬립과 현미경의 무대에 마우스를 놓습니다. 29 ° C까지 챔버의 온도를 설정합니다. 사인 곡선의 시각화를 허용하는 간 자기 형광을 사용하여 초점을 조절합니다.
- 혈관을 시각화하기 위해 각 마우스 PBS 100 ㎕에 희석 500 μg의 BSA - 알렉사 647의 솔루션을 준비합니다. 30 G 바늘을 1 mL를 주사기를 사용하여 마취시킨 쥐의 꼬리 정맥에 정맥 내 용액을 주입한다.
- 간세포 핵을 시각화하기 위해 PBS에 훽스트 33342의 용액을 제조 하였다. 복강 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 마우스의 8 ㎎ / ㎏에서이 솔루션을 주입한다.
- 이미지 간 400 Hz에서 일반 연속 모드, 63X 침지 객관적이고 스캐너를 사용하여세포 핵 및 간 혈관. 훽스트 여기에 대한 405 nm의 청색 다이오드와 BSA - 알렉사 647 여기의 633 nm의 레이저를 켭니다. 아르곤 488 nm의 레이저를 켜고 간자가 형광을 시각화하기 위해 대규모 인수 대역을 정의합니다.
혈류 속도 측정을위한 간 4. 생체 내에 현미경 이미징
- 현미경 (LAS-AF 뷰어 버전 3.1.0 빌드 8587)의 LAS 소프트웨어를 엽니 다. 현미경 소프트웨어를 열 때 공진 스캐너 모드를 선택합니다.
- 하드웨어를 설정하려면 구성 탭을 클릭합니다. 레이저를 클릭하고 헬륨 네온 레이저 (633)를 선택합니다. 설정을 클릭하고 12 비트 해상도를 선택합니다.
- 취득 메뉴를 클릭합니다. 빔 경로 설정 창에서, 목적 63X를 선택하고 100 %로 633 레이저 파워를 설정합니다. 신호 이득과 PM1-3 드롭 다운 메뉴에서 알렉사-633을 선택하여 설정 매개 변수 오프를 활성화합니다.
- 획득 탭에서 'xyt'인수를 선택모드. 1,024 X 1,024에서 설정 서식의 폭. 8,000 Hz에서 속도를 선택합니다. 3 에어리 단위의 핀홀을 선택합니다. 양방향 모드를 선택하지 마십시오 3의 줌 배율을 선택합니다.
RBC 속도 5. 정량 분석 xyt 이미지를 사용 (방법 1)
- 라이브 모드에 혈액의 흐름을 시각화하는 '라이브'아이콘을 클릭합니다. 관심 영역을 선택하고 분석을 위해 특정 혈관을 선택한다. USB 제어판 'X', 'Y'및 스캔 필드 회전 좌표를 조정하여 수평 위치에 관심 용기를 설정한다.
- 관심 용기가 설정되면 '라이브'모드를 중지. 선택, 창, 선 평균 = 1, 프레임 평균 = 1을 설정 획득 모드에서 1,024 X 256 포맷 설정 폭을 변경 이미지를 얻기위한 '시작'에 150 클릭 "스택".
- 사용 RBC 속도의 정량적 분석을위한 "xyt"이미지는 ImageJ에 소프트웨어를 엽니 다. '파일'을 선택ImageJ에있는 탭을 누른 다음 원하는 파일을 선택 "열기"를 클릭합니다.
- ImageJ에있는 '플러그인'메뉴로 이동 궤적 및 바이오 형식 옵션을 가져 오기를 선택합니다. 이 창에서 'hyperstack'로 매개 변수를 볼 수 스택을 선택합니다. "xyzct"스택 순서 옵션에서 옵션을 선택합니다. 참고 :이 인수의 모든 일련의 창을 엽니 다.
- ImageJ에 메뉴에서 '플러그인'을 클릭하고 MTrackJ 옵션을 선택합니다. 작은 창에 '추가'아이콘을 클릭하고 추적하기 위해 적혈구를 클릭합니다. 각각의 다음 프레임에서 같은 RBC 클릭하고 속도를 측정하는 '측정'아이콘을 클릭합니다.
참고 : .exl 형식으로 저장할 수 있습니다 생성 된 파일을. - 용기 당 다섯 적혈구 최소 트랙과 동일한 크기의 세 개의 개개의 용기의 최소 분석.
XT 라인의 이미지를 사용하여 RBC 속도 6. 정량 분석 (방법 2)
- 혈액 F를 시각화하기 위해 '라이브'를 클릭라이브 모드에서 낮은. 분석 용 특정 혈관을 선택한다. 수평 위치에 관심있는 용기를 설정합니다. 관심 용기가 설정되면 '라이브'모드를 중지.
- 'XT'스캔 모드를 선택하고 라인 스캔 따라 선택된 선박의 중앙 루멘을 설정합니다. 설정 형식 폭 1024 X 512, 속도 = 8,000Hz, 라인 평균 = 32, '시작'과 XT 라인 이미지를 수집에 시간 = 512 클릭에서.
- .lif 파일을 열고 관심있는 XT 라인 이미지를 열어 RBC 속도의 정량 분석을위한 줄무늬를 생성합니다. LAS-AF 소프트웨어에서, "실험"을 선택 .lif를 열고 이미지를 선택합니다. 참고 : 자동으로 kymograph을 엽니 다.
- 이 kymograph에 (X 축 상 얻어진 D) 소정 거리를 이동하기 (어두운 반사 표시) 입자 연속 요구 (t, Y 축 상에 얻음) 시간을 측정한다. 도구 "선을 그립니다"하고 행진에 수평으로 선을 그릴을 선택합니다. 거리에 유의μm의 이미지 하단의 결과 탭 발생 시간 (초 단위).
- kymograph에서 얻은 값을 사용하여 V = 거리 / 시간과 속도를 계산합니다.
- XT 이미지 당 다섯 입자 줄무늬의 최소값과 동일한 크기의 세 개의 개개의 용기의 최소 정량화.
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Representative Results
간에서 정현파의 구체적인 건축 조직 시각이 기관 (도 1, 패널 B와 C, 녹색), 간세포 핵 라벨링 훽스트의 복강 내 주사의 autofluorescent 속성에 기초 할 수있다 (도 1B, 블루) 그리고 간 순환 시스템 (그림 1C, 적색)의 염색에 대한 형광 BSA의 정맥 주사. 직경 40-700 μm의 2 (D)에서 300 μm의 2 이상 μm의 2, 대형 선박의 D 40 ~ 80 사이의 간은에 이르기까지 다양한 기능과 구조와 크기가 여러 가지 혈관 하위 유형으로 구성된다 (소형 선박의 개발이다 ). 간 생체 내에 현미경 영상은 간 혈관 (그림 1C)의 이질성과 복잡성의 높은 해상도로 시각화 할 수 있습니다.
개별 VESS 혈류 속도를 모니터링 할ELS, 두 개의 다른 방법은 생체 내 간 혈관 이미지 수집 및 데이터 분석을 위해 사용된다. 첫번째 방법에서, 관심있는 용기 내의 혈액 흐름의 실시간 이미징 xyt 주사 모드 (동영상 1)를 사용하여 수행된다. 하나의 용기의 개별 RBC의 속도의 정량 분석 ImageJ에 소프트웨어 (도 2A 및 2B)에 MTrackJ 플러그인을 사용하여 수행된다. 용기에 5 입자의 최소 40 ~ 80 μm의 2에서 직경에 이르기까지 서로 다른 혈관에서 추적됩니다. 이 방법으로 얻어진 결과는 다른 마우스에 걸쳐 일관되고 재현 값을주고 25 ~ 35 μm의 / 초 (그림 2C) 사이의 값에서 작은 간 혈관에서 적혈구 속도를 평가한다.
두 번째 방법은 반복적 혈관 내강의 중앙에 배치 된 라인과, 상기 용기 벽에 평행 한 선을 따라 주사로 구성된다.그림 3은 해당 XT 라인 스캔 (오른쪽 패널)와 XY 프레임 스캔 (왼쪽 패널)를 보여줍니다. 개별 RBC의 속도 비 V = 거리 / 시간으로 주어진다 및 XT 화상에서 얻어진 연속의 X 및 Y 축에 직교 돌기를 이용하여 계산된다. 도 3D 및 3E에서, 각각의 데이터 포인트는 상이한 마우스로부터 선택된 다른 크고 작은 혈관으로부터 개별 RBC의 속도를 나타낸다. 오차 막대로부터 알 수있는 바와 같이, 데이터는 RBC 속도 사이의 상대적으로 낮은 변이를 표시하고 혈류 속도가 작은 혈관보다 큰 혈관에 극적 빠르다는 것을 나타낸다. 혈액의 흐름 속도가 작은 용기의 다른 유형에 걸쳐 비교적 유사한 반면 또한, 대형 선박의 다른 유형에서 얻은 속도 값에서 현저한 변화가 관찰되었다. 이 새로운 방법에 혈류 측정은 앞서 설명에서 얻은 정보에 필적 데이터를 생성MTrackJ을 (3D 그림 그림 2C 비교)을 사용하여 개발하는 방법. 도 3c에 이미지 프레임 XY 스캔 않은 해석 XT 화상을 생성하는 차선의 실험의 대표 예를 나타낸다. 특히이 경우, 문제가 관심 용기 안감 내피 세포로 BSA의 빠른 내부화) 모두 난으로부터 결과 및 ⅱ) 취득의 선택 영역에서 혈류를 교란 두 혈관 사이의 접합의 존재. 혈관을 라이닝 내피로 플라즈마 시약의 내재화 율은 혈류 속도를 측정 할 때 내재화가 줄무늬를 도시 XT 이미지의 품질을 변경하는 바와 같이, 고려해야 할 중요한 파라미터이다. 내재화 율 비판적 정맥 내 주사되는 염료의 투여 량에 의존한다. 그림 4에서 우리는 500 BSA - 알렉사 647 및 / 또는 덱스 트란-FITC의 500 kDa의의 μg의는 수오 최적의 투여는 것을 보여LD은 혈류 속도의 정량에 이용 될 수있다. 이러한 투여 량은 밝은 배경 어두운 입자로서 RBC의 식별을 허용하는 매우 밝은 신호를 생성하고 주입 염색 (도 4, 하단 패널)의 내재화없이 1 시간 이상 동안 혈류의 시각화를 가능하게한다. 대조적으로, 50 BSA-알렉사 647 및 / 또는 500 kDa의 덱스 트란 FITC (미도시)의 μg의은 간암의 혈관 네트워크의 시각화를 허용하는 동시에, 인해 매우 빠르게 내재화 혈류 속도를 측정하기위한 준 최적 투여 량은 5 분 후 주입 시작 염료, (그림 4, 하단 패널).
감염된 동물의 간장에이 방법을 적용 할 때, 우리는 즉시 1 시간 후 감염 등의 혈류 속도의 현저한 증가를 관찰 하였다. RBC 속도의 변화는 24 시간 후 감염까지 유지된다. 궁극적 정상 값에 도달72 시간 후 기생충 주입에서 (그림 5). 따라서,이 실험은 간 혈역학에 병리 적 상태의 영향에 새로운 통찰력을 얻기 위해,이 방법의 사용을 검증한다.
그림 1 : 마우스 간 생체 내에 현미경 마우스 (A) 간 수술.. 간 엽의 작은 지역은 수술 후, 두 촉촉한 거즈 조각이 주위에 배치하고 슬라이드 공 초점 현미경의 스테이지에 배치되는 마우스 전에 간을 충당하기 위해 복부에 넣어 노출되어있다. 간 정현파 간 장기를 포함 혈관의 서로 다른 크기를 보여 비 감염된 마우스의 간 대표 영역 (B, C) 이미지. 간 자기 형광은 녹색으로 표시됩니다. 마우스의 Hoechst 33342 (파란색) 시간에 레이블로 주입epatocyte 핵 (B) 및 BSA-알렉사 647 (레드) 주입은 간 혈관 구조 (C)를 시각화한다. 스케일 바, 50 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 빠른 XY 주사 모드를 이용하여 마우스의 간 생체 내에 현미경 이미징에 의해 취득 작은 간 용기 내에서 혈액 순환 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 XY 프레임 스캔에서 RBC 풍속 정량 분석 (A) 주제 XY 이미지. 어두운 부분은 적혈구에 해당합니다. 스케일 바, 10 μm의. ImageJ에에서 MTrackJ 플러그인을 사용하여 하나의 적혈구의 속도 (B) 부량. 선 (빨강, 노랑, 흰색)는 개별 적혈구의 시간이 지남에 따라 궤적을 나타냅니다. 개별 SM에서 (C) RBC 속도모든 간 선박 (D는 약 50 μm의 2). 그래프는 다섯 가지 다른 생쥐 (1-5)에서 선택된 개별 간 혈관 추적 다섯 독립적 적혈구의 속도를 나타내는 값. D는 μm의 2 배의 직경을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : XT 라인 스캔 모드를 사용하여 혈관의 생체 내에 현미경 이미징에 의해 간 혈류 측정 BSA - 알렉사 647 및 해당 XT 이미지 (오른쪽 패널)으로 표시 간 혈관의 대표 XY 이미지 (왼쪽 패널)에서 얻을. 개별 선박의 중앙 루멘의 라인 스캔. (A, B) 작은 (A) 및 대형간 용기 (B). (C) 내피 세포로 두 혈관의 교차점과 BSA 내재화를 나타내는 차선의 실험에서 대표 데이터. (D, E) 그래프는 다섯 가지 마우스에서 선택 (E에서 D에서 소형 및 대형) 용기 당 3 개의 독립적 인 적혈구의 속도의 값을 플롯. D는 μm의 2 배의 직경을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 사인 곡선 안감 내피에 그것의 내면화에 형광 플라즈마 염료의 투여 량의 효과는이 이미지는 시간과 사출 용량의 함수로, 사인 곡선을 긋고있는 내피 세포에 BSA 및 덱스 트란 500 kDa의의 국제화를 추적합니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : L.의 효과 간 혈류에 donovani 감염. L. 감염되었다이 그래프는 감염되지 않은 마우스 (NI)에서 여러 개별 혈관에서 얻은 혈액의 속도 값 및 생쥐 donovani는 1 시간, 24 시간, 72 시간 게시물 감염 (PI)를 분석 하였다. 각 점은 약 50 μm의 (2)의 하나의 혈관에서 얻은 다섯 RBC 속도 측정의 평균값을 나타낸다. 각 조건에서 (NI는 1 시간 PI, 24 시간 및 72 시간 PI의 PI) 세 마우스의 최소 혈류 속도에 대해 분석 하였다. 별 얻어진 혈류 속도에 상당한 차이를 나타낼 1 시간 및 NI 마우스에 비해 24 시간 PI (P <0.01, 하나의 일원 분산 분석).
영화 마우스 간. 영화 1의 1 시간 경과 생체 내에 현미경 영상 3도에 해당합니다. 마우스가 혈관을 시각화하는 BSA-알렉사 647의 주사를 받았다. 세 개의 작은 용기 (50 μm의 2의 d)에 혈액 흐름이 표시됩니다. 검은 색 영역은 적혈구에 해당합니다.
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Discussion
마우스 간 생체 내에 현미경의 최근 발전은 생체 내에서 실시간으로 5,9,10 감염에 대한 생리적 반응의 조사에 대한 새로운 가능성을 엽니 다. 장기 혈액의 흐름은 종종 많은 질병에서 변경되는 중요한 생리적 파라미터이다. 그러나 생리 학적 감염성 조건 하에서 간 혈류의 상태를 제대로 탐구 영역 남아있다. 본 연구에서는 이전에 비장 및 종양 맥관 연구를위한 적응시켰다 IVM 기반 방법은, 하나의 용기 내에서의 간 혈류 속도를 정량화 및 생체 11,12 개별 RBC 속도를 측정하기 위해 실시 하였다. 여기에 사용 된 방법론은 형광 BSA로, 마우스에 정맥 내 주사 플라즈마 형광 간의 콘트라스트에 의존하고, 적혈구, 어두운 남아있다. 생체 내 혈류 측정 질병 프로 우리의 이해를 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고세 스.
여기서, 두 가지 방법이 사용 및 간 혈관의 혈류를 측정하기 위해 비교 하였다. 수동 ImageJ에 소프트웨어 MTrackJ 플러그인을 사용하여 개별 용기에서 RBC의 움직임을 추적하기 위해 사용자를 필요로 제 방법은 시간 소모적이고, 데이터 분석의 기간에 까다로운이다. 스캐너는 공진 모드 라인 스캔 인수로부터 생성 된 혈관의 XT 이미지의 분석으로 구성으로서 제 2 방법은, 간단하고 빠르다. 이 방법은 유사한 선박에 대한 비교 데이터를 제공합니다. 우리의 지식, 혈류 속도가 약 10 ㎛의 폭과 같은 소형 선박 및 마우스 정현파 모세 혈관 정량화 된 적이으로이 단계에서 그것은 다른 사람들과 우리의 데이터를 비교하는 것은 거의 불가능하다. IVM 기반 방법은 10 ~ 50 ㎛ 인 (13)의 폭과 정현파의 분석을 가능하게 500 nm 인 XY 높은 해상도를 허용한다. 대조적으로, 도플러 기반 기법은 최대 레졸을70 ㎛ 인의 ution, 따라서 간 동맥과 정맥 포털 3 혈류 측정을 제한.
이러한 방법론의 성공적인 구현에 중요한 주요 단계 중 하나는 전체 촬상 세션 동안 성공적인 수술과 좋은 생리적 조건에서 마취 된 쥐의 유지이다. 이를 위해, 하나의 신중 현미경 챔버의 온도를 제어 및 마취제 매시간 주입한다. 또 다른 중요한 단계는 주사 후 자연적으로 발생할 수있는 내피 안감에 형광 플라즈마 시약의 국제화이다. 이러한 국제화는 해석 불가능한 XT 이미지와 않은 대조 XY 이미지를 생성합니다. 이 현상은 염료의 주입 용량에 따라 달라지며 혈장 시약의 고용량을 (도 4)을 주입함으로써 방지 될 수있다.
중요한 것은, 간 혈류량의 성공적인 생체 내에 현미경 이미징 제를 필요몇 가지 중요한 측면의 전자 고려. 이들은 간 혈관 시스템의 복잡성, 다른 구조 및 기능, 빠르고 느린 플럭스 및 신속한 RBC 속도와 다른 혈액 순환과 크고 작은 혈관을 포함한 혈관의 서로 다른 아형의 존재를 포함한다. 이미지가 3D (xyt)에서 획득 될 때 XT 화상의 분석에 기초 방법론의 주요 한계는, 용기의 수집 및 Z 해상도의 부족의 속도이다. 보다 구체적으로, 표준 시스템의 라인 스캔 속도는 동맥의 경우 매우 높은 RBC 속도, 특징 (180 ㎛의 2 위의 직경) 큰 혈관의 취득과 관련하여 감도의 한계에 도달한다. 큰 용기에서, RBC 궤도 평면으로부터 이미지화 할 수 있고, 스캔 평면에 수직 한 임의의 구성 요소는 분석에서 제외한다.
방법론 제시 시간감수는 생체 내 다양한 병리 적 상태 하에서 여러 혈류 매개 변수의 실시간 정량 이상적인 툴을 나타낸다. 간 혈류 역학의 조사는 특정 기관에서 질병 프로세스 및 기생충 병인 새롭게 조명한다. 리 슈만 편모충 감염 실험 마우스 모델에 적용 간 미세 혈관 시스템에 대한 통찰력을 얻기위한 노력들은 실시간이 장기 기생충 승산 질병 발달 여러 혈류 매개 변수의 상관 관계에 대한 가능성을 열어. 감염시 IVM 의한 간암의 혈관 시스템의 향상된 특성화를위한 시약, 도구의 발전과 방법론은 혈액의 영향에 흘러, 왕복이 생리 학적 파라미터에 기생충 정착의 영향의 연구를 위해 매우 중요하며 슈만 편모충의 병인. 이 전략은 잠재적으로 다른 감염에 확장 될 수있다병원균 간 타겟팅 시스템.
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Acknowledgments
이 연구는 INSERM, 엑스 - 마르세유 대학과 CL 포레스에 의해 얻어진 HFSPO에서 경력 개발의 수상에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
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