Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) gerçek zamanlı ve canlı hayvan, çeşitli biyolojik olayların görselleştirme, izleme ve miktarının mümkün kıldı güçlü optik görüntüleme tekniğidir. Bu teknoloji çok fizyolojik süreçler ve belirli organlarda patojen-aracılı olayların anlayışımızı ilerlemiştir.
Bu çalışmada, IVM fare karaciğer uygulanır ve protokoller tasarlanmış görüntü, in vivo olarak karaciğer dolaşım sistemi ve tek tek hepatik damarlarda kırmızı kan hücresi (RBC) hızını ölçmek. Hepatik organı karakterize Farklı damar alt tiplerini görselleştirmek ve kan akış hızının ölçümlerini gerçekleştirmek için, C57BL / 6 fareleri, damar, karaciğer ile ilişkili damar etiket bir floresan plazma reaktifi ile enjekte edilir. IVM ilgi belirli bir kap içinde vivo, gerçek zamanlı, RBC hızının ölçümünde sağlar. Bu metodoloji kurulması mümkün hale getirecekfizyolojik ve patolojik koşullar altında karaciğer hemodinamik araştırmak. Sonuçta, bu görüntüleme bazlı metodoloji L. etkisini incelemek için önemli olacaktır Karaciğer hemodinami üzerine donovani enfeksiyonu.
Bu yöntem, diğer enfeksiyöz modelleri ve fare organ uygulanabilir ve daha fazla kan akışı üzerindeki etkisinin nicelenmesiyle enflamasyon ile ilgili bir ilacın etkisinin test klinik öncesi da kapsayacak şekilde genişletilebilir.
Introduction
Organ spesifik hemodinamik herhangi bir memeli organı önemli fizyolojik özellikleri vardır. Kan akımı anormallikler inflamasyon sonucu ve organ disfonksiyonu 1 bir işareti olabilir. Böylece, kan akışı organizasyonu, yapısı ve fonksiyonları fizyolojik ve patolojik koşullar altında analiz gibi kritik parametreleri görünür. genel olarak, belirli bir organa kan akışını analiz etmek için kullanılmıştır teknikleri tekniğin kendi çözünürlük sınırını da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara içeren (örneğin, kan akışının Doppler görüntüleme), her kan sadece (hacim mutlak kan akışının ölçülmesi için kapasite bir organ) (örn optik koherens tomografi) ve kan damarlarının 2,3 geniş ve heterojen nüfus hız ortalama değişikliklerin ölçümü hizmet birimi. karaciğerin dolaşım sistemi kendi büyüklüğü, yapısı ve işlevi heterojen farklı damar alt tiplerini bağlar. IçindeBu çalışmada, intravital mikroskobu (IVM) görüntüleme teknolojisi, yüksek çözünürlükte, gerçek zamanlı, in vivo karaciğer hemodinamiği değerlendirmek için uygulanır ve paralel olarak karaciğer organı oluşturan bireysel kan damarlarının özelliklerini ortaya çıkarmak için. Bu güçlü optik görüntüleme tekniğinin son gelişmeler araştırmacı, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte yaşayan hayvanlar dinamik veri toplamak için izin verir. Doğrudan görselleştirme ve in vivo spesifik ve hızlı biyolojik süreçlerin gerçek zamanlı izleme izin vererek, IVM görüntü bireysel kan damarlarının araştırmacıya eşsiz bir fırsat sunuyor ve ölçmek ve özellikle seçilmiş olan tek kırmızı kan hücrelerinin hızını (RBC) ölçmek hepatik damar.
Bu çalışmada, karaciğer hemodinami hepatotropik Leishmania parazitinin fare enfeksiyon etkisini araştırmak için fare karaciğerinde IVM tekniği hayata geçirdik. L. donovaniviseral leishmaniasis akut-on-kronik inflamatuar tepkileri ile karakterize bir hastalıktır ve dalak ve karaciğer dahil olmak üzere, birden fazla organ, içinde mevcut olan bir patolojiden sorumlu maddedir. Visseral leishmaniasis deneysel fare modelinde, karaciğer enfeksiyonu kendiliğinden çözülmesi dalak enfeksiyonu 4 ilerici ise olduğunu. Hala tam olarak anlaşılamamıştır bireysel organlara göre Leishmania enfeksiyonunun Bu sonuçlar. Patolojik koşullar altında karaciğer ve dalak hemodinaminin incelenmesi konak-parazit etkileşimleri ve hastalık patogenezi üzerine yeni bir ışık tutacaktır.
Bizim deneysel model sistemi maruz bırakılması ve hepatik intravasculature etiketlenmesi için belirli bir floresan boyalar damardan enjekte edildi, bir anestezi uygulanmış fare karaciğer görüntüleme dayanır. Karaciğer içi hayati mikroskopi için olumlu bir organdır. Küçük bir incisio yapıldıktan sonran karın bölgesinde, karaciğer hafifçe dışa ve daha sonra kalp atışı ve solunum nedeniyle herhangi bir hareket eserler azaltılması amacı ile bir lamel, ıslak gazlı bez yerleştirilir. Karaciğer sonra bir mikroskop lenslerin görüş içine yerleştirilmiştir. IVM çalışmaları için, iki foton mikroskopi kullanılmasını gerektirir, dalak ve lenf düğümü ile karşılaştırıldığında, karaciğer avantajı maksimum nüfuz etme derinliği, bilinen bir konfokal mikroskop kullanımı için izin veren homojen bir 3D mimarisi / anatomi yatmaktadır Yaklaşık 50 mikron, intravital mikroskopi görüntüleme 5-8 için.
Bu çalışma, bireysel kan damarlarında RBC hız ve kan akış hızının kantitatif ölçümü için iki bağımsız görüntüleme yöntemleri açıklanır. İlk yöntemde, karaciğer kan akımı zaman içinde xy iki boyutlu bir modu kullanılarak elde edilir. Elde edilen veriler XYT! Tek takibi sağlayan ücretsiz ImageJ yazılımı MtrackJ eklentisi kullanılarak analiz edilirzamanla ual RBCs. İkinci yöntemde ise, tek bir kan damarı seçilir ve karşılık gelen kan akımı konfokal lazer tarama mikroskobu çizgi taraması, hızlı edinim durumuna kullanılarak analiz edilir. ilgi kabı bir eksen hattı boyunca orta ekseni boyunca yüksek frekansta taranır. Kan akış hızı daha sonra, etiketlenmemiş koyu eritrositler ve floresan etiketli plazma arasındaki aksine farka dayanarak ölçülür. çizgi tarama boyunca alınan eritrositler ve plazmanın floresan yoğunlukları çizgiler elde edilmesi için, zamana karşı çizilen, açıları bağımsız bir RBC hızları ile orantılıdır.
Bu makalenin amacı karaciğer bireysel kan damarları içinde görüntüleme için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem ve ölçüm kan akış hızı sağlamak ve fare cerrahisi, IVM ve hızının kantitatif analizleri başarılı bir performans için temel araçları kullanılabilir hale getirmektir Bireysel RBCs. TOnun yaklaşımı araştırmacılar patolojik koşullarda kan hızı yeni bakış açıları kazanmak için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik bildirimi: Tüm hayvan çalışmaları Aix-Marseille Université, Fransa Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi kurallar ve protokoller doğrultusunda yapıldı. 8 dişi C57BL / 6 fareler - eski 10 hafta ticari tarihli kararnamede N ° 8 87-848, 19 Ekim 1987, Paris kurallarına göre elde edilmiş ve ele alınmıştır. L. kullanan tüm deneyler donovani LD1S parazitler Fransız ve Avrupa Birliği mevzuatı gelen biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır.
L. ile 1. Fare Enfeksiyon donovani promastigot Parazitler
- L., in vitro kültür bakım ortamı hazırlayın donovani promastigot parazitler, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- M199 ortamı kullanın. (30 dakika boyunca 56 ° C'de ısı ile inaktive edilmiş),% 10 fetal dana serumu ile M199 ortamı Ek, 25 mM HEPES pH 6.9, 12 mM NaHCO 3, 1 mM gluhistamin RPMI 16040 vitamin karışımı, 10 mM folik asit, 100 mM adenozin, 7.6 mM hemin, 50 U / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin.
- Kültür 25 cm 2 havalandırılmış kap içinde 26 ° C de tam bir M199 medyumu 10 ml parazitleri LD1S.
- Ardışık diferansiyel santrifüj adımları kullanarak, metacyclic formlarda zenginleştirilmiş promastigot parazitlerin nüfusu hazırlamak.
- Bir orta-log faz parazit kültürü hasat. Bir hemocytomer güvenin. Tam M199 medyumu 10 ml 5 x 10 5 parazit / ml yeniden süspanse edin. Onlar (yaklaşık 5-6 gün) geç sabit faz ulaşana kadar anaerobik koşullarda parazit kültürü büyütün.
- Olmayan metacyclic parazitleri topak süpernatantı kurtarmak ve 10 dakika boyunca 26 ° C 'de 2500 xg'de tekrar dönmeye 26 ° C'de 10 dakika boyunca 1200 x g'de LD1S kültürü dönerler.
Not: Bu son derece pelet metacyclic promastigot parazitleri zenginleştirilmiştir. - 1 pelet yeniden süspansePBS 00 ul. V ve hemasitometre kullanarak parazitleri saymak:% 25 glutaraldehit ile 1/100 v sabitleme için küçük bir kısım çıkarın.
- PBS içinde 1 x 10 7/100 ul zenginleştirilmiş-metacyclic parazit nüfusu sulandırmak. Anestezi altında farenin kuyruk venine parazit süspansiyonu enjekte bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile (aşağı bakınız). Kontrol hayvanları için, kuyruk venine 100 ul PBS enjekte edilir.
2. Cerrahi İşlemleri
- 30 dakika boyunca% 70 etanol ile biyosidal dezenfektan sprey ile çalışma alanı ve tüm cerrahi aletler dezenfekte edin.
- 125 mg / kg ketamin ve 12.5 mg / PBS içinde seyreltilmiş ksilazin kg ihtiva eden hayvanın ağırlığına göre, bir anestetik çözelti hazırlayın.
- Fareyi tartılır ve intraperitoneal 30 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak anestezik uygun dozu enjekte.
- Sıcak fare tutun ve fare tamamen anesthe olup olmadığını kontrolDevam etmeden önce ayak pedi kısma tized. Fare her 60 dk içinde anestezik solüsyonun yarım doz yeniden enjekte edilir.
- Farenin karın Tıraş ve Vetedine ile temizleyin. Karnın sol tarafında göğüs kafesinin altında deri ve kas içinde küçük bir kesi yapmak.
- Sadece açılan alanının altındaki karın nemli gazlı bez parçası koyun. Karaciğer Açığa ve gazlı bez üzerine yerleştirin. Karaciğer yukarıda nemli gazlı bez başka bir parça yatıyordu.
- Yeri 24 x 60 mm 2-150 mikron kalınlığında lamel, siyanoakrilat-bağlı bir mikroskop altında görünüm için karaciğer, metal bir çerçeveye.
- Islak bir gazlı bez ile fare gözleri koruyun.
- Görüntüleme seansından sonra, servikal dislokasyon anestezi hayvan euthanize.
Karaciğer Mimarlık 3. intravital Mikroskopi Görüntüleme
- At ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop intravital mikroskopi deneyler yürütmekhermostatic odasını, bir apochromatic 63X petrol gliserol daldırma hedefi (NA 1.4), Argon (488 nm) ve HeNe (543 nm, 633 nm) lazerler ve mavi diyot (405 nm) kontrol edilir.
- Objektif karaciğer yüzü aşağı kaplayan lamel ile mikroskop sahnede fare yerleştirin. 29 ° C odasının sıcaklığı ayarlayın. Sinüzoidler görselleştirilmesi için izin vermek için karaciğer otofloresans kullanarak odağı ayarlayın.
- Damar görselleştirmek için, her bir fare için 100 ul PBS içinde seyreltilmiş 500 ug BSA-Alexa 647 içeren bir çözelti hazırlamak. Bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile anestezi uygulanmış fare kuyruk venine intravenöz, bu çözelti enjekte edilir.
- Karaciğer hücre çekirdekleri görselleştirmek için, PBS içinde Hoechst 33342 içeren bir çözelti hazırlayın. Intraperitonal, bir 30 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile bir fare 8 mg / kg, bu çözelti enjekte edilir.
- Görüntünün hepatik 400 Hz normal sıralı mod, 63X daldırma objektif ve tarayıcıyı kullanınHücre çekirdekleri ve karaciğer damarsal. Hoechst uyarım için 405 nm mavi diyot ve BSA-Alexa 647 uyarma için 633 nm lazer açın. Argon 488 nm lazer açın ve karaciğer otofloresans görselleştirmek için büyük bir kazanım bandı tanımlar.
Kan Akışı Hız Ölçüm Karaciğer 4. intravital Mikroskopi Görüntüleme
- Mikroskobu (LAS-AF görüntüleyici Sürüm 3.1.0 build 8587) LAS yazılımını açın. Mikroskop yazılımını açarken rezonans tarayıcı modunu seçin.
- Donanım ayarlamak için yapılandırma sekmesine tıklayın. Lazer tıklayın ve HeNe 633 lazer seçin. Ayarlarına tıklayın ve 12 bit çözünürlüğü seçin.
- Iktisap menüsüne tıklayın. Işın yolu ayarları penceresinde, objektif 63x seçin ve% 100 633 lazer gücü kurdu. Sinyal kazancı ve PM1-3 açılan menüden Alexa-633 seçerek parametrelerini ayarlamak kapalı etkinleştirin.
- Acquire sekmesinde, 'XYT' edinilmesini seçinmodu. 1024 x 1,024 Set biçim genişliği. 8.000 Hz hızını seçin. 3 Havadar birimlerinin iğne deliği seçin. İki yönlü modunu seçmeyin 3. yakınlaştırma faktörünü seçin.
RBC Hızının 5. Kantitatif Analiz XYT Görüntüleri Kullanma (Yöntem 1)
- Canlı modu kan akışını görselleştirmek için 'Canlı' simgesini tıklayın. Ilgi alanını seçin ve analiz için özel bir kan damarı seçin. USB kontrol panelindeki 'X', 'Y' ve tarama alan rotasyon koordinatlarını ayarlayarak yatay konuma ilgi gemi ayarlayın.
- Ilgi damar ayarlandıktan sonra 'Live' modunu durdurun. Seçeneğini, pencere, çizgi ortalama = 1, çerçeve ortalama = 1 ayarını edinim modunda 1024 x 256 formatında set genişliğini değiştirme görüntüler elde etmek için 'start' üzerinde 150 tıklayınız "yığınlarının".
- Kullanarak RBC hızının kantitatif analiz için "XYT" görüntüleri ImageJ yazılımı açın. 'Dosya' SeçImageJ sekmesini, ardından faiz dosyayı seçin "Aç" düğmesini tıklatın.
- ImageJ "eklentisi" menüsüne gidin, LOCI ve Bio-biçimleri seçeneklerini ithal belirleyin. Bu pencerede, 'hyperstack' gibi parametreleri görüntüleme yığını seçin. "Xyzct": yığın sırası seçeneğinde, seçeneği seçin. Not: Bu satın almalar, tüm serisi ile bir pencere açar.
- ImageJ menüsünde 'Eklentiler' tıklayın ve MTrackJ seçeneği seçin. Küçük pencerede 'eklenti' ikonuna tıklayın ve izlemek için RBC tıklayın. Her aşağıdaki çerçeve içinde aynı RBC tıklayın ve hızını ölçmek için 'tedbir' simgesine tıklayın.
Not: .exl formatında kaydedilebilir oluşturulan dosyayı. - Kap başına beş eritrositlerde az izlemek ve aynı büyüklükte üç ayrı kapların en az analiz eder.
Xt Hattı Görüntüleri Kullanma RBC Hızının 6. Kantitatif Analiz (Yöntem 2)
- Kan f görselleştirmek için 'Canlı' tıklayınCanlı modda düşük. Analizi için, belirli bir kan damarı seçin. Yatay konuma ilgi gemi ayarlayın. Ilgi damar ayarlandıktan sonra 'Live' modunu durdurun.
- 'Xt' tarama modunu seçin ve satır tarama boyunca seçilen teknenin merkez lümeni ayarlayın. Set biçimi genişliği 1024 x 512, hız = 8,000Hz, satır ortalama = 32, 'başlangıç' ve xt hattı görüntü elde zamanı = 512 Click.
- .lif Dosyasını açarak ve ilgi xt hattı görüntüsünü açarak RBC hızının kantitatif analiz için çizgiler oluşturun. LAS-AF yazılımında, "deneyleri" seçeneğini .lif açın ve görüntü seçin. Not: otomatik kymograph açılacaktır.
- Bu kymograph üzerine (X ekseninde elde edilen d) belirli bir mesafe seyahat (koyu yansımasını gösteren) bir parçacık çizgi için gerekli (t, Y ekseninde elde edilir) zamanı ölçün. Aracı "çizgi çizmek" ve çizgi yatay bir çizgi çizin seçin. Uzaklığı Notum ve görüntünün altındaki sonucu sekmesinde oluşturulan saniye zaman.
- Kymograph elde edilen değerleri kullanarak V = mesafe / zaman olarak hız hesaplayın.
- Xt görüntü başına beş parçacık çizgiler bir minimum ve aynı büyüklükte üç ayrı kapların en az ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karaciğerde sinüzoidler özgü mimari organizasyon görüntülendi bu organın (Şekil 1, panel B ve C, yeşil), hepatosit çekirdeğinin etiketleme için Hoechst intraperitoneal enjeksiyonu ve autofluorescent özelliğine dayalı olabilir (Şekil 1B, mavi) ve hepatik kan dolaşımı sistemi (Şekil 1C, kırmızı) boyama için floresan BSA intravenöz enjeksiyonu. çapı 40-700 mikron 2 (D), 300 um 2 üzerinde 2 um ve büyük damarların D 40-80 arasında, karaciğer kadar farklı işlev ve yapılara ve boyutlarda bir çok farklı kap alt tiplerinin oluşmaktadır (küçük damarların D ). Karaciğerin intravital mikroskopi görüntüleme karaciğer damarsal (Şekil 1C) heterojen ve karmaşıklığı yüksek çözünürlükte görünüm sağlar.
Bireysel Vess kan akımı hızı izlemek içinELS iki farklı yöntemler, in vivo olarak, karaciğer, kan damarları görüntü elde etme ve veri analizi için kullanılmıştır. İlk yöntemde, ilgi konusu bir kap içinde kan akışının gerçek zamanlı görüntü XYT tarama modunu (Film 1) kullanılarak gerçekleştirilir. Tek bir kap içinde tek bir RBC hızının kantitatif analizi ImageJ yazılım (Şekil 2A ve 2B) MTrackJ eklentisi kullanarak gerçekleştirilir. Gemi başına beş parçacıkların en az 40-80 mikron 2 ila çapı kadar farklı damarlarda izlenir. Bu yöntemle elde edilen sonuçlar farklı fareler arasında tutarlı ve tekrarlanabilir değerler vermek ve 25-35 mm / sn (Şekil 2C) arasındaki değerlerde küçük karaciğer damarlarında RBC hızı değerlendirir.
İkinci yöntem, sürekli damar lümeninin ortasında yerleştirilmiş bir çizgi ile, damar duvarına paralel bir hat boyunca taranmasını içermektedir.Şekil 3 İlgili xt hattı tarama (sağ paneller) ile bir xy çerçeve taraması (sol panel) gösterir. bağımsız bir RBC hız oranı, V = mesafe / saat olarak verilmektedir ve XT görüntü elde edilen çizgi ve X ve Y ekseni üzerinde dik çıkıntılar kullanılarak hesaplanır. Şekiller 3D ve 3E'de olarak, her bir veri noktası, farklı farelerden seçilen farklı küçük ya da büyük damarlardan bağımsız bir RBC hızını temsil eder. Hata çubukları görüldüğü gibi, veriler RBC hızları arasındaki nispeten düşük bir varyasyon gösterir ve kan akış hızının küçük damarlarda daha büyük damarlarda önemli ölçüde daha hızlı olduğunu göstermektedir. Kan akımı hızı küçük damarların farklı türleri arasında nispeten benzer ise ek olarak, büyük damarların farklı türde elde edilen hız değerlerinde önemli bir değişiklik gözlenmedi. Bu yeni yöntem ile kan akım ölçümleri daha önce tarif elde edilen verilere karşılaştırılabilir veri oluşturmakMTrackJ (3D Şekil Şekil 2C karşılaştırın) kullanarak d yöntemi. Şekil 3C görüntü xy çerçeve taraması un-yorumlanabilir xt görüntüyü oluşturur ki suboptimal deney tipik bir örneğini temsil etmektedir. Bu özel durumda, sorun çıkar gemi döşeyen endotel hücrelerine BSA hızlı içselleştirilmesi) hem i kaynaklanan ve ii) edinimi seçilen bölgedeki kan akışını bozan iki damar arasındaki bir kavşakta bulunması. kan damarı astar endoteli içine plazma reaktif içselleştirme oranı kan akımı hızı ölçerken içselleştirme çizgileri gösteren xt görüntü kalitesini değiştirecek şekilde, göz önünde kritik bir parametredir. içselleştirme oranı kritik intravenöz enjekte edilir boya doza bağlıdır. Şekil 4'te 500 BSA-Alexa 647 ve / veya dekstran FITC 500 kDa'lık ug shou optimal doz olduğunu göstermektedirLD, kan akış hızının ölçümü için kullanılabilir. Bu dozlar, bir parlak arka plana karşı koyu parçacıklar olarak RBC'nin belirlenmesine izin veren bir çok parlak sinyali üretmek ve enjekte edilen boya (Şekil 4, alt panel) içselleştirme olmayan 1 saat en az kan akışının görselleştirme sağlar. Bunun aksine, 50 BSA-Alexa 647 ve / veya 500 kDa Dekstran-FITC (gösterilmemiş olan) ug, karaciğerin damar ağının görüntülenmesi için izin verirken nedeniyle çok hızlı içselleştirme kan akış hızının ölçülmesi için bir optimal-altı dozdur 5 dk enjeksiyon sonrası başlar boya, (Şekil 4, alt panel).
Enfekte hayvanların karaciğer bu metodoloji uygularken, biz en kısa sürede 1 saat sonrası enfeksiyon gibi kan akış hızı belirgin bir artış gözlenmiştir. RBC hızının Değişim 24 saat sonrası enfeksiyon kadar muhafaza edilir. Bu sonuçta normal değerlere ulaştığında72 saat sonrası parazit enjeksiyon ile (Şekil 5). Böylece, bu deney karaciğer hemodinami patolojik durumların etkisiyle yeni anlayışlar kazanmak için bu yöntemin kullanımını doğrular.
Şekil 1: Fare Karaciğer intravital Mikroskopi fare (A) Karaciğer cerrahisi.. Bir karaciğer lobunun küçük bir alanda ameliyattan sonra, iki nemli gazlı bez parçaları etrafında yerleştirilir ve bir slayt konfokal mikroskop sahnede konuyor fare önce karaciğer kapsayacak şekilde karın alınır maruz kalmaktadır. Karaciğer sinüzoidlerde ve karaciğer organı oluşturan gemilerin farklı boyutlarda gösteren bir sivil enfekte fare karaciğer temsili bir alan (B, C) Görüntü. Karaciğer otofloresansı yeşil gösterilir. Fare Hoechst 33.342 (mavi) h etiketlemek için enjekte edilirepatocyte çekirdekleri (B) ve BSA-Alexa 647 (kırmızı) enjekte karaciğer damarsal (C) görselleştirmek için. Ölçek bar, 50 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Hızlı xy tarama modunu kullanarak fare karaciğer intravital mikroskopi görüntüleme edinilen küçük karaciğer kabında kan dolaşımının ImageJ Yazılımı kullanarak bir xy Çerçeve Tara RBC Hızının Kantitatif Analiz (A) Temsilcisi xy görüntüsü. Karanlık alanlar eritrosit karşılık gelmektedir. Ölçek çubuğu, 10 mikron. ImageJ gelen MTrackJ eklentisi kullanarak tek bir RBC hızının (B) miktarının belirlenmesi. Çizgiler (kırmızı, sarı, beyaz) bir birey RBC zamanla yörüngesini temsil etmektedir. Bireysel sm (C) RBC hızıTüm hepatik damarlar (D yaklaşık 50 mikron 2). Grafik beş farklı farelerde (1-5) arasından seçilen tek tek karaciğer damarlarının izlenen beş bağımsız eritrositlerde hızının değerini çizer. D mikron 2 geminin çapını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: xt Hattı Tarama Modu kullanarak Kan Gemi Intravital Mikroskopi Görüntüleme tarafından Karaciğer Kan Akışı Ölçümleri BSA-Alexa 647 ve bunlara karşılık gelen xt görüntüleri (sağ paneller) ile işaretlenmiş karaciğer damarlarının Temsilcisi xy görüntüleri (sol panel) bir elde. Tek bir damarın merkez lümen hat-tarama. (A, B) küçük (A) ve büyükKaraciğer damar (B). (C), endotel İki kan damarlarının ve birbirine BSA içselleştirme gösteren bir optimal-altı deneyden Örnek verileri. (D, E) grafikleri beş farklı farelerden seçilen (E D, küçük ve büyük) kap başına üç bağımsız eritrositlerde hızının değerini çizilir. D mikron 2 geminin çapını gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Sinüzoidler Astar Endotelinin ile oluşturduğu interne Floresan Plazma Dye dozunun etkisi Bu görüntü zaman ve enjeksiyon dozun bir fonksiyonu olarak, sinüzoidlerde astar endotel içine BSA ve Dekstran 500 kDa'lık içselleşmesini izler.Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: L. Etkisi Karaciğer Hemodinami donovani enfeksiyonu. L. ile enfekte edilmiştir Bu grafiği, enfekte olmayan fareler (NI) için birkaç ayrı kan damarlarından elde edilen kan hızı değerleri ve fareler donovani ve 1 saat, 24 saat ve 72 saat sonrası enfeksiyon (pi) analiz. Her nokta, yaklaşık 50 um 2 tek bir kan damarı içinde elde edilen, beş RBC hız ölçümleri arasında ortalama değeri temsil eder. Her iki durumda da (Nı, 1 saat pi, 24 saat ve 72 saat pi pi), üç fareden oluşan bir az kan akışı hızı için analiz edilmiştir. yıldız edilen kan akım hızı önemli bir fark göstermektedir 1 saat ve NI farelere kıyasla 24 saat pi (p <0.01, tek yönlü Anova).
Film Fare Karaciğer. Movie 1 1. Time-lapse intravital Mikroskopi Görüntüleme Şekil 3 karşılık gelir. fare damarsal görselleştirmek için BSA-Alexa 647 enjeksiyonu aldı. Üç küçük damarlarda (50 um 2 D) Kan akımı gösterilir. Siyah alanlar RBC karşılık gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fare karaciğer intravital mikroskopi son gelişme in vivo ve gerçek zamanlı 5,9,10 enfeksiyona fizyolojik yanıtın araştırılması için yeni olanaklar açar. Organ kan akışı, genellikle pek çok hastalıkta değiştirilmiş bir kritik fizyolojik bir parametredir. Ancak, fizyolojik ve enfeksiyon koşullar altında karaciğer hemodinamiklerin durumu kötü keşfedilmeyi alan kalır. Bu çalışmada, daha önce dalak ve tümör damar sisteminin çalışması için adapte edilmiştir IVM-bazlı yöntemler, tek bir kap içinde, karaciğer, kan akış hızını ölçmek ve in vivo 11,12 bireysel RBC hızını ölçmek için uygulanmıştır. Burada kullanılan metodolojileri gibi floresan BSA olarak, fare damar içine enjekte plazma flüorofora arasındaki kontrast güveniyor, ve eritrositler, karanlık kaldığı. in vivo kan akımı ölçümleri hastalık pro anlayışımızı geliştirmek için potansiyele sahiptirsüreçlerle.
Burada, iki yöntem kullanılmış ve karaciğer damarlarındaki kan akışını ölçmek için karşılaştırılmıştır. manuel ImageJ yazılımı MTrackJ eklentisi kullanarak bireysel bir kap içinde RBC hareketini izlemek için kullanıcıların gerektirir ilk metodoloji zaman alıcı ve veri analizi vadede titiz. Bu rezonans tarayıcı modu ile bir çizgi tarama alımından oluşan bir kan damarının bir xt görüntü analizi oluşmaktadır ikinci metodoloji, çok kolay ve hızlı. İki metodolojisi benzer gemileri için karşılaştırılabilir veri verir. Bildiğimiz kadarıyla, kan akım hızı yaklaşık 10 mikron genişliğinde gibi küçük damarlarda ve fare sinüzoit kılcal sayısal olmamıştı bu aşamada, başkaları ile verileri karşılaştırmak için neredeyse imkansızdır. IVM tabanlı yöntemler 10-50 um, 13 bir genişliğe sahip bir sinüzoit analizi sağlayan 500 nm xy yüksek çözünürlük sağlar. Buna karşılık, Doppler tabanlı teknikler sadece maksimal resol var70 um Katkı böylece karaciğer arter ve portal damarları 3 kan akışının ölçümü sınırlandırılması.
Bu yöntemlerin başarılı bir şekilde uygulanması için kritik olan temel adımlardan biri, tüm görüntüleme oturumu sırasında başarılı bir ameliyat ve iyi fizyolojik durumda anestezi fare bakımıdır. Bunu yapmak için, bir dikkatle mikroskop odasının sıcaklığı kontrol ve anestezik her saat enjekte gerekir. Başka kritik adım, enjeksiyondan sonra doğal oluşabilir endotel astar içine floresan plazma reaktif içselleştirilmesi olduğunu. Böyle içselleştirilmesi uninterpretable xt görüntüleri ve un-kontrastlı xy görüntüler üretecektir. Bu olgu, enjekte boya dozuna bağlıdır ve plazma reaktifi yüksek bir doz (Şekil 4) enjekte edilmesiyle önlenebilir.
Önemli olarak, karaciğer kan akışının başarılı İntra vital mikroskopik görüntüleme th gerektirirpek çok kritik yönleri dikkate e. Bunlar, karaciğer damarsal sisteminin karmaşıklığı, farklı yapı ve işlevleri, hızlı ve yavaş akı ve hızlı eritrosit hızları farklı kan tirajlı küçük ve büyük damarları içeren kan damarlarının farklı alt tiplerinin varlığı bulunmaktadır. Görüntü 3D (XYT) elde edilir gibi xt görüntü analizine dayalı yöntemin ana sınırlama, geminin satın alınması ve Z çözünürlüğü eksikliği hızıdır. Daha spesifik olarak, standart sistemlerin çizgi tarama hızları arterler olduğu çok yüksek RBC hızları ile karakterize edilir (180 mikron 2 yukarıdaki çap) büyük kan damarlarının edinimi konusunda hassasiyet sınırına ulaşması. Büyük bir kapta, RBC yörünge görüntülü düzlemin dışında olabilir ve taranan düzleme dik olan herhangi bileşenler analizi dışında tutulacaktır.
metodoloji sunulan here in vivo ve çeşitli patolojik koşullarda çeşitli kan akımı parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümü için ideal bir araç temsil eder. Karaciğer hemodinami soruşturma belli bir organda hastalık süreçleri ve parazit patogenezi üzerine yeni bir ışık tutacaktır. Leishmania enfeksiyonunun deneysel fare modeli uygulanan karaciğer mikrovasküler sistemi içine anlayışlar kazanmak için çalışmalarımız gerçek zamanlı olarak bu organda parazit çarpma ve hastalık gelişimi ile çeşitli kan akımı parametrelerinin korelasyon, olasılığını açılır. enfeksiyon sırasında IVM ile karaciğer damarsal sisteminin geliştirilmiş karakterizasyonu için ayıraç, araçların daha da geliştirilmesi ve metodoloji kanın etkisi üzerine akış, karşılıklı, bu fizyolojik parametre üzerinde parazit sömürgeciliğin etkisi çalışma için büyük önem taşımaktadır ve Leishmania patogenezi. Bu strateji, potansiyel olarak diğer enfeksiyöz uzatılabilirpatojenler karaciğer hedef sistemler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma INSERM, Aix-Marseille Üniversitesi ve CL Forestier ile elde edilen HFSPO bir Kariyer Geliştirme Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
