Abstract
Прижизненные микроскопии (IVM) является мощной техникой оптических изображений, что сделало возможным визуализацию, мониторинг и количественную оценку различных биологических событий в режиме реального времени, так и в живых животных. Эта технология значительно расширили наше понимание физиологических процессов и патогенных-опосредованной явлений в конкретных органах.
В этом исследовании, IVM применяется для печени мыши и протоколы предназначены для изображения в естественных кровеносную систему печени и измерять эритроцитов (RBC) скорость в отдельных сосудах печени. Для визуализации сосудов различных подтипов, которые характеризуют орган печени и выполнять измерения скорости кровотока, мышей C57BL / 6 внутривенно вводили с флуоресцентным плазмы реагента, который маркирует печени ассоциированных сосудистую. IVM позволяет в естественных условиях, режиме реального времени, измерения скорости РБК в определенном судне интересов. Установление этой методологии сделает возможнымисследовать гемодинамику печени в физиологических и патологических условиях. В конечном счете, эта методология визуализации на основе будет иметь важное значение для изучения влияния L. donovani инфекции на печени гемодинамики.
Этот метод может быть применен к другим инфекционным моделей и органов мышей и может быть продлен до доклинических испытаний эффекта препарата на воспаление путем количественного его влияние на кровоток.
Introduction
Органоспецифические гемодинамики являются важными физиологические особенности любого органа млекопитающих. Нарушения в потоке крови может быть следствием воспаления и знак органной дисфункции 1. Таким образом, кровоток организация, структура и функции появляются, как критические параметры для анализа в физиологических и патологических условиях. Методы, которые были широко используется для анализа потока крови в определенном органе содержит ряд ограничений, в том числе предела разрешения самой методики (например, допплерографии кровотока), емкость для измерения абсолютной кровотока только (объем крови в Блок служит орган) (например, оптической когерентной томографии) и измерение средних изменений в скорости в большом и гетерогенной популяции кровеносных сосудов 2,3. Кровеносная система печени в соединяет различные подтипы сосудов, которые неоднородны по своим размерам, структуре и функции. Вэто исследование, прижизненный микроскопии (IVM) Технология формирования изображения применяется для оценки гемодинамики печени в естественных условиях, в режиме реального времени, с высоким разрешением и параллельно раскрыть характеристики отдельных кровеносных сосудов, которые составляют орган печени. Недавнее развитие этой мощной техники оптической визуализации позволяет исследователю собирать динамические данные на живых животных с высоким пространственным и временным разрешением. Позволяя прямой визуализации и реальную контроль времени конкретных и быстрых биологических процессов в естественных условиях, IVM предоставляет уникальную возможность для исследователя к изображению индивидуальный кровеносных сосудов, и измерить количественно и скорость одиночных красных кровяных клеток (эритроцитов) в течение специально выбран печеночная судно.
В этом исследовании, мы внедрили методику IVM в печень мыши, чтобы исследовать влияние инфекции мыши по гепатотропного Leishmania паразитов на гемодинамики печени. Л. donovaniэто агент, ответственный за висцеральный лейшманиоз, тяжелого заболевания характеризуется острым-на-хронических воспалительных реакций и патологии, который присутствует во многих органах, в том числе селезенки и печени. В экспериментальной модели мыши висцерального лейшманиоза, инфекция печени самостоятельно решения, тогда как селезенки инфекция является прогрессивным 4. Эти результаты Leishmania инфекции по отношению к отдельным органам до сих пор не полностью поняты. Исследование печени и селезенки гемодинамики при патологических условиях прольет новый свет на хост-паразит взаимодействия и патогенеза заболевания.
Наша экспериментальная модель системы на основе выявления и визуализации печень наркозом мыши, которые получили внутривенную инъекцию специальных флуоресцентных красителей для маркировки печеночной intravasculature. Печень является благоприятным органом внутри жизненно микроскопии. После выполнения небольшого incisioп в животе, печени осторожно вовне и размещены на мокрой марлей, затем на покровное с целью сокращения каких-либо артефактов движения в связи с сердцебиение и дыхание. Затем печень помещают в поле зрения микроскопа линзы. По сравнению с селезенки и лимфатического узла, которые требуют использования двух фотонов микроскопии для исследования IVM, преимущество печени заключается в гомогенной 3D архитектура / анатомии, что позволяет использование обычной конфокальной микроскопии, с максимальной глубиной проникновения примерно 50 мкм, для прижизненной микроскопии изображений 5-8.
Это исследование описывает два независимых метода визуализации для количественного измерения скорости РБК и скорости кровотока в отдельных кровеносных сосудов. В первом способе, кровоток печени получены с помощью ху би-мерный режим в течение долгого времени. Полученные данные XYT анализируются с помощью плагина MtrackJ в свободное программное обеспечение ImageJ, которая позволяет для отслеживания IndividUAL эритроциты в течение долгого времени. Во втором способе, одного кровеносного сосуда выбрано и соответствующий поток крови анализировали с использованием строчной развертки в режим быстрой приобретения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии-. Судно интерес сканируется на высокой частоте вдоль своей центральной оси через осевой линии. Скорость кровотока затем количественно на основе разницы в контрасте между немеченого темных эритроцитов и флуоресцентно-меченного плазмы. Интенсивность флуоресценции эритроцитов и плазмы, полученных по линии сканирования приведены на время, чтобы получить полосы, углы которых пропорциональны скоростям индивидуальной РБК.
Цель этой статьи заключается в предоставлении простой и воспроизводимый метод для визуализации и измерения скорости потока крови в пределах отдельных кровеносных сосудов печени и предоставлять основные инструменты для успешного выполнения операции мыши, IVM и количественного анализа скорости отдельные эритроциты. Тего подход позволит исследователям получить новые знания скорости кровотока при патологических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все исследования на животных проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколами, которые были утверждены по уходу и использованию комитета Институциональная животных в Экс-Марсель Université, Франции. Женский мышей C57BL / 6 на 8 - 10 недель были получены в промышленном и обрабатываются в соответствии с правилами декрет N ° 8 87-848, 19 октября, 1987, Париж. Все эксперименты с использованием L. donovani LD1S паразиты были проведены в соответствии с правилами биобезопасности из Франции и Европейского союза законодательства.
1. Мышь Заражение L. donovani промастиготы Паразиты
- Подготовьте питательную среду для поддержания в пробирке L. donovani промастиготы паразиты, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Используйте M199 среду. Дополнение M199 среду с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (инактивированной нагреванием при 56 ° С в течение 30 мин), 25 мМ HEPES рН 6,9, 12 мМ NaHCO 3, 1 мМ Glutamine, RPMI 16040 смесь витаминов, 10 мМ фолиевой кислоты, 100 мМ аденозина, 7,6 мМ гемина, 50 ед / мл пенициллина и 50 мг / мл стрептомицина.
- Культура LD1S паразитов в 10 мл полной среды M199 при 26 ° С в 25 см 2 вентилируемом колбу.
- Использование последовательных дифференциальных шаги центрифугирования, подготовить население промастиготы паразитов, которые обогащены метациклических форм.
- Урожай в середине журнала фазы паразита культуры. Граф на hemocytomer. Ресуспендируют 5 × 10 5 паразитов / мл в 10 мл полной среды M199. Растут паразита культуры в анаэробных условиях, пока они не достигнут конце стационарной фазы (примерно за 5-6 дней).
- Спин LD1S культуру при 1200 х г в течение 10 мин при 26 ° С для осаждения без метациклические паразитов, извлечения супернатанта и вращать его снова при 2500 х г при 26 ° С в течение 10 мин.
Примечание: Этот последний осадок сильно обогащены метациклических промастиготы паразитов. - Ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS. Удалить небольшой аликвоты для фиксации с 25% глутарового альдегида 1/100 по объему и рассчитывать паразитов с помощью гемоцитометра.
- Развести обогащенного метациклических населения паразита до 1 х 10 7/100 мкл PBS в. Вводите паразита суспензии в хвостовую вену мыши наркозом (см ниже), используя 1 мл шприц с иглой 30 G. Для контрольных животных, вводят 100 мкл PBS в хвостовую вену.
2. Хирургические процедуры
- Лечить рабочее пространство с биоцидной спрей дезинфицирующим и все хирургические инструменты с 70% этанола в течение 30 мин.
- Подготовка раствора анестетика, в зависимости от веса животного, содержащий 125 мг / кг кетамина и 12,5 мг / кг ксилазина разбавленный в PBS.
- Взвесить мыши и внутрибрюшинно вводят соответствующую дозу анестетика с использованием 1 мл шприц с иглой 30 G.
- Держите мышь теплой и убедитесь, что мышь полностью anestheквантующих, зажимая ноги площадку перед переходом. Re-вводить половину дозы раствора анестетика в мыши каждые 60 мин.
- Бритье живот мыши и очистите его с Vetedine. Сделать небольшой надрез на коже и мускулатуре при грудной клетки с левой стороны живота.
- Положите кусок влажной марлей на животе чуть ниже открывшемся области. Expose печень и поместить его на марлю. Положите еще один кусок влажной марлей над печени.
- Поместите 24 х 60 мм 2 до 150 мкм толщиной покровное, цианоакрилат связью с металлической рамой, на печень для визуализации под микроскопом.
- Защитите глаза мыши с мокрым марли.
- После сессии изображений, усыпить наркозом животного шейки дислокации.
3. Прижизненные микроскопия Визуализация печени архитектуры
- Провести прижизненной микроскопии эксперименты на перевернутой конфокальной микроскопа, снабженного наhermostatic контролируется камеру, в апохроматические 63x масло глицерин иммерсионный объектив (NA 1.4), аргон (488 нм) и гелий-неоновый (543 нм, 633 нм) лазеров и синий диод (405 нм).
- Наведите на сцене микроскопа с покровным покрывающей лицо печени вниз на цель. Установка температуры в камере до 29 ° С. Отрегулируйте фокусировку с помощью флуоресценции печени, чтобы для визуализации синусоиды.
- Для визуализации сосудистой, приготовить раствор 500 мкг BSA-Alexa 647 разбавленный в 100 мкл PBS, для каждой мыши. Вводят этот раствор внутривенно в хвостовую вену под наркозом мыши с использованием 1 мл шприц с иглой 30 G.
- Для визуализации ядер клеток печени, приготовить раствор Hoechst 33342 в PBS. Вводят этот раствор при дозе 8 мг / кг внутрибрюшинно мыши с использованием 1 мл шприц с иглой 30 G.
- Используйте обычный последовательный режим, иммерсионный объектив 63X и сканер на 400 Гц до изображения печениЯдра клеток и сосудистой печени. Включите нм голубой диод 405 для возбуждения Hoechst и лазера 633 нм для БСА Alexa 647 возбуждения. Включите нм лазера Аргон 488 и определить большую полосу захвата для визуализации флуоресценции печени.
4. Прижизненные микроскопия Визуализация печени для измерения скорости потока крови
- Откройте программное обеспечение LAS микроскопа (ЛАГ-AF просмотра версия 3.1.0 сборка 8587). Выберите режим резонанса сканера при открытии программы микроскопа.
- Перейдите на вкладку конфигурации для установки оборудования. Нажмите на лазера и выберите He-Ne лазер 633. Нажмите на настройки и выберите 12 бит разрешение.
- Нажмите на меню приобретения. В окне настроек тропинка пучка, выберите объективную 63x и настроить мощность лазера 633 до 100%. Активируйте усиления сигнала и от заданных параметров, выбрав Alexa-633 в меню PM1-3 упасть.
- На вкладке приобретают, выберите '' XYT приобретениеРежим. Установите ширину формата в 1024 х 1024. Выберите скорость 8000 Гц. Выберите крошечное отверстие 3 Эйри единиц. Выберите коэффициент масштабирования 3. Не выбирайте режим двунаправленной.
5. Количественный анализ РБК Velocity Использование XYT изображений (метод 1)
- Нажмите на иконку "Live", чтобы визуализировать поток крови на живом режиме. Выберите область интересов и выбрать конкретный кровеносный сосуд для анализа. Установите сосуд интерес в горизонтальное положение путем регулировки 'X', 'Y' и проверки вращения поля координаты на панели управления USB.
- Остановите режим "Live" сразу судно интерес устанавливается. Изменить формат Установить ширину 1024 х 256 в режиме обнаружения окно, линия средний = 1, рамка средний = 1 установку, выберите "складывает" 150. Нажмите на "Пуск", чтобы получать изображения.
- Для количественного анализа скорости РБК Использование "XYT" изображения откройте программное обеспечение ImageJ. Выберите "Файл"Вкладка в ImageJ, нажмите кнопку "Открыть", а затем выбрать интересующий файл.
- Перейти к меню "плагин" в ImageJ, выберите локусов и Био-форматы импорта варианты. В этом окне выберите стек параметры просмотра как «HyperStack". В опции заказа стек, выберите опцию: "xyzct". Примечание: Это открывает окно со всеми сериями приобретений.
- Нажмите на кнопку 'Plugins' в меню ImageJ и выберите опцию MTrackJ. Нажмите на иконку "Добавить" на маленьком окне и нажмите на РБК отслеживать. Нажмите на той же РБК в каждом следующем кадре и нажмите на значок «меры», чтобы измерить скорость.
Примечание: файл, сгенерированный могут быть сохранены в формате .exl. - Трек менее пяти эритроцитов на судно и анализировать как минимум три отдельных сосудов одинакового размера.
6. Количественный анализ РБК Velocity Использование XT Line изображений (Метод 2)
- Нажмите на "Live", чтобы визуализировать крови Fнизкий в режиме реального времени. Выбор конкретного кровеносного сосуда для анализа. Установите сосуд интерес к горизонтальном положении. Остановите режим "Live" сразу судно интерес устанавливается.
- Выберите '' XT режим сканирования и установить центральный просвет выбранного судна вдоль линии сканирования. Установить ширину формата в 1024 х 512, скорость = 8,000Hz, линии среднего = 32, время = 512. Нажмите на "Пуск" и приобрести изображения XT линии.
- Создание полосы для количественного анализа скорости РБК, открыв файл .lif и открытия изображения XT линии интересов. В программном обеспечении ЛАГ-AF, выберите "эксперименты", откройте .lif и выберите изображение. Примечание: Это будет автоматически открывать кимографе.
- Измерьте время (т, полученный на оси Y), необходимое для полосы частиц (показывая темно отражение), чтобы поехать на определенное расстояние (D, полученный на оси X) на этом кимографе. Выберите инструмент "рисовать линию" и проведите линию по горизонтали на полосу. Обратите внимание на расстояние вмкм, а время в секундах, генерируемых в результате вкладки в нижней части изображения.
- Рассчитать скорость как V = расстояние / время, используя значения, полученные из кимографе.
- Количественно минимум пяти частиц полосы на хг изображения и минимум три отдельных судов того же размера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конкретных архитектурная организация синусоид в печени может быть на autofluorescent имущества этого органа (рис 1, панель B и С, зеленый), внутрибрюшинного введения Hoechst для маркировки гепатоцитов ядер визуализируются основе (рис 1B, синий) и внутривенное введение флуоресцентного BSA для окрашивания печеночной системы кровообращения (рис 1С, красный). Печень состоит из нескольких различных подтипов сосуд с различных функций и структур и размерами от 40-700 мкм в диаметре 2 (D) (D мелких сосудов между 40-80 мкм 2 и D крупных сосудов выше 300 мкм 2 ). Прижизненные микроскопия томография печени позволяет для визуализации с высоким разрешением неоднородности и сложности сосудистой печени (рис 1в).
Для контроля скорости кровотока в индивидуальной VessELS, две различные методологии используются для захвата изображений и анализа данных кровеносных сосудов печени в естественных условиях. В первом способе, в режиме реального времени визуализации кровотока в сосуде интереса осуществляется с помощью режима сканирования XYT (Фильм 1). Количественный анализ скорости индивидуального РБК в одном сосуде выполняется с помощью плагина MTrackJ в программном обеспечении ImageJ (2А и 2В). Минимум пять частиц на судно отслеживается в различных судах, начиная от 40-80 мкм 2 диаметром. Результаты, полученные с этого метода дают согласующиеся и воспроизводимые значения через различные мышей и оценить скорость РБК в мелких сосудах печени при значениях между 25-35 мкм / сек (рис 2С).
Второй метод состоит из многократно сканировать вдоль линии, параллельной стенке сосуда, с линии, расположенной в центре просвета сосуда.Рисунок 3 показывает ху кадров сканирование (левые панели) с соответствующим х строчной развертки (справа панели). Скорость отдельной РБК дается соотношение V = расстояние / время, и рассчитывается с использованием ортогональных проекций на X и Y оси полосы, полученной в ХТ изображения. На рисунках 3D и 3Е, каждая точка данных представляет собой скорость отдельного РБК от различных мелких или крупных сосудов, выбранных из различных мышей. Как видно из Столбики ошибок, данные показывают относительно низкую вариацию между RBC и скоростей показывают, что скорость кровотока резко быстрее в больших сосудах, чем в малых судов. Кроме того, значительное изменение значений скорости, полученных от различных видов крупных сосудов наблюдалось, тогда как скорость кровотока сравнительно похожи между различными типами мелких сосудов. Измерения кровотока с этим новый метод генерации данных, что сопоставимо с данными, полученными из ранее описатьд метод с использованием MTrackJ (сравните рис 2С Рисунок 3D). Изображение на рисунке 3C представляет собой типичный пример неоптимальным эксперимента, в котором ху сканирование кадра генерирует не-интерпретируемые XT изображение. В данном конкретном случае, эта проблема возникает в результате как I) быстро интернализации BSA в эндотелиальных клеток, выстилающих сосуд интерес и II) наличие стыке двух сосудов, что возмущает поток крови в выбранной области приобретения. Скорость интернализации плазменной реагента в эндотелии накладки кровеносный сосуд является критическим параметром следует учитывать при измерении скорости кровотока, а интернализации изменит качество изображения ХТ показывает, что полосы. Скорость интернализации в значительной степени зависит от дозы красителя, который вводят внутривенно. На рисунке 4 мы показываем, что 500 мкг BSA-Alexa 647 и / или 500 кДа декстрана-FITC являются оптимальные дозы, что ШоуLD быть использованы для количественной оценки скорости кровотока. Эти дозы генерировать очень светлое сигнал, который позволяет для идентификации эритроцита в виде темных частиц на ярком фоне и включить визуализацию кровотока в течение минимум 1 часа без интернализации впрыскиваемого красителя (фиг.4, нижняя панель). В противоположность этому, 50 мкг BSA-Alexa 647 и / или 500 кДа декстрана-FITC (не показан), при этом возможности для визуализации сосудистой сети печени, является неоптимальным доза для измерения скорости кровотока из-за очень быстрого интернализации краситель, который начинается в 5 мин после инъекции (Рисунок 4, нижняя панель).
При применении этой методики в печени зараженных животных, мы наблюдали значительное увеличение скорости кровотока, как только 1 ч после инфекции. Изменение скорости РБК поддерживается до 24 ч после заражения. Это, в конечном счете достигает нормальных значенийна 72 ч после инъекции паразита (Рисунок 5). Таким образом, этот эксперимент подтверждает использование этой методологии, чтобы получить новые знания в влиянием патологических условий на гемодинамики печени.
Рисунок 1: Прижизненные микроскопия печени мышей () Печень хирургии мыши.. Небольшая площадь в доле печени подвергается после операции, два влажные марлевые части помещены вокруг него и слайд поставить на живот, чтобы покрыть печень до мыши помещаются на сцене конфокальной микроскопии. (B, C) Изображение репрезентативной области печени не-инфицированной мыши, который демонстрирует синусоиды печени и различных размеров судов, которые составляют орган печени. Печень флуоресценции показана на зеленый. Мыши вводили Hoechst 33342 (синий) для обозначения поля часepatocyte ядра (B) и вводили BSA-Alexa 647 (красные) для визуализации сосудистой печени (C). Масштабные бары, 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Количественный анализ РБК скорости от ху рамки сканирования с использованием ImageJ программного обеспечения () Представитель ху образ кровообращения в малом судна печени приобретенного прижизненного микроскопии визуализации печени мыши, используя режим сканирования быстро ху. Темные области соответствуют эритроцитов. Масштаб бар, 10 мкм. (Б) Количественная оценка скорости одного РБК используя плагин MTrackJ от ImageJ. Линии (красный, желтый, белый) представляют собой траекторию с течением времени индивидуального РБК. Скорость (С) РБК в индивидуальном смвсе (D примерно 50 мкм 2) сосуды печени. На графике значение скорости пяти независимых отслеживаемые эритроцитов в отдельных сосудах печени, которые были выбраны из пяти различных мышей (от 1 до 5). D представляет собой диаметр сосуда в мкм 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Измерения печени кровотока по Прижизненное микроскопии изображений кровеносного сосуда, используя режим х строчной развертки Представительства ху изображения (слева панели) судов печени меченных BSA-Alexa 647 и их соответствующих хг изображений (правая панели), полученный из. линия сканирования из центральных просвет отдельного судна. (A, B) Малый () и большойСудно печени (В). (С) Типичные данные субоптимальном эксперимента, показывая пересечение двух кровеносных сосудов и BSA интернализации в эндотелия. (D, E) Графики построить значение скорости трех независимых эритроцитов на судно (малых в D и Е в больших), выбранных из пяти различных мышей. D представляет собой диаметр сосуда в мкм 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Влияние дозы флуоресцентного красителя на плазменном Его интернализации в эндотелия, выстилающих синусоиды Это изображение отслеживает интернализации BSA и декстран 500 кДа в эндотелия, выстилающих синусоиды, в зависимости от времени и дозы впрыска.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Влияние L. donovani инфекции на печени гемодинамики. Этот график участки значений скорости кровотока, полученной из нескольких отдельных кровеносных сосудов от неинфицированных мышей (NI) и мышей, которые были инфицированы L. donovani и проанализированы 1 час, 24 час и 72 ч после заражения (PI). Каждая точка представляет собой среднее значение пяти измерений скорости эритроцитов, полученный в одном кровеносном сосуде приблизительно 50 мкм 2. В каждом состоянии (Н.И., 1 ч пи, пи 24 ч и 72 ч пи) минимум трех мышей были проанализированы на скорости кровотока. Звезды указывают на значительную разницу в скорости потока крови, полученной 1 ч и 24 ч пи по сравнению с мышами NI (Р <0.01, один из способов ANOVA).
Фильм 1. Покадровый микроскопии витальных изображений в печени мышей. Фильм 1 соответствует рис.3. мышь получали инъекцию BSA-Alexa 647 для визуализации сосудов. Кровоток в трех небольших сосудов (D 50 мкм 2) показано. Черные области отвечают РБК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Недавнее развитие прижизненной микроскопии печени мыши открывает новые возможности для исследования физиологической реакции на инфекцию в естественных условиях и в режиме реального времени 5,9,10. Орган кровотока является критическим физиологический параметр, который часто изменяется при многих заболеваниях. Тем не менее, статус гемодинамики печени в физиологических условиях и инфекционных остается плохо изученным. В этом исследовании, методы IVM основе, которые ранее были адаптированы для изучения селезенки и опухоли сосудистой, были реализованы количественно скорость кровотока печени в пределах одного судна и измерения индивидуального скорость РБК в естественных условиях 11,12. Методологии, используемые здесь, полагаются на контрасте между плазменной флюорофора внутривенно в мышь, например, флуоресцентным BSA, и эритроциты, которые остаются темными. В естественных условиях измерения кровотока есть потенциал, чтобы улучшить наше понимание про болезнипроцессы.
Здесь две методики были использованы и по сравнению с измерить кровоток в сосудах печени. Первая методология требует много времени и привередливый в перспективе анализа данных, как это требуется пользователям вручную отслеживать движение РБК в индивидуальном судна, используя плагин MTrackJ в программном обеспечении ImageJ. Вторая методология является простым и быстрым, поскольку она состоит из анализа с хг изображением кровеносного сосуда, генерируемого от покупки строчной развертки с режимом резонансного сканера. Два методологии дают сравнимые данные для аналогичных судов. На этом этапе практически невозможно сравнить наши данные с другими, а, по нашим данным, скорость кровотока никогда не количественно в таких мелких сосудов и капилляров мыши синусоиды с шириной приблизительно 10 мкм. Методы IVM основе позволяют высокое разрешение в ху 500 нм, позволяющих анализ синусоиды с шириной 10-50 мкм 13. В отличие от этого, методы доплеровские основе только иметь максимальную RESOLсоциологическое загрязнение 70 мкм, что ограничивает измерение кровотока в артерии печени и воротной вены 3.
Одним из основных шагов, которые является критическим для успешной реализации этих методик является успешной операции и обслуживание наркозом мыши в хорошем физиологическом состоянии в течение всей сессии изображений. Чтобы сделать это, необходимо тщательно контролировать температуру в камере микроскопа и вводят анестетик, каждый час. Еще одним важным шагом является интернационализация флуоресцентного плазмы реагента в эндотелия накладки, которые могут возникнуть, естественно, после его введения. Такое интернализация будет производить источники бесперебойного XT изображений и ООН-контрастировали ху изображения. Это явление зависит от дозы введенного красителя и может быть предотвращено путем введения высокой дозы плазменного реагента (рисунок 4).
Важно отметить, что успешное прижизненной микроскопии изображений кровотока печени требуется йе рассмотрение нескольких важных аспектах. Они включают в себя сложность системы сосудистой печени, наличие различных подтипов кровеносных сосудов, содержащих малые и большие сосуды с различными структурами и функциями, различных кровообращения с быстрым и медленным потоком и быстрых скоростей РБК. Основным ограничением методологии, основанной на анализе хг изображения скорость приобретения судна и отсутствия резолюции Z, а образ приобрел в 3D (XYT). Более конкретно, линии скорости сканирования стандартных систем достигнет предела чувствительности в связи с приобретением крупных кровеносных сосудов (диаметром более 180 мкм 2), которые характеризуются очень высокими скоростями РБК, что на случай с артерий. В большом сосуде, траектория эритроцитов может быть из распечатанных плоскости и любые компоненты, которые перпендикулярны плоскости сканируемой будут исключены из анализа.
Методология, представленная чпрежде чем представляет собой идеальное средство для в естественных условиях и в реальном времени количественного нескольких параметров кровотока при различных патологических состояниях. Исследование гемодинамики печени прольет новый свет на процессы болезни и паразитов патогенеза конкретного органа. Наши усилия, чтобы получить способность проникновения в суть микрососудов печени системы применительно к экспериментальной модели мыши Leishmania инфекции открывает возможность для корреляции нескольких параметров кровотока с паразитами умножения и развития болезни в этом органе, в режиме реального времени. Дальнейшее развитие реагентов, инструментов и методологии для улучшения характеристик системы сосудистой печени путем IVM во время инфекции имеет большое значение для изучения влияния паразита колонизации на этой физиологического параметра и, взаимно, влияние кровотока на Лейшмания патогенез. Эта стратегия может быть потенциально расширен на другие инфекционныесистемы, где патогены нацелены на печень.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано INSERM, Университет Экс-Марсель и премии развития карьеры от HFSPO полученной CL Форестье.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
