Abstract
Microscopia intravital (IVM) é uma técnica de imageamento óptico poderoso que tornou possível a visualização, monitoramento e quantificação de vários eventos biológicos em tempo real e em animais vivos. Esta tecnologia tem avançado muito a nossa compreensão de processos fisiológicos e fenômenos mediada por patógenos em órgãos específicos.
Neste estudo, IVM é aplicada para o fígado do rato e protocolos foram concebidos para a imagem in vivo, o sistema circulatório do fígado e medir glóbulos vermelhos do sangue (RBC) velocidade em vasos hepáticos individuais. Para visualizar os diferentes subtipos dos vasos que caracterizam o órgão hepático e realizar medições da velocidade do fluxo sanguíneo, ratinhos C57BL / 6 são injectados por via intravenosa com um reagente fluorescente de plasma que rotula a vasculatura associada a fígado. IVM permite in vivo, em tempo real, a medição da velocidade de RBC em um vaso de interesse específica. Estabelecer esta metodologia tornará possívelinvestigar a hemodinâmica do fígado, em condições fisiológicas e patológicas. Em última análise, esta metodologia baseada na imagem será importante para o estudo da influência de L. infecção donovani na hemodinâmica hepáticas.
Este método pode ser aplicado a outros modelos infecciosas e órgãos de rato e pode ainda ser alargado para ensaios pré-clínicos do efeito de uma droga sobre a inflamação através da quantificação do seu efeito sobre o fluxo sanguíneo.
Introduction
Hemodinâmica específicos de órgãos são características fisiológicas importantes de qualquer órgão de mamíferos. Anormalidades no fluxo sanguíneo pode ser a consequência de inflamação e um sinal de disfunção de órgãos 1. Assim, o fluxo de sangue organização, estrutura e função de parâmetros aparecem como críticos para análise sob condições fisiológicas e patológicas. As técnicas que têm sido normalmente utilizadas para a análise de fluxo sanguíneo em um órgão específico contêm várias limitações, incluindo o limite de resolução da técnica em si (por exemplo, o Doppler do fluxo de sangue), a capacidade para a medição de fluxo sanguíneo absoluto única (volume de sangue por unidade que serve um órgão) (por exemplo, a tomografia de coerência óptica) ea medição de mudanças médias em velocidade em uma população grande e heterogêneo de vasos sangüíneos 2,3. Sistema circulatório do fígado liga diferentes subtipos de vasos que são heterogêneos em seu tamanho, estrutura e função. Dentroesta tecnologia de imagem estudo, microscopia intravital (IVM) é aplicado para avaliar a hemodinâmica do fígado in vivo, em tempo real, com elevada resolução e em paralelo para descobrir as características dos vasos sanguíneos individuais que formam o órgão hepático. O recente desenvolvimento desta técnica de imagem óptico potente permite ao pesquisador para coletar dados dinâmicos em animais vivendo em uma resolução espacial e temporal alta. Ao permitir a visualização direta e acompanhamento dos processos biológicos específicos e rápidos in vivo em tempo real, IVM fornece uma oportunidade única para que o pesquisador vasos sanguíneos imagem individual e medir e quantificar a velocidade de glóbulos vermelhos de solteiro (RBC) dentro de um especificamente selecionados embarcação hepática.
Neste estudo, nós implementamos a técnica de IVM no fígado do rato para investigar a influência da infecção do mouse pelo parasita Leishmania hepatotrópico sobre a hemodinâmica do fígado. L. donovanié o agente responsável pela leishmaniose visceral, uma doença grave caracterizada por respostas inflamatórias agudas-em-uma patologia crónica e que está presente em vários órgãos, incluindo o baço e o fígado. Num modelo de rato experimental de leishmaniose visceral, a infecção do fígado é auto-resolução enquanto que a infecção do baço é progressiva 4. Estes resultados de infecção por Leishmania em relação aos órgãos individuais são ainda não completamente compreendidas. Investigação de hemodinâmica do fígado e baço em condições patológicas vai lançar uma nova luz sobre as interacções parasita-hospedeiro e patogênese da doença.
Nosso sistema modelo experimental é baseado em expor e imagiologia do fígado de um rato anestesiado que receberam injeção intravenosa de corantes fluorescentes específicos para a rotulagem do intravasculature hepática. O fígado é um órgão favorável para microscopia intra-vital. Depois de realizar uma pequena incision no abdômen, o fígado é suavemente exteriorizada e colocada sobre uma gaze molhada, em seguida, em uma lamela com o objetivo de reduzir quaisquer artefatos de movimento devido à pulsação e respiração. O fígado é então colocado dentro da visão de uma lente do microscópio. Em comparação com o baço e nó de linfa, que exigem a utilização de dois fotões para estudos de microscopia de IVM, a vantagem de o fígado reside na sua arquitectura homogénea 3D / anatomia, que permite o uso de um microscópio confocal convencional, com uma profundidade de penetração máxima de aproximadamente 50 mm, para microscopia intravital imagiologia 5-8.
Este estudo descreve dois métodos de imagem independentes para a medição quantitativa da RBC velocidade e velocidade do fluxo sanguíneo nos vasos sanguíneos individuais. No primeiro método, o fluxo de sangue no fígado é adquirida utilizando um modo de bi-dimensional xy ao longo do tempo. Os dados XYT resultantes são analisados usando o plugin MtrackJ no software livre ImageJ, que permite o rastreamento de individual hemácias ao longo do tempo. No segundo método, um único vaso sanguíneo é seleccionado e a sua correspondente fluxo de sangue é analisada utilizando o modo de varrimento de linha rápida aquisição do microscópio confocal de varredura a laser. O vaso de interesse é digitalizada de alta frequência ao longo do seu eixo central através de uma linha axial. A velocidade do fluxo de sangue é então quantificada com base na diferença de contraste entre eritrócitos não marcados escuras e plasma marcado por fluorescência. As intensidades de fluorescência de glóbulos vermelhos e plasma adquiridos ao longo da linha de varrimento são representados graficamente contra o tempo para obter estrias, os ângulos dos quais são proporcionais às velocidades de um RBC indivíduo.
O objetivo deste artigo é fornecer um método simples e reprodutível para a imagem latente e medir a velocidade do fluxo de sangue dentro dos vasos sanguíneos individuais do fígado e disponibilizar as ferramentas básicas para a realização bem-sucedida da cirurgia rato, IVM e análises quantitativas da velocidade de glóbulos vermelhos individuais. Tsua abordagem permitirá que os investigadores para ganhar novos insights sobre velocidade do sangue em condições patológicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaração de ética: Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos que foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso da Université Aix-Marseille, França animal Institucional. Feminino camundongos C57BL / 6 a 8 - 10 semanas de idade foram comercialmente obtida e manipulada de acordo com as regras do Décret N ° 8 ° 87-848, 19 de outubro, 1987, Paris. Todos os experimentos usando L. donovani parasitas LD1S foram conduzidos de acordo com as normas de biossegurança da legislação francesa e da União Europeia.
1. Rato infecção com L. donovani promastigota Parasitas
- Prepara-se o meio de cultura para manutenção in vitro de L. donovani parasitas promastigotas, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Use meio M199. Suplemento de meio M199 com 10% de soro fetal de vitela (inactivado pelo calor a 56 ° C durante 30 min), 25 mM de HEPES pH 6,9, 12 mM de NaHCO 3, 1 mM de glutamina, RPMI 16040 mistura de vitaminas, 10 mM de ácido fólico, 100 mM de adenosina, hemina 7,6 mM, 50 U / ml de penicilina e 50 mg / ml de estreptomicina.
- Cultura LD1S parasitas em 10 ml de meio M199 completo a 26 ° C num balão ventilado 25cm 2.
- Usando sucessivos passos de centrifugação diferencial, preparar uma população de parasitas promastigotas que são enriquecidos em formas metacíclicas.
- Colher um mid-log cultura parasita fase. Conte com uma hemocytomer. Ressuspender 5 x 10 5 parasitas / ml em 10 ml de meio M199 completo. Crescer a cultura parasita em condições anaeróbias até atingirem a fase estacionária tardia (em cerca de 5-6 dias).
- Girar a cultura LD1S a 1.200 xg durante 10 min a 26 ° C para sedimentar os parasitas não metacíclicos, recuperar o sobrenadante e girá-lo de novo a 2500 xg a 26 ° C durante 10 min.
Nota: Este sedimento final é altamente enriquecido em parasitas promastigotas metacíclicos. - Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS. Retirar uma pequena alíquota para fixação com 25% de glutaraldeído 1/100 v: v e contar parasitas utilizando um hemocitómetro.
- Dilui-se a população de parasitas enriquecido-metacíclica a 1 x 10 7/100 ul em PBS. Injectar o parasita suspensão na veia da cauda de um rato anestesiado (veja abaixo), utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 30 G. Para os animais de controlo, injectar 100 ul de PBS na veia da cauda.
2. Procedimentos Cirúrgicos
- Desinfectar o espaço de trabalho com um spray de desinfectante e biocida todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% durante 30 min.
- Prepara-se uma solução de anestésico, de acordo com o peso do animal, que contém 125 mg / kg de cetamina e 12,5 mg / kg de xilazina diluído em PBS.
- Pesa-se o rato e intraperitoneal injectar a dose apropriada de anestésico usando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 30.
- Mantenha o mouse quente e verifique se o mouse é completamente anestesiaTized por beliscar a almofada do pé antes de prosseguir. Re-injetar uma meia dose da solução anestésica no rato a cada 60 min.
- Raspar o abdome do rato e limpe-o com Vetedine. Fazer uma pequena incisão na pele e musculatura sob a caixa torácica, no lado esquerdo do abdómen.
- Coloque um pedaço de gaze úmida no abdômen logo abaixo da área aberta. Expor o fígado e coloque-o sobre a gaze. Coloque outro pedaço de gaze úmida sobre o fígado.
- Inserir um 24 x 60 mm2 a 150 um de espessura lamela, para uma estrutura de metal, sobre o fígado para visualização sob um microscópio ligado-cianoacrilato.
- Proteger os olhos do rato com uma gaze molhada.
- Após a sessão de imagiologia, o animal anestesiado eutanásia por deslocação cervical.
3. Microscopia intravital Imagem da Arquitetura fígado
- Realizar os experimentos de microscopia intravital em um microscópio confocal invertido equipado com pelocâmara, uma objectiva de imersão 63X glicerol óleo apochromatic (NA 1.4), argônio (488 nm) e HeNe (543 nm, 633 nm) lasers e um diodo azul (405 nm) hermostatic controlada.
- Posicione o mouse no palco do microscópio com a lamela cobrindo o rosto fígado para baixo no objetivo. Ajustar a temperatura da câmara para 29 ° C. Ajuste o foco com o autofluorescência fígado para permitir a visualização dos sinusóides.
- Para visualizar a vascularização, preparar uma solução de 500 ug de BSA-Alexa 647 diluído em 100 ul de PBS, para cada ratinho. Injectar esta solução por via intravenosa na veia da cauda do ratinho anestesiado utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 30 G.
- Para visualizar os núcleos de células do fígado, preparar uma solução de Hoechst 33342 em PBS. Injectar esta solução a 8 mg / kg de rato intraperitonealmente utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 30.
- Use o modo seqüencial normal, a objectiva de imersão 63X eo scanner a 400 Hz para a imagem da hepáticaos núcleos das células e a vasculatura hepática. Ligue a 405 nm diodo azul para Hoechst eo laser de excitação 633 nm para BSA-Alexa 647 excitação. Ligue o laser nm Argon 488 e definir uma banda grande aquisição para visualizar a autofluorescência fígado.
4. Microscopia intravital Imagem do Fígado para medição do fluxo sanguíneo velocidade
- Abra o software LAS do microscópio (LAS-AF espectador Versão 3.1.0 Build 8587). Selecione o modo de scanner de ressonância ao abrir o software microscópio.
- Clique na guia de configuração para definir o hardware. Clique em laser e selecione o laser HeNe 633. Clique em Configurações e selecione 12 bits de resolução.
- Clique no menu de aquisição. Na janela de configurações via o feixe, selecione o 63X objetiva e configurar a potência do laser 633 a 100%. Ative o ganho de sinal e desligar parâmetros definidos selecionando Alexa-633 a partir do menu drop-down PM1-3.
- Na guia adquirem, selecione a aquisição 'XYT'modo. Definir a largura em formato de 1024 x 1024. Selecione a velocidade a 8.000 Hz. Selecione o pinhole de 3 unidades Airy. Selecione um fator de zoom de 3. Não selecione o modo bidirecional.
5. Análise Quantitativa de RBC Velocidade Usando as Imagens XYT (Método 1)
- Clique no ícone 'Live' para visualizar o fluxo de sangue em um modo de viver. Escolha da área de interesse e seleccionar um vaso sanguíneo específico para análise. Defina o vaso de interesse para a posição horizontal, ajustando o "X", "Y" e digitalização de rotação de campo coordenadas no painel de controle USB.
- Pare o modo 'Live' uma vez que o vaso de interesse está definido. Mudar a largura do conjunto formato para 1024 x 256 no modo de aquisição janela, linha média = 1, quadro médio = 1 configuração, selecione "empilha" 150. Clique em 'start' para adquirir imagens.
- Para a análise quantitativa da velocidade RBC usando as imagens "XYT" abrir o software ImageJ. Selecione a 'File'guia em ImageJ, clique em "Abrir" e escolha o arquivo de interesse.
- Vá para o menu "plugin" em ImageJ, selecione LOCI e Bio-importar formatos de opções. Nesta janela, selecione a pilha visualizar parâmetros como 'hyperstack'. Na opção ordem da pilha, selecione a opção: "xyzct". Nota: Isso abre uma janela com toda a série de aquisições.
- Clique em 'Plugins' no menu e selecione a opção ImageJ MTrackJ. Clique no ícone "Adicionar" na pequena janela e clique no RBC para acompanhar. Clique no mesmo RBC em cada seguinte quadro e clique no ícone «medida» para medir a velocidade.
Nota: O arquivo gerado pode ser salvo no formato .exl. - Acompanhe um mínimo de cinco hemácias por navio e analisar um mínimo de três navios individuais do mesmo tamanho.
6. Análise Quantitativa de RBC Velocity usando a linha de xt Imagens (Método 2)
- Clique em 'Live' para visualizar o sangue fbaixo no modo ao vivo. Selecione um vaso sanguíneo específico para análise. Definir o vaso de interesse para a posição horizontal. Pare o modo 'Live' uma vez que o vaso de interesse está definido.
- Selecione o modo de digitalização "xt" e defina o lúmen central do navio selecionado ao longo da linha de varredura. Set largura em formato 1.024 x 512, velocidade = 8.000Hz, linha média = 32, o tempo = 512. Clique em 'start' e adquirir as imagens de linha xt.
- Gerar raias de análise quantitativa de velocidade RBC abrindo o arquivo .lif ea imagem linha xt de interesse abertura. Em software LAS-AF, selecione "experimentos", abra o .lif e selecione a imagem. Nota: Ele vai abrir automaticamente um quimógrafo.
- Medir o tempo (t, obtido no eixo Y) necessária para um traço de partículas (que mostra a reflexão escuro) para percorrer uma determinada distância (d, obtido no eixo X) nesta quimógrafo. Selecione a ferramenta "desenhar linha" e desenhar uma linha horizontal para a raia. Note-se a distância emum e o tempo em segundos gerados em resultado da aba na parte inferior da imagem.
- Calcular a velocidade como V = distância / tempo usando os valores obtidos a partir da quimógrafo.
- Quantificar um mínimo de cinco partículas raias imagem xt e por um mínimo de três navios individuais do mesmo tamanho.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A organização arquitectónico específico dos sinusóides do fígado pode ser visualizado com base na propriedade autofluorescente deste órgão (Figura 1, painel B e C, verde), a injecção intraperitoneal de Hoechst para a rotulagem dos núcleos de hepatócitos (Figura 1B, azul) e a injecção intravenosa de BSA fluorescente para a coloração do sistema circulatório hepática (Figura 1C, vermelho). O fígado é composto por vários subtipos dos vasos diferentes com diferentes funções e estruturas e tamanhos que variam 40-700 uM 2 de diâmetro (D) (D de pequenos vasos situa-se entre 40-80? M 2 e D de vasos grandes é superior a 300 | iM 2 ). Imagiologia microscopia intravital do fígado permite a visualização em alta resolução de heterogeneidade e de complexidade da vasculatura hepática (Figura 1C).
Para monitorar a velocidade do fluxo sanguíneo em vess indivíduoels, duas metodologias diferentes são usados para a aquisição e análise de dados de imagem a um dos vasos sanguíneos do fígado in vivo. No primeiro método, imagens em tempo real do fluxo de sangue num vaso de interesse é realizada utilizando o modo de digitalização XYT (Filme 1). A análise quantitativa da velocidade de um RBC indivíduo num único recipiente é realizada utilizando o plug-in MTrackJ no software ImageJ (Figura 2A e 2B). Um mínimo de cinco partículas por navio é monitorado em diferentes vasos que vão 40-80 mm de diâmetro 2. Os resultados obtidos com este método de dar valores consistentes e reprodutíveis entre diferentes ratinhos e avaliar a velocidade de RBC em pequenos vasos hepáticos em valores entre 25-35 um / seg (Figura 2C).
O segundo método consiste em verificar repetidamente ao longo de uma linha paralela à parede do vaso, com a linha colocada no centro do lúmen do vaso.A Figura 3 mostra uma varredura quadro xy (painéis da esquerda) com a linha xt correspondente varredura (painéis da direita). A velocidade de um RBC indivíduo é dada pelo quociente V = a distância / tempo e é calculada usando as projecções ortogonais sobre o eixo X e Y da raia obtido na imagem xt. Nas Figuras 3D e 3E, cada ponto de dados representa a velocidade de um RBC individuais a partir de diferentes vasos pequenos ou grandes seleccionados a partir de ratos diferentes. Como pode ser visto a partir das barras de erro, os dados mostram uma variação relativamente baixa entre as velocidades de RBC e indicam que a velocidade de fluxo sanguíneo é drasticamente mais rápida do que em grandes vasos em vasos pequenos. Além disso, uma variação significativa entre os valores de velocidade obtidos a partir de diferentes tipos de navios de grande porte foi observada ao passo que a velocidade do fluxo sanguíneo é relativamente semelhantes entre os diferentes tipos de vasos pequenos. As medições de fluxo de sangue com este método mais recente geração de dados que são comparáveis com os dados obtidos a partir da descrevem anteriormenteusando d método MTrackJ (comparar com a figura 2C a Figura 3D). A imagem na Figura 3C representa um exemplo típico de um experimento abaixo do ideal em que a varredura quadro xy gera uma imagem xt un-interpretável. Neste caso particular, o problema resulta de ambas i) a internalização rápida de BSA nas células endoteliais que revestem o vaso de interesse e ii) a presença de uma junção entre dois vasos que perturba o fluxo de sangue na área de aquisição seleccionada. A taxa de internalização do reagente de plasma para o endotélio que revestem os vasos sanguíneos é um parâmetro crítico para considerar quando se medir a velocidade de fluxo de sangue, como internalização irá alterar a qualidade da imagem xt que mostra as estrias. A taxa de internalização depende criticamente a dose do corante que é injectado por via intravenosa. Na Figura 4 mostra-se que 500 ug de BSA-Alexa 647 e / ou 500 kDa de Dextrano-FITC são as doses óptimas que Should ser usado para a quantificação da velocidade de fluxo sanguíneo. Estas doses gerar um sinal muito brilhante que permite a identificação do RBC como partículas escuras contra um fundo brilhante e permitir a visualização do fluxo de sangue por um período mínimo de 1 hora, sem internalização do corante injectada (Figura 4, painel inferior). Em contraste, 50 ug de BSA-Alexa 647 e / ou 500 kDa Dextrano-FITC (não mostrado), ao mesmo tempo permitindo a visualização da rede vascular do fígado, é uma dose sub-óptima para a medição da velocidade do fluxo sanguíneo devido à internalização muito rápido de o corante, que se inicia a 5 min após a injecção (Figura 4, painel inferior).
Quando a aplicação desta metodologia para o fígado de animais infectados, observou-se um aumento significativo na velocidade do fluxo sanguíneo, logo que 1 h pós-infecção. A alteração da velocidade de RBC é mantida até 24 horas pós-infecção. Em última análise, alcançar valores normaisa 72 h pós-injecção parasita (Figura 5). Assim, este experimento valida o uso desta metodologia para ganhar novos insights sobre a influência das condições patológicas na hemodinâmica do fígado.
Figura 1: Microscopia intravital do mouse Fígado (A) a cirurgia do fígado do rato.. Uma pequena área de um lóbulo do fígado é exposto após a cirurgia, duas peças de gaze húmidas são colocados em torno dela e uma lâmina é colocada sobre o abdómen para cobrir o fígado antes do rato ser colocado sobre o palco de um microscópio confocal. (B, C) A imagem de uma área representativa de fígado de um rato não infectado, que demonstra as sinusóides do fígado e os diferentes tamanhos dos vasos que compreendem o órgão hepático. Autofluorescência fígado é mostrado em verde. O mouse é injetado com Hoechst 33342 (azul) para rotular o hnúcleos epatocyte (B) e injectados com BSA-Alexa 647 (vermelho) para visualizar a vasculatura hepática (C). Barras de escala, 50 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Análise Quantitativa de RBC Velocity de uma varredura quadro xy usando o Software ImageJ (A) imagem xy Representante da circulação de sangue em uma pequena embarcação fígado adquirida por imagens de microscopia intravital do fígado do ratinho utilizando o modo de varredura xy rápido. As áreas escuras correspondem à hemácias. Barra de escala, 10 um. (B) Quantificação da velocidade de um único RBC usando o plug-in de MTrackJ ImageJ. Lines (vermelho, amarelo, branco) representam a trajetória ao longo do tempo de um RBC individual. Velocidade (C) RBC em sm indivíduotodos (D é de cerca de 50 um 2) os vasos hepáticos. O gráfico representa graficamente o valor da velocidade de cinco eritrócitos independentes controladas em vasos individuais do fígado que foram seleccionados a partir de cinco murganhos diferente (1 a 5). D representa o diâmetro do vaso em mm 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fígado de fluxo de sangue medições por Microscopia intravital imagem de um vaso sanguíneo usando o modo xt Verificação de linha xy imagens representativos (painéis da esquerda) de vasos do fígado marcadas com BSA-Alexa 647 e suas imagens xt correspondentes (painéis da direita), obtido a partir de um. line-scan do lúmen central de uma embarcação individual. (A, B) pequeno (A) e granderecipiente de fígado (B). (C) Os dados representativos a partir de uma experiência de sub-óptima que mostra a intersecção de dois vasos sanguíneos e BSA a internalização no endotélio. (D, E) Os gráficos mostram o valor da velocidade de três hemácias independentes por navio (pequenas e grandes em D em E) seleccionados de cinco ratos diferentes. D representa o diâmetro do vaso em mm 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. O efeito da dose do plasma corante fluorescente na sua internalização no endotélio Revestimento das sinusóides Esta imagem controla a internalização de BSA e dextrano 500 kDa para o endotélio que revestem os sinusóides, como uma função do tempo e da dose injectada.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeito de L. infecção donovani na hemodinâmica fígado. Este gráfico parcelas os valores da velocidade do sangue obtido a partir de vários vasos sanguíneos individuais a partir de ratinhos não infectados (NI) e ratos que foram infectados com L. donovani e analisados 1 hora, 24 horas e 72 horas pós-infecção (pi). Cada ponto representa o valor médio de cinco medições de velocidade RBC obtido em um vaso sanguíneo único de, aproximadamente, 50 mm 2. Em cada condição (NI, 1 pi h, 24 h e 72 h pi pi) um mínimo de três ratinhos foram analisados para a velocidade do fluxo sanguíneo. As estrelas indicam uma diferença significativa na velocidade do fluxo sanguíneo obtido 1 hora e 24 horas pi comparação com ratinhos NI (P <0,01, de uma forma Anova).
Filme 1. Time-lapse Intravital Microscopia de imagem do rato do fígado. Filme 1 corresponde à Figura 3. O ratinho recebeu uma injeção de BSA-Alexa 647 para visualizar a vasculatura. O fluxo de sangue em três pequenos vasos (D de 50 mm 2) é mostrado. Áreas em preto correspondem a RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O desenvolvimento recente de microscopia intravital do fígado do rato abre novas possibilidades para a investigação da resposta fisiológica à infecção in vivo e em tempo real, 5,9,10. Fluxo sanguíneo de órgãos é um parâmetro fisiológico crítico que é frequentemente alterados em muitas doenças. No entanto, o estado da hemodinâmica hepáticas, sob condições fisiológicas e infecciosas continua a ser uma área pouco explorado. Neste estudo, os métodos baseados em IVM, que foram previamente adaptadas para o estudo do baço e vasculatura do tumor, foram implementados para quantificar a velocidade do fluxo de sangue no fígado dentro de um único recipiente e medir a velocidade do indivíduo RBC in vivo 11,12. As metodologias usadas aqui contar com o contraste entre um fluoróforo plasma injetado por via intravenosa no rato, tal como BSA fluorescente, e os eritrócitos, que continuam a ser escuro. In vivo medições de fluxo de sangue têm o potencial de melhorar a nossa compreensão da doença proprocessos.
Aqui, duas metodologias foram usadas e comparadas para medir o fluxo sanguíneo nos vasos do fígado. A primeira metodologia é demorado e exigente em termos de análise de dados, uma vez que exige que os usuários controlar manualmente movimento RBC em um navio individual usando o plugin MTrackJ no software ImageJ. O segundo método é simples e rápido, uma vez que consiste na análise de uma imagem xt de um vaso sanguíneo gerados a partir de uma linha de aquisição de varrimento com o modo de scanner ressonante. As duas metodologias dar dados comparáveis para os navios semelhantes. Nesta fase é quase impossível comparar nossos dados com os outros, como, a nosso conhecimento, a velocidade do fluxo sanguíneo nunca foi quantificado em tais pequenos vasos e capilares em sinusoid rato com uma largura de aproximadamente 10 mm. Métodos baseados em IVM permitir alta resolução em xy de 500 nm, que permitem a análise de uma sinusóide com uma largura de 10-50 um 13. Em contraste, técnicas baseadas em Doppler só tem um resol máximoution de 70 mm, limitando assim a medição do fluxo de sangue para as artérias e veias hepáticas portal 3.
Um dos principais passos que é fundamental para o sucesso da implementação dessas metodologias é uma cirurgia bem sucedida e manutenção do rato anestesiado em boa condição fisiológica durante toda a sessão de imagem. Para fazê-lo, deve-se controlar cuidadosamente a temperatura da câmara de microscópio e injectar anestésico a cada hora. Um outro passo crucial é a internalização do reagente fluorescente de plasma no forro endotelial que podem ocorrer naturalmente após a sua injecção. Essa internalização irá produzir imagens xt não interpretáveis e imagens xy un-contrastadas. Este fenómeno depende da dose do corante injectado e pode ser prevenida através da injecção de uma dose elevada do reagente de plasma (Figura 4).
Importante, bem sucedido imagem de microscopia intravital do fluxo de sangue do fígado requer the consideração de diversos aspectos críticos. Estes incluem a complexidade do sistema de vasculatura hepática, a presença de diferentes subtipos de vasos sanguíneos contendo pequenas e grandes vasos, com diferentes estruturas e funções diferentes, as circulações de sangue com fluxo rápido e lento e rápidas velocidades de RBC. A principal limitação da metodologia que se baseia na análise de uma imagem de xt é a velocidade de aquisição do navio e a falta de resolução Z, como a imagem é adquirida em 3D (XYT). Mais especificamente, as velocidades de varrimento de linha de sistemas padrão alcançar um limite de sensibilidade no que se refere à aquisição de grandes vasos (diâmetro superior a 2 180 um) que são caracterizados por velocidades muito altas de RBC, o que é o caso com as artérias. Na grande navio, a trajectória de RBC pode estar fora do plano representada por imagem e quaisquer componentes que são perpendiculares ao plano digitalizado serão excluídos da análise.
A metodologia apresentada here representa uma ferramenta ideal para o desenvolvimento in vivo e quantificação de vários parâmetros de fluxo sanguíneo em várias condições patológicas em tempo real. A investigação da hemodinâmica do fígado vai lançar nova luz sobre processos de doenças e parasitas patogênese em um órgão específico. Os nossos esforços para obter insights sobre o sistema microcirculação hepática aplicado a um modelo experimental do rato de infecção por Leishmania abre a possibilidade para a correlação de vários parâmetros de fluxo sanguíneo com a multiplicação do parasita eo desenvolvimento da doença neste órgão, em tempo real. A continuação do desenvolvimento de reagentes, ferramentas e a metodologia para a melhor caracterização dos sistema da vasculatura do fígado por IVM durante a infecção é de grande importância para o estudo da influência da colonização parasita sobre este parâmetro fisiológico e, reciprocamente, a influência do fluxo de sangue em patogênese Leishmania. Esta estratégia pode ser potencialmente alargado a outras doenças infecciosassistemas onde o fígado contra agentes patogénicos alvo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo INSERM, da Universidade de Aix-Marseille e um prêmio de Desenvolvimento de Carreira de HFSPO obtido por CL Forestier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
