Abstract
Microscopie intravitale (IVM) est une technique d'imagerie optique puissant qui a rendu possible la visualisation, la surveillance et la quantification des différents événements biologiques en temps réel et dans les animaux vivants. Cette technologie a considérablement fait progresser notre compréhension des processus physiologiques et les phénomènes de micro-organismes pathogènes médiation dans les organes spécifiques.
Dans cette étude, IVM est appliquée sur le foie de la souris et les protocoles sont conçus pour l'image in vivo du système circulatoire du foie et mesurer des globules rouges (RBC) à vitesse vaisseaux hépatiques individuels. Pour visualiser les différents sous-types de navires qui caractérisent l'organe hépatique et effectuer des mesures de vitesse d'écoulement du sang, C57BL / 6 souris sont injectées par voie intraveineuse avec un réactif de plasma fluorescent qui marque le système vasculaire du foie associée. IVM permet in vivo, en temps réel, la mesure de la vitesse de RBC dans un récipient d'intérêt spécifique. L'établissement de cette méthode, il sera possible deenquêter sur l'hémodynamique du foie dans des conditions physiologiques et pathologiques. En fin de compte, cette méthodologie basée imagerie sera important pour l'étude de l'influence de L. infection donovani sur l'hémodynamique hépatiques.
Cette méthode peut être appliquée à d'autres modèles infectieuses et des organes de la souris et peut être étendu à une pré-clinique essais de l'effet d'un médicament sur l'inflammation par quantification de son effet sur le flux sanguin.
Introduction
Hémodynamique spécifiques d'organes sont des caractéristiques physiologiques importants de tout organe d'un mammifère. Des anomalies dans la circulation sanguine peuvent être la conséquence de l'inflammation et un signe de dysfonctionnement des organes 1. Ainsi, le flux sanguin organisation, la structure et la fonction apparaissent paramètres critiques pour l'analyse dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les techniques qui ont été couramment utilisés pour l'analyse de la circulation sanguine dans un organe spécifique contiennent plusieurs limitations, y compris la limite de résolution de la technique elle-même (par exemple, l'imagerie Doppler du flux sanguin), la capacité de mesure du absolu flux sanguin seulement (volume de sang par unité servant un organe) (par exemple tomographie par cohérence optique) et la mesure du taux de changement de vitesse dans une population nombreuse et hétérogène de vaisseaux sanguins 2,3. Le système circulatoire du foie relie différents sous-types de navires qui sont hétérogènes dans leur taille, la structure et la fonction. Danscette étude, la microscopie intravitale (IVM) la technologie d'imagerie est appliquée pour évaluer l'hémodynamique du foie in vivo, en temps réel, à haute résolution et en parallèle pour découvrir les caractéristiques des vaisseaux sanguins individuels qui composent l'organe hépatique. Le développement récent de cette technique d'imagerie optique puissant permet au chercheur de collecter des données dynamique sur des animaux vivants à une résolution spatiale et temporelle. En permettant la visualisation directe et surveillance en temps réel des processus biologiques spécifiques et rapides in vivo, IVM offre une occasion unique pour le chercheur aux vaisseaux sanguins individuels d'image, et de mesurer et de quantifier la vitesse des globules rouges simples (RBC) dans un spécialement sélectionnés navire hépatique.
Dans cette étude, nous avons mis en œuvre la technique IVM dans le foie de souris pour étudier l'influence de l'infection de la souris par le parasite Leishmania hépatotrope sur l'hémodynamique du foie. L. donovaniest l'agent responsable de la leishmaniose viscérale, une maladie grave caractérisée par des réponses inflammatoires aiguës-on-chronique et une pathologie qui est présent dans de multiples organes, y compris la rate et le foie. Dans un modèle expérimental chez la souris de la leishmaniose viscérale, l'infection du foie est auto-résoudre alors que l'infection de la rate est progressive 4. Ces résultats d'infection Leishmania à l'égard des organes individuels ne sont pas encore complètement compris. Enquête de foie et la rate hémodynamique dans des conditions pathologiques va apporter un nouvel éclairage sur les interactions hôte-parasite et la pathogenèse de la maladie.
Notre système de modèle expérimental est basé sur l'exposition et l'imagerie du foie d'une souris anesthésiée qui a reçu une injection intraveineuse de colorants fluorescents spécifiques pour l'étiquetage de la intravasculature hépatique. Le foie est un organe favorable pour la microscopie intra-vital. Après avoir effectué un petit incision dans l'abdomen, le foie est extériorisé doucement et placé sur de la gaze humide, puis sur une lamelle avec l'objectif de réduire les artefacts de mouvement en raison de rythme cardiaque et la respiration. Le foie est ensuite placé à l'intérieur de la vue d'un objectif de microscope. Par rapport au noeud de la rate et de la lymphe qui nécessitent l'utilisation de deux microscopie photonique pour les études IVM, l'avantage du foie réside dans son architecture 3D homogène / anatomie qui permet l'utilisation d'un microscope confocal classique, avec une profondeur de pénétration maximum de environ 50 um, par imagerie par microscopie intravitale 5-8.
Cette étude décrit deux méthodes d'imagerie indépendantes pour la mesure quantitative de RBC vitesse et la vitesse du flux sanguin dans les vaisseaux sanguins individuels. Dans la première méthode, le débit sanguin hépatique est acquise en utilisant un mode bidimensionnel xy dans le temps. Les données de XYT en découlant sont analysés en utilisant le plugin MtrackJ dans le logiciel ImageJ libre, qui permet le suivi des individuel globules rouges dans le temps. Dans la seconde méthode, un seul vaisseau sanguin est sélectionné et son flux sanguin correspondant est analysée en utilisant le mode de balayage ligne de la confocal à balayage laser microscope acquisition rapide. Le navire d'intérêt est numérisé à haute fréquence le long de son axe central par le biais d'une ligne axiale. La vitesse d'écoulement du sang est ensuite quantifié sur la base de la différence de contraste entre les érythrocytes et le plasma sombres non marquées marqué par fluorescence. Les intensités de fluorescence des globules rouges et le plasma acquises le long de la ligne de balayage sont en fonction du temps pour obtenir des stries, dont les angles sont proportionnels aux vitesses d'un RBC individu.
Le but de cet article est de fournir une méthode simple et reproductible pour l'imagerie et mesure de la vitesse du flux sanguin dans les différents vaisseaux sanguins du foie et de mettre à disposition les outils de base pour l'exécution réussie de la chirurgie de la souris, l'IVM et des analyses quantitatives de la vitesse de globules rouges individuels. Tson approche permettra aux chercheurs d'acquérir de nouvelles connaissances dans la vitesse du sang dans des conditions pathologiques.
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Protocol
Déclaration éthique: Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et protocoles qui ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université d'Aix-Marseille, France. Femme C57BL / 6 à 8 - 10 semaines d'âge ont été commercialement obtenue et traitée conformément aux règles du Décret N ° 87-848 8, le 19 Octobre 1987, Paris. Toutes les expériences utilisant L. parasites donovani LD1S ont été menées conformément à la réglementation en matière de biosécurité de la législation française et l'Union européenne.
1. Infection de souris avec L. donovani Promastigote parasites
- Préparation du milieu de culture in vitro pour le maintien de L. donovani parasites promastigotes, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D).
- Utilisez milieu M199. Supplément milieu M199 avec 10% de sérum de veau foetal (inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min), 25 mM HEPES pH 6,9, 12 mM NaHCO 3, 1 mM glutamine, 16,040 RPMI mélange de vitamines, l'acide folique 10 mM, 100 mM d'adénosine, 7,6 mM d'hémine, 50 U / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine.
- Culture LD1S parasites dans 10 ml de milieu complet M199 à 26 ° C dans un ballon de 25 cm 2 ventilé.
- Utilisation étapes de centrifugation différentielle successives, préparer une population de parasites promastigotes qui sont enrichies en formes métacycliques.
- Récolter une culture de phase parasite mi-journal. Comptez sur un hemocytomer. Remettre en suspension 5 x 10 5 parasites / ml dans 10 ml de milieu complet M199. Cultiver la culture du parasite dans des conditions anaérobies jusqu'à ce qu'ils atteignent la phase stationnaire tardive (dans environ 5-6 jours).
- Faites tourner la culture LD1S à 1200 g pendant 10 min à 26 ° C pour sédimenter les parasites non-métacycliques, récupérer le surnageant et tourner de nouveau à 2500 g à 26 ° C pendant 10 min.
Remarque: Ce culot final est fortement enrichie en parasites promastigotes métacycliques. - Reprendre le culot dans 100 ul de PBS. Retirer une petite aliquote de fixation avec 25% de glutaraldéhyde 1/100 v: v et compter les parasites en utilisant un hémocytomètre.
- Diluer la population de parasites enrichi en métacyclique à 1 x 10 7/100 ul dans du PBS. Injecter la suspension du parasite dans la veine de la queue d'une souris anesthésiée (voir ci-dessous) en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 30 G. Pour les animaux de contrôle, d'injecter 100 pi de PBS dans la veine de la queue.
2. Interventions chirurgicales
- Désinfecter l'espace de travail avec un spray désinfectant biocide et tous les instruments chirurgicaux avec 70% d'éthanol pendant 30 min.
- Préparer une solution anesthésique, en fonction du poids de l'animal, contenant 125 mg / kg de kétamine et 12,5 mg / kg de xylazine dilué dans du PBS.
- Peser la souris et par voie intrapéritonéale injecter la dose appropriée d'anesthésique en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G.
- Garder la souris chaude et vérifiez que la souris est complètement anestheacquisition amorti en pinçant le coussinet plantaire avant de poursuivre. Re-injecter une dose de moitié de la solution anesthésique chez la souris toutes les 60 min.
- Raser l'abdomen de la souris et nettoyez-le avec Vetedine. Faire une petite incision dans la peau et la musculature sous la cage thoracique du côté gauche de l'abdomen.
- Placez un morceau de gaze humide sur l'abdomen juste en dessous de la zone ouverte. Exposer le foie et le placer sur la gaze. Disposez un autre morceau de gaze humide du foie.
- Placer un 24 x 60 mm 2 à 150 um d'épaisseur lamelle, cyanoacrylate lié à une structure métallique, sur le foie pour la visualisation au microscope.
- Protégez les yeux de la souris avec une gaze humide.
- Après la session d'imagerie, euthanasier l'animal anesthésié par dislocation cervicale.
3. Microscopie intravitale imagerie du foie de l'Architecture
- Effectuer les expériences de microscopie intravitale sur un microscope confocal inversé équipé d'auhermostatic contrôlée chambre, un 63X glycérol d'huile immersion objectif apochromatique (NA 1.4), Argon (488 nm) et HeNe (543 nm, 633 nm) et une diode laser bleu (405 nm).
- Placez la souris sur la scène du microscope avec la lamelle couvrant le visage du foie vers le bas sur l'objectif. Réglez la température de la chambre à 29 ° C. Réglez la mise au point avec l'autofluorescence du foie pour permettre la visualisation des sinusoïdes.
- Pour visualiser le système vasculaire, préparer une solution de 500 ug de BSA-Alexa 647 dilué dans 100 ul de PBS, pour chaque souris. Injecter cette solution par voie intraveineuse dans la veine caudale de la souris sous anesthésie en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G.
- Pour visualiser les cellules des noyaux du foie, préparer une solution de Hoechst 33342 dans du PBS. Injecter cette solution à 8 mg / kg par voie intraperitoneale de souris en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 30 G.
- Utilisez le mode séquentiel normal, l'objectif à immersion 63X et le scanner à 400 Hz à l'image de la hépatiqueles noyaux des cellules et le système vasculaire du foie. Tournez sur la diode bleue 405 nm pour Hoechst excitation et le laser de 633 nm pour BSA-Alexa 647 excitation. Allumez le laser à argon 488 nm et de définir une large bande d'acquisition de visualiser l'autofluorescence du foie.
4. Microscopie intravitale imagerie du foie pour la mesure de vitesse de débit sanguin
- Ouvrez le logiciel LAS du microscope (LAS-AF spectateur version 3.1.0 build 8587). Sélectionnez le mode de scanner à résonance lors de l'ouverture du logiciel de microscope.
- Cliquez sur l'onglet de configuration pour définir le matériel. Cliquez sur le laser et sélectionnez le laser HeNe 633. Cliquez sur paramètres et sélectionner la résolution 12 bits.
- Cliquez sur le menu d'acquisition. Dans la fenêtre des paramètres de la voie de faisceau, sélectionnez l'objectif 63X et mettre en place la puissance laser 633 à 100%. Activer le gain du signal et désactiver des paramètres de réglage en sélectionnant Alexa-633 dans le menu déroulant PM1-3.
- Dans l'onglet acquérir, sélectionnez l'acquisition 'XYT'Mode. Réglez largeur du format au 1024 x 1024. Sélectionnez la vitesse à 8000 Hz. Sélectionnez le sténopé de 3 unités Airy. Sélectionnez un facteur de zoom de 3. Ne pas sélectionner le mode bidirectionnel.
5. Analyse quantitative de RBC vitesse en utilisant les XYT Images (Méthode 1)
- Cliquez sur l'icône 'Live' pour visualiser le flux sanguin sur un mode direct. Choisissez la zone d'intérêt et sélectionnez un vaisseau sanguin spécifique pour analyse. Réglez le navire d'intérêt à la position horizontale en ajustant le 'X', 'Y' et de rotation de terrain coordonnées de numérisation sur le panneau de contrôle USB.
- Arrêtez le mode «Live» une fois que le navire d'intérêt est fixé. Modifiez le format ensemble largeur 1024 x 256 en mode d'acquisition fenêtre, line average = 1, moyenne de cadre = 1 réglage, sélectionnez "piles" 150. Cliquez sur «start» pour acquérir des images.
- Pour l'analyse quantitative de la vitesse RBC en utilisant les images "XYT" ouvrent le logiciel ImageJ. Sélectionnez le "Fichier"onglet dans ImageJ, cliquez sur «Ouvrir» puis choisissez le fichier d'intérêt.
- Allez dans le menu "plugin" dans ImageJ, sélectionnez LOCI et bio-formats importer options. Dans cette fenêtre, sélectionnez la pile de visualisation des paramètres comme «HyperStack '. Dans l'option d'ordre de superposition, sélectionnez l'option: "xyzct". Note: Ceci ouvre une fenêtre avec toute la série d'acquisitions.
- Cliquez sur "Plugins" dans le menu et sélectionner l'option ImageJ MTrackJ. Cliquez sur l'icône «add» sur la petite fenêtre et cliquez sur le RBC à suivre. Cliquez sur le même RBC dans chaque trame suivante et cliquez sur l'icône «mesure» pour mesurer la vitesse.
Remarque: Le fichier généré peut être enregistré au format .EXL. - Suivre un minimum de cinq globules rouges par navire et d'analyser un minimum de trois navires individuels de la même taille.
6. Analyse quantitative de RBC vitesse en utilisant les xt images en ligne (Méthode 2)
- Cliquez sur 'Live' pour visualiser le sang ffaible en mode direct. Choisir un vaisseau sanguin pour l'analyse spécifique. Réglez le navire d'intérêt en position horizontale. Arrêtez le mode «Live» une fois que le navire d'intérêt est fixé.
- Sélectionnez le mode de balayage «xt» et mettre la lumière centrale du vaisseau sélectionné le long de la ligne de balayage. Set largeur du format à 1024 x 512, la vitesse = 8,000Hz, de ligne moyenne = 32, temps = 512. Cliquez sur «start» et d'acquérir les images de ligne de xt.
- Générer des stries pour l'analyse quantitative de la vitesse RBC en ouvrant le fichier de .lif et ouvrir l'image de la ligne de xt d'intérêt. Dans le logiciel LAS-AF, sélectionnez "expériences", ouvrir le .lif et sélectionnez l'image. Remarque: Il ouvrira automatiquement une kymographe.
- Mesurer le temps (t, obtenu sur l'axe Y) requis pour une série de particules (montrant une réflexion sombre) à parcourir une certaine distance (d, obtenu sur l'axe X) sur cette kymographe. Sélectionnez l'outil "tracer une ligne" et tracez une ligne horizontale à la série. Notez la distance enpm et le temps en secondes générée à la suite de l'onglet en bas de l'image.
- Calculer la vitesse V = distance / temps en utilisant les valeurs obtenues à partir de la kymographe.
- Quantifier un minimum de cinq particules stries image xt et par un minimum de trois navires individuels de la même taille.
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Representative Results
L'organisation architecturale spécifique des sinusoïdes du foie peut être visualisé basé sur la propriété autofluorescente de cet organe (Figure 1, panneau B et C, vert), l'injection intrapéritonéale de Hoechst pour l'étiquetage des hépatocytes noyaux (figure 1B, bleu) et l'injection intraveineuse de BSA fluorescent pour la coloration du système circulatoire hépatique (figure 1C, rouge). Le foie est composé de plusieurs sous-types différents de navires ayant des fonctions différentes et des structures et des tailles allant de 40 à 700 um de diamètre 2 (D) (D de petits vaisseaux est comprise entre 40 à 80 um et D 2 des gros vaisseaux est supérieure à 300 um 2 ). L'imagerie par microscopie intravitale du foie permet la visualisation à haute résolution de l'hétérogénéité et la complexité du système vasculaire du foie (Figure 1C).
Pour surveiller la vitesse d'écoulement du sang dans SSEV individuelEls, deux méthodes différentes sont utilisées pour l'acquisition des données et l'analyse d'images des vaisseaux sanguins du foie in vivo. Dans le premier procédé, l'imagerie en temps réel du flux sanguin dans un vaisseau présentant un intérêt est effectuée en utilisant le mode de balayage de xyt (Film 1). L'analyse quantitative de la vitesse d'un individu RBC dans un récipient unique est réalisée en utilisant le plugin MTrackJ dans le logiciel ImageJ (Figure 2A et 2B). Un minimum de cinq particules par navire est suivi dans différents bateaux allant de 40 à 80 um 2 de diamètre. Les résultats obtenus avec cette méthode donnent des valeurs cohérentes et reproductibles à travers différentes souris et d'évaluer la vitesse de RBC dans les petits vaisseaux du foie à des valeurs comprises entre 25-35 um / sec (figure 2C).
La seconde méthode consiste à balayer de façon répétée le long d'une ligne parallèle à la paroi du vaisseau, avec la ligne placée au centre de la lumière du vaisseau.La figure 3 montre un balayage de trame xy (panneaux de gauche) avec le balayage de ligne de xt correspondante (panneaux de droite). La vitesse d'un individu RBC est donnée par le rapport V = distance / temps et est calculé en utilisant les projections orthogonales sur les axes X et Y de la strie obtenue dans l'image de xt. Dans les figures 3D et 3E, chaque point de données représente la vitesse d'un RBC individuelle de différents petits ou grands navires sélectionnés à partir de souris différentes. Comme on le voit à partir des barres d'erreur, les données montrent une variation relativement faible entre les vitesses de RBC et indiquent que la vitesse du flux sanguin est nettement plus rapide dans les gros vaisseaux que dans les petits vaisseaux. En outre, une variation significative dans les valeurs de vitesse obtenues à partir de différents types de grands navires a été observée alors que la vitesse d'écoulement de sang est relativement similaire entre les différents types de petits bateaux. des mesures de débit de sang avec cette nouvelle méthode génèrent des données qui sont comparables aux données obtenues à partir de la décrire précédemmentméthode d aide MTrackJ (figure 2C comparer à la figure 3D). L'image de la figure 3C représente un exemple typique d'une expérience optimale dans laquelle le balayage de trame xy génère une image de xt non interprétable. Dans ce cas particulier, le problème résulte à la fois i) l'internalisation rapide de BSA dans les cellules endothéliales qui tapissent le navire d'intérêt et ii) la présence d'une jonction entre deux navires qui perturbe le flux sanguin dans la zone sélectionnée de l'acquisition. Le taux d'internalisation du réactif de plasma dans la garniture de l'endothélium du vaisseau sanguin est un paramètre critique à prendre en considération lorsque l'on mesure la vitesse d'écoulement du sang, comme l'internalisation va modifier la qualité de l'image xt qui montre les stries. Le taux d'internalisation dépend essentiellement de la dose du colorant qui est injecté par voie intraveineuse. Dans la figure 4, nous montrons que 500 ug de BSA-Alexa 647 et / ou 500 kDa de Dextran-FITC sont les doses optimales que Should être utilisé pour la quantification de la vitesse d'écoulement du sang. Ces doses génèrent un signal très lumineux qui permet l'identification de la RBC en tant que particules sombres sur un fond clair et permettent la visualisation du flux sanguin pendant un minimum de 1 heure sans internalisation du colorant injecté (figure 4, panneau inférieur). En revanche, 50 ug de BSA-Alexa 647 et / ou 500 kDa Dextran-FITC (non représentée), tout en permettant la visualisation de réseau vasculaire du foie, est une dose sous-optimale pour mesurer la vitesse d'écoulement du sang en raison de l'internalisation très rapide de le colorant, qui commence à 5 min après l'injection (Figure 4, panneau inférieur).
Lors de l'application de cette méthode dans le foie des animaux infectés, nous avons observé une augmentation significative de la vitesse d'écoulement de sang dès 1 heure post-infection. Modification de la vitesse RBC est maintenue jusqu'à 24 heures après l'infection. Il atteint finalement les valeurs normalesà 72 h après l'injection de parasite (figure 5). Ainsi, cette expérience valide l'utilisation de cette méthode pour acquérir de nouvelles connaissances sur l'influence des conditions pathologiques sur l'hémodynamique du foie.
Figure 1: microscopie intravitale du foie de souris (A) la chirurgie du foie de la souris.. Une petite zone d'un lobe du foie est exposé après l'opération, deux morceaux de gaze humide sont placés autour de lui et un coulisseau est mis sur l'abdomen pour couvrir le foie avant de la souris est placée sur la platine d'un microscope confocal. (B, C) l'image d'une zone représentative du foie d'une souris non-infectées démontre que les sinusoïdes du foie et les différentes tailles de récipients qui comprennent l'organe hépatique. Foie autofluorescence est représenté en vert. La souris est injecté avec Hoechst 33342 (bleu) pour marquer l'hepatocyte noyaux (B) et une injection de BSA-Alexa 647 (rouge) pour visualiser le système vasculaire du foie (C). Les barres d'échelle, 50 pm S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Analyse quantitative de RBC Velocity d'un balayage de trame xy en utilisant le logiciel ImageJ (A) image xy représentant de la circulation sanguine dans un petit bateau de foie acquis par imagerie par microscopie intravitale du foie de souris en utilisant le mode de balayage xy rapide. Les zones sombres correspondent aux globules rouges. La barre d'échelle, 10 um. (B) Quantification de la vitesse d'un seul RBC en utilisant le plugin MTrackJ de ImageJ. Lines (rouge, jaune, blanc) représentent la trajectoire au fil du temps d'une personne RBC. Vitesse (C) RBC dans sm individuelletous (D est d'environ 50 um 2) vaisseaux hépatiques. Le graphique trace la valeur de la vitesse de cinq à chenilles indépendantes globules rouges dans les vaisseaux du foie particuliers qui ont été sélectionnés à partir de cinq souris différentes (1 à 5). D représente le diamètre du vaisseau en pm 2. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Mesures foie flux sanguin par Microscopie intravitale imagerie d'un navire de sang à l'aide du mode de numérisation de Ligne xt images xy représentatifs (panneaux de gauche) de vaisseaux du foie marquées avec de la BSA-Alexa 647 et leurs images xt correspondantes (panneaux de droite) obtenu à partir d'un. ligne de balayage de la lumière centrale d'un navire individuel. (A, B) Petite (A) et une granderécipient de foie (B). (C) des données représentatives d'une expérience de sous-optimal indiquant l'intersection des deux vaisseaux sanguins et BSA internalisation dans l'endothélium. (D, E) Les graphiques tracer la valeur de la vitesse de trois globules rouges indépendants par navire (petites et grandes en D dans E) choisis parmi cinq souris différentes. D représente le diamètre du vaisseau en pm 2. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. L'effet de la dose de l'Colorant fluorescent plasma sur son internalisation dans l'endothélium Lining les sinusoïdes Cette image suit l'internalisation des BSA et Dextran 500 kDa dans l'endothélium tapissant les sinusoïdes, en fonction du temps et de la dose d'injection.S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Effet de L. infection donovani sur le foie hémodynamique. Ce graphique représente graphiquement les valeurs de la vitesse du sang obtenu à partir de plusieurs vaisseaux sanguins individuels à partir de souris non infectées (NI) et des souris qui ont été infectées par L. donovani et analysé 1 h, 24 h et post-infection 72 h (pi). Chaque point représente la valeur moyenne de cinq mesures de vitesse RBC obtenu dans un vaisseau sanguin unique d'environ 2 50 um. Dans chaque état (NI, 1 pi h, 24 h et 72 h pi pi) un minimum de trois souris ont été analysés pour la vitesse d'écoulement du sang. Les étoiles indiquent une différence significative dans la vitesse d'écoulement du sang obtenue 1 h et 24 h pi par rapport à des souris NI (P <0,01, d'une façon Anova).
Film 1. Time-lapse Microscopie intravitale imagerie du foie de souris. Film 1 correspond à la figure 3. La souris a reçu une injection de BSA-Alexa 647 de visualiser la vascularisation. La circulation du sang dans les petits vaisseaux (trois D de 50 pm 2) est affichée. Les zones noires correspondent à RBC.
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Discussion
Le développement récent de la microscopie intravitale du foie de souris ouvre de nouvelles possibilités pour l'enquête de la réponse physiologique à l'infection in vivo et en temps réel 5,9,10. La circulation sanguine d'organes est un paramètre physiologique critique qui est souvent altérée dans de nombreuses maladies. Toutefois, le statut de l'hémodynamique du foie dans des conditions physiologiques et infectieuses reste un domaine mal exploré. Dans cette étude, les méthodes basées sur l'IVM, qui étaient auparavant adaptés pour l'étude de la rate et vasculaire tumoral, ont été mises en œuvre pour quantifier la vitesse du flux sanguin hépatique dans un seul navire et mesurer la vitesse individuelle RBC in vivo 11,12. Les méthodologies utilisées ici reposent sur le contraste entre un fluorophore de plasma injecté par voie intraveineuse chez la souris, comme la BSA fluorescente, et les érythrocytes, qui restent sombres. In vivo des mesures de débit de sang ont le potentiel d'améliorer notre compréhension des pro de la maladieles processus.
Ici, deux méthodologies ont été utilisées et comparées à mesurer le débit sanguin dans les vaisseaux du foie. La première méthode est longue et fastidieuse en terme d'analyse de données car il oblige les utilisateurs à suivre manuellement mouvement RBC dans un navire individuel en utilisant le plugin MTrackJ dans le logiciel ImageJ. La deuxième méthode est simple et rapide, car elle se compose de l'analyse d'une image de xt d'un vaisseau sanguin généré par l'acquisition d'une ligne de balayage avec le mode du scanner de résonance. Les deux méthodes donnent des données comparables pour les navires similaires. A ce stade, il est presque impossible de comparer les données avec les autres, comme, à notre connaissance, la vitesse du flux sanguin n'a jamais été quantifiée dans des petits vaisseaux et dans les capillaires de la sinusoïde de la souris avec une largeur d'environ 10 um. Les méthodes à base de IVM permettent en xy haute résolution de 500 nm permettant l'analyse d'une sinusoïde avec une largeur de 10 à 50 um 13. En revanche, les techniques basées sur l'effet Doppler ont seulement un résol maximaleution de 70 um, ce qui limite la mesure du flux sanguin vers les artères et les veines hépatiques trois portails.
L'une des principales étapes qui est essentiel pour la mise en œuvre réussie de ces méthodes est une chirurgie réussie et l'entretien de la souris anesthésiée en bon état physiologique pendant toute la session d'imagerie. Pour ce faire, il faut soigneusement contrôler la température de la chambre de microscope et anesthésier toutes les heures. Une autre étape essentielle est l'internalisation du plasma réactif fluorescent dans la paroi de l'endothélium qui peut se produire naturellement après son injection. Cette internalisation produira des images xt non interprétables et images xy non contrastées. Ce phénomène dépend de la dose de colorant injecté et peut être prévenue par l'injection d'une dose élevée du réactif de plasma (Figure 4).
Fait important, le succès de l'imagerie de microscopie intravitale le débit sanguin hépatique nécessite èmee compte de plusieurs aspects essentiels. Ceux-ci comprennent la complexité du système vasculaire du foie, la présence de différents sous-types de vaisseaux sanguins contenant de petites et de grands navires ayant des structures et des fonctions différentes, les circulations sanguines avec des flux rapides et lents et rapides des vitesses de RBC. La principale limitation de la méthode qui est basée sur l'analyse d'une image de xt est la vitesse d'acquisition de la cuve et le manque de résolution Z, en tant que l'image est acquise en 3D (xyt). Plus précisément, les vitesses de balayage de ligne des systèmes standard à atteindre une limite de sensibilité en ce qui concerne l'acquisition de gros vaisseaux sanguins (diamètre supérieur à 180 um 2) qui sont caractérisés par des vitesses très élevées de RBC, ce qui est le cas avec les artères. Dans le grand navire, la trajectoire RBC peut être sur le plan imagé et tous les composants qui sont perpendiculaires au plan numérisée sera exclus de l'analyse.
La méthodologie présentée here représente un outil idéal pour l'in vivo et quantification réelle de temps de plusieurs paramètres de l'écoulement du sang dans diverses conditions pathologiques. L'enquête de l'hémodynamique du foie va apporter un nouvel éclairage sur les processus de maladies et de parasites pathogenèse dans un organe spécifique. Nos efforts pour obtenir un aperçu du système de microvascularisation hépatique appliquée à un modèle expérimental chez la souris de l'infection Leishmania ouvre la possibilité pour la corrélation de plusieurs paramètres de flux de sang avec la multiplication des parasites et le développement de la maladie dans cet organe, en temps réel. La poursuite du développement de réactifs, des outils et de la méthodologie pour la caractérisation améliorée du système vasculaire du foie par l'IVM cours de l'infection est d'une grande importance pour l'étude de l'influence de parasite colonisation sur ce paramètre physiologique et, réciproquement, l'influence du sang couler sur Leishmania pathogenèse. Cette stratégie peut être potentiellement étendue à d'autres maladies infectieusessystèmes où les agents pathogènes ciblent le foie.
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Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par l'INSERM, l'Université d'Aix-Marseille et un prix de développement de carrière à partir HFSPO obtenu par CL Forestier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
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