Isolering och Immortalisering av patientgenererade cellinjer från muskelbiopsi for Disease Modeling

Protocol

OBS: Protokoll för insamling av mänsklig vävnad måste granskas och godkännas av Institutional IRB kommittén. Insamling av kasse, de identifierade mänsklig vävnad har godkänts av Boston Barnsjukhus och Brigham and Women sjukhus IRK kommittéer. De metoder som beskrivs nedan har tillämpats för isolering av myogena celler från avidentifieras, kasse vävnad. De beskrivna metoderna är tillämpliga på vävnad som samlats in från samtyckt patientmaterial.

1. Cell Isolering

1. Dissociation av muskelbiopsi och rening av myogena celler
   1. Pre-väger 10 cm vävnadsodlingsplatta i en vävnadskultur biosäkerhet huva, och sedan åter väger plattan innehåller muskelbiopsi för att beräkna mängden vävnad som ska skiljas.
   2. Använda sterila skalpeller, färs muskelvävnad fint och tillsätt några droppar steril 1x HBSS att förhindra vävnad från att torka ut.
   3. Lägg 3,5 ml vardera av dispase II och kollagenas D per gram muskelvävnad som ska rötas. Pipet den malda vävnaden och enzymlösningen genom ett sterilt 25 ml pipett några gånger. Inkubera plattan i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C med 5% _CO2 under 15 min och smälta vävnaden tills uppslamningen passerar lätt även om en steril 5 ml pipett.
      OBS: Tissue dissociation uppnås vanligen genom enzymatisk nedbrytning inom 45-90 minuter. Se de "Representativa resultat" avsnitt för ytterligare information.
   4. Tillsätt 2 volymer sterilt tillväxtmedium till dissocierade vävnaden, filter genom en 100 ìm cell sil över en 50 ml koniska rör och pelletceller i 10 minuter vid 329 xg (~ 1100 rpm), rumstemperatur. Se Material Tabell för medie sammansättning.
   5. Återsuspendera pelleten i en volym av sterilt tillväxtmedium och tillsätt 7 volymer av röda blodkroppar lyslösning. Filtrera lösningen genom ett 40 ìm cell sil, sedan pelle than celler under 10 minuter vid 329 xg, rumstemperatur.
   6. Räkna cellerna i en hemocytometer och återsuspendera cellerna i 1x HBSS 0,5% BSA vid en koncentration av 1 x 10 ⁶ celler / 100 | il. Avsätt ~ 250.000 celler i ett enda rör som kommer att användas som ett negativt (ofärgade) kontroll. Avsätt extra enfärgade färgade kontroll rör för propidiumjodid och för CD56, som krävs för korrekt gating av CD56-positiva celler med FACS sortering. Se cellsortering handböcker eller rådgöra med FACS sorteringskärnanläggningens experter för att säkerställa lämpliga kontroller ingår.
   7. Färga cellerna som skall sorteras med 5 pl / 10 ⁶ celler av anti CD56-antikropp. Inkubera alla prover (inklusive kontroller) på is i 30 min.
   8. Tvätta prov i 10 ml 1x HBSS och pellets celler under 10 min vid 329 xg (~ 1100 rpm) i en kyld centrifug, 4 ° C temperatur.
   9. Lägg propidiumjodid vid en slutlig koncentration av 1 ug / ml till provet för att vara sorted för uteslutning av döda celler. Rena myogena CD56-positiva celler från icke-myogena celler med fluorescens aktiverad cellsorterare.
2. Dissociation av hudbiopsi
   OBS: Dermal fibroblaster kan isoleras från en hud punch från patienter när muskelbiopsier är inte tillgängliga. Dermala fibroblaster kan användas som biomaterial för flera undersökningar, bland transduktion med MyoD att generera myogena celler. Dessutom kan dermala fibroblaster användas för att generera iPS-celler, som kan differentieras till olika celltyper för vidare studier.
   1. Transportera hudbiopsi till laboratoriet i transportmedium. När provets mottages, utför primärkulturen så snart som möjligt. Om inte kan fastställas primärkulturen på samma dag, förvaras provet vid rumstemperatur över natten.
   2. Överför hudbiopsi till en steril 35 mm petriskål i laminärt flöde huva.
   3. Skölj huden biopsi i en petriskål med steril 1x PBS för att avlägsna blod och skräp. Ta bort fettvävnad med en steril skalpell.
   4. Lägg 2 ml kollagenaslösning och finhacka vävnaden med skalpell, inkubera vid 37 ° C under 45 min till 1 h, beroende på storleken av vävnaden.
   5. Överför digere vävnad till en 15 ml koniskt rör, skölj petriskål med 2 ml av fibroblast-odlingsmedium två gånger, och samla mediet i samma rör.
   6. Pellets celler vid 200 xg under 5 min vid rumstemperatur.
   7. Kasta bort supernatanten och tvätta pelleten med 3 ml av fibroblast-medium för att avlägsna kollagenas, då pellets celler igen. Se Material Tabell för medie sammansättning.
   8. Upprepa steg 1.2.7 en gång till.
   9. Åter avbryta pelleten i 5 ml fibroblast medium och platt celler på en T25 steril vävnadsodlingskolv. Inkubera kolven vid 37 ° C med 5% _CO2.
   10. Utvärdera kultur för fibroblast fastsättning och tillväxt under de närmaste 1-3 dagarna. <br /> OBS: Några små vävnadsbitar kan också fästa på plattan och fibroblaster migrerar ut ur dessa vävnadsstycken.
   11. Bibehåll kulturen på samma villkor till dess att fibroblaster odlas till cirka 80% sammanflödet.
   12. Samla fibroblaster genom trypsinering och överföra på färska odlingsflaskor för ytterligare expansion. Utför trypsinization genom att tvätta kulturerna 3 gånger i 1x PBS fritt från Ca ⁺⁺ och Mg ^++. Lägg Trypsin-EDTA (se Material tabell) till cellerna (2ml / T25-kolv) under 2 min vid 37 ° C.
   13. Split lösgjorda celler i ytterligare kolvar. Om vissa vävnadsbitar sitter kvar de ursprungliga T25-kolvar, tillsätt 5 ml färskt odlingsmedium till denna kolv och fler fibroblaster migrerar ut kontinuerligt.
       OBS: Den expanderade fibroblast kulturen kan frysas ned som P1 och lagrades i flytande kväve för framtida experiment.

2. Immortalisering av myogena celler

1. Foder celler 30 min före transfektion med 5 ml färskt medium kompletterat med 10 mM koffein.
2. Homogeni en blandning av 2 pg av plasmid DNA från en midi prep (CDK4 eller hTERT plasmid) och PolyJet och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter, som rekommenderas av tillverkaren.
3. Lägg plasmiden / PolyJet blandning till PE cellerna över natten.
4. Flöde celler med färskt medium (DMEM och Medium 199 i ett förhållande av 4: 1, kompletterat med 10% kalvserum). Tolv timmar senare uppsamlades den virusinnehållande supernatanten och filtrera den genom ett 0,45 ^ m porstorlek filter.
5. Använd en ml uppsamlade supernatanten för att infektera över natten den amfotropa paketerande cellinjen PA317 ⁵ och erhålla en stabil virusproducerande cellinje efter selektion med antingen 0,5 mg / ml neomycin (G418) för CDK4 eller 0,5 mg / ml hygromycin för hTERT.
6. Förbered arbeta virala supernatanter genom att odla de stabila förpackningscellerna till nära sammanflyt, sedan skörda supernatanten varje morgon, kväll och morgon för tre skördar.
7. Filtrera de virala supernatanterna och antingen direkt använda eller dela in dem i 1 ml portioner och förvara vid -80 ° C för senare användning. Observera att viral supernatant förlorar 50% infektion effektivitet med varje frysning-tining. Kom ihåg att bleka-tvätt innan kasta allt som har berört de viruspartiklar.
   OBS: Det stabila PA317 virusproducerande cellinje kan frysas och hålls vid -150 ° C för permanent lagring (frysning medium är 10% DMSO, 90% Serum).
8. Plate FACS-renade myogena celler (beskrivet i steg 1,1-1,9) vid en densitet av 5 x 10 ⁴ celler / brunn i 6-brunnars plattor belagda med 0,1% gelatin. Se till att cellerna är fästa till plattan innan man går vidare med den virala infektionen.
9. Lägg 400 pl filtrerades, freshly producerade viral supernatant eller frysta prov till sex brunnar över natten (håll 2 brunnar som kontroller).
10. Ändra mediet genom att mata cellerna med 2,5 ml / brunn av färskt muskelmedia (4: 1 Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) och Medium 199 kompletterat med 15% fetalt bovint serum, 0,02 M HEPES-buffert, 1,4 mg / L vitamin B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L dexametason, 2,5 mikrogram / l hepatocyttillväxtfaktor och 10 | ig / l basisk fibroblasttillväxtfaktor). Kassera media och pipetter som innehåller de virala partiklarna i ett blekmedel behållare. Lämna celler i samma medium i 3 dagar för att återhämta sig från smitta, sedan behandla väljas med antingen 400 mikrogram / ml neomycin (CDK4 infektion) eller 300 mikrogram / ml hygromycin (hTERT infektion).
11. Upprätt celler under läkemedelsselektion tills cellerna i kontroll skålen dynan (1-2 veckor).
12. Passage celler innan de blir sammanflytande (60-80% konfluens, använder 0,05% trypsin EDTA), även under selectipå perioden. Förnyad utbredning celler i flera 10cm rätter med färsk myoblast mediet (enligt beskrivningen i 2.11) kompletterat med urvals drogen. Behåll odödliggjorda markerade celler som en heterogen population eller klona för att få en helt homogen genetisk bakgrund (samma insättning av transgenen i varje cell).
13. Utför klonurvalet med följande steg:
    1. Seed cellerna vid låg täthet (t.ex. 300-500 celler i 10 cm skålar) och upprätthålla dem under ungefär två veckor, till dess att små kolonier bildas (10-20 celler).
    2. Avlägsna det mesta av mediet vid denna punkt, vilket innebär att endast en tunn film för att hindra cellerna från att torka ut.
    3. Placera en kloningsring (med ena änden doppad i silikon vakuum fett) över varje önskad klon och tillsätt några droppar trypsin / EDTA.
    4. Harvest celler när de blir rundade genom att försiktigt aspirera cellerna med hjälp av en 1 ml spets eller en Pasteur-pipett och överföra dem till den minsta tillgängliga flerkälls plate (96 eller 48, 24 eller 12 hålsplattor).
    5. Expandera kloner som behövs för att förhindra lokal sammanflytning.

Representative Results

Figur 1 illustrerar några av de viktigaste stegen i den primära vävnadsdissociering: den exakta mängden vävnad vägs i en steril vävnadsodling petriskål (Figur 1A, B). Vävnaden sedan finfördelades med användning av sterila skalpeller, tills en vävnad uppslamning erhålls (Figur 1C, D). Efter tillsats av de digereringsenzymer, är primära muskelvävnad dissociation vanligtvis uppnås genom enzymatisk spjälkning inom 45-90 min. Progressionen av vävnad matsmältningen typiskt kontrolleras varje 15-20 min för att förhindra överdigere och celldöd. Den enzymatiska matsmältningen kan vara försiktigt pipetterade och blandas några gånger varje 15-20 min. Vid slutet av uppslutningssteget, cellerna filtrerades genom ett 100 | im (figur 1E, F) och sedan en 40 ^ m filter. Beroende på mängden utgångs muskelvävnad och huruvida provet erhålls från milt eller hårt drabbade muskeln, den dissocierade primära cells blir heterogen. Figur 1G visar ett exempel på mononukleära celler i suspension omedelbart efter digestionen, medan figur 1H visar ett exempel på dissocierade primära celler 3-6 timmar efter digere och plätering i vävnadsodlingsskålar. Myogena celler kommer vanligtvis att blandas med fibroblaster och adipogena celler. Immunceller kan också vara närvarande i de fall där inflammation är associerad med patientens sjukdom. Därför kan prospektiv separation av de olika celltyperna vara önskvärda. För blivande isolering av humana myogena celler, CD56 eller N-CAM har ofta används som en pålitlig markör ^6-9. Denna rening kan vara fördelaktigt kort efter isolering för anrikning av myogena progenitorceller och innan cellodödliggörande processen. Alternativt kan immortalisering av primära celler utföras i början, kan sedan odödliggjorda myogena celler väljas baserat på uttryck av CD56 med FACS. En schematisk påde steg som krävs före FACS sortering och ett exempel på en FACS-profil visas i figur 2. I korthet är primära celler räknades och återsuspenderades vid hög koncentration som anges, då den primära antikroppen (dvs anti CD56) läggs till cellerna och odlades under 30 min på is. Efter en tvätt, celler analyseras genom en fluorescensaktiverad cellsorterare och renades (Figur 2) .Den ungefärliga utbytet av CD56-positiva celler varierar från prov till prov, som sträcker sig från 40 till 70% av de totala mononukleära celler. Avkastningen varierar beroende på ålder för den enskilde och om myogena celler utvinns från opåverkad eller sjuka muskler. Opåverkad muskler har vanligtvis hög andel av myogena celler, medan dystrofisk muskler har ofta lägre procentandelar av CD56-positiva celler. De renade cellerna stryks i fullständigt myogenic tillväxtmedium (se Material tabell). Celler kan passe genom trypsinization när de REACh 60-70% konfluens. CD56-uttryckande celler är myogena och förmåga att bilda myotuber in vitro ^10,11 .Den immortalisering av myogena celler kräver sekventiell transfektion av två gener ^12,13 (såsom schematiseras i figur 3). Cyklinberoende kinas 4 (CDK4) används för att övervinna stressen av vävnadskultur på grund av otillräckliga odlingsbetingelser, och humant telomeras omvänt transkriptas (hTERT) förhindrar telomerförkortning grund slutet replikering fenomen ^12. Både pre-virala plasmider är i pBabe ryggraden vektorn. Musen CDK4 cDNA-konstruktion innehåller neomycinresistensgenen och hTERT-cDNA-konstruktionen innehåller hygromycinresistensgenen. Den senare innehåller också en herpes simplex virus tymidinkinas (TK) kassett och loxP-ställen placerades i båda ändarna av hTERT / TK kassett. Detta gör att excision av hela uttrycket enheten genom Cre rekombinas ¹⁴ och kontra val med gancyklovir.

Nyligen odödliggjorda celler kan bibehållas som en population där virus är integrerade i olika platser, eller klonade, för att få en helt homogen genetisk bakgrund (enstaka insättning i cellen genomet och dess avkomma). I de flesta fall isolering av kloner från ett huvud befolkningen kommer resulterar i små skillnader mellan kloner beroende på införandet av kassetten i cellgenomet. Dessutom kommer omfattande vävnadskultur gynnar urval av celler med tillväxtfördel snarare än de som skiljer. Jagtröst av enskilda kloner görs helt enkelt genom att så celler vid låg densitet (t ex: 300-500 celler i 10 cm skålar) och odla under cirka två veckor tills små kolonier bildas (10-20 celler). Det mesta av mediet avlägsnas därefter, vilket innebär att endast en tunn film för att hindra cellerna från att torka ut. Kloner trypsineras använder kloningsringar och sedan expand efter behov. Expanderade immortaliserade kloner kan testas med avseende på expression av gemensamma myogena cellmarkörer, såsom CD56 med FACS, desmin och MyoD expression genom immunofluorescens, eller myotube bildning vid differentiering. Myotuber är mest uppenbara när sammanflytande myogena celler (90% confluency) placeras i differentiering medium (DMEM och Medium 199 i förhållandet 4: 1, kompletterat med 2% hästserum) efter 3-5 dagar (Figur 4). Inga skillnader sågs i myotube bildning och i myotube kontraktion förmåga mellan icke-immortaliserade kontrollceller och immortaliserade celler (Video 1 och 2).

(Figur 5). Exempel på tillväxtkurvor visas i figur 5A, där telomerförkortning iakttogs som celler expanderades för förlängd antal passager. Omvänt är framgångsrik immortalisering associerad med ökad telomerasaktivitet (Figur 5)

Figur 1:.. Illustrationer av kritiska steg för dissociation av primär mänsklig muskelvävnad (A) Vägning av den tomma odlingsplatta, innan vävnadsplacering och (B) efter placering av vävnaden (C) Sterila skalp används för att finhacka vävnad, tills (D) vävnaden detsjälv reduceras till en uppslamning. Kollagenas och dispas tillsättes och vävnaden digererades under 45-90 min, därefter digestionen filtreras genom ett nylonmaskfilter för att kassera skräp (E, F). (G, H) exempel på nyligen dissocierade celler ut omedelbart efter dissociation (G ) eller 3 h efter dissociation, när primära celler börjar sedimentera (H).

Figur 2:. Arbetsflöde förfaranden som ingår i människans myoblast färgning före rening via fluorescens aktiverad cell sorterare De kritiska stegen för färgning av mänskliga celler före FACS-analys är markerade. Exempel på FACS tomter visas också. Den negativa kontrollen (vänster panel) används för att fastställa sorteringsgrinden. I högra panelerna, är positiva celler som uttrycker CD56 gated och PercentaGE positiva celler visas. Denna strategi kan användas för att rena myogena celler antingen före immortalisering eller efter immortalisering förfarandet.

Figur 3: Schematisk bild av virusproduktion för myoblast odödliggörande. Workflow av retrovirus produktion som använts som odödlig myoblaster. En plasmid konstruktion innehållande antingen CDK4 eller floxade hTERT-TK kassett i en pBabe ryggrad (vänster) transfekteras in i Phoenix ekotropiska (PE) packningscellinje natten (8-12 tim) med PolyJet. Supernatanten överförs sedan efter filtrering på Phoenix amfotropiska förpacknings cellinje (PA317). Supernatanten från dessa celler kan antingen användas direkt eller cellerna kan väljas med antingen neomycin eller hygromycin skapa en stabil cellinje för framtida bruk. Alikvoter av filtEred supernatanten kan lagras vid -80 ° C för senare användning (med en förlust av 50% effektivitet). Bleach används för att rengöra varje förbruknings används vid alla punkter förfarandet.

Figur 4:. Schematisk bild av reversibel myoblast immortalisering Workflow av immortalisering förfarandet (överst): Primära celler först transfekteras med CDK4. Efter Neomycin urval, är myoblasts transfererats med en floxed hTERT kassett innehåller två selektionsmarkörer; HSV-TK och Hygromycin. Om så önskas vid ett senare tillfälle, kan hTERT kassetten vara "floxed" ut genom att uttrycka Cre rekombinas och välja efter excision med gancyklovir. Detta gör att "re-mortalization" av myoblaster och återinsättande av telomerförkortning. Om telomererna är 20 kb långa, fortfarande tillåter detta hundratals dubble, och undviker t Han komplikation av överuttryck av hTERT. Slutligen kan isogena kloner från odödlig befolkningen isoleras. Kan visas myogenicity av de nyligen immortaliserade celler med specifika markörer för muskelceller såsom desmin (nedre vänstra panelen, celler i tillväxtmedium färgade med anti-desmin, klon D33, grön). Denna klon är så myogenic att differentierade celler ses även om cellerna hålls i spridningsförhållanden. När cellerna differentieras differentiering medium (med 2% hästserum, mellersta och högra paneler) myotube bildning blir mycket omfattande. Nästan alla celler som färgats med MF20 antikroppar mot embryonal myosin tung kedja (grön) och myotuber har flera kärnor av DAPI färgning (blå, alla bilder). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

les / ftp_upload / 52307 / 52307fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Kontroll av immortalisering förfarandet. (A) Tillväxtkurvor för isogena kloner från primär myoblast, odödlig befolkningen (myoblast hTERT-CDK4) och åter mortalized klonen (myoblast floxed hTERT-CDK4) visas som exempel. Inga skillnader i tillväxttakten var detekterbara innan cellerna når åldrande. Telomerförkortning övervakades som en funktion av populationsfördubblingar och telomerlängd mättes genom TRF. (B) TRF visas är exempel på tidiga tidpunkter och sen replikering i myoblaster (5 tidpunkter från PD 13-75), åter mortalized myoblaster efter hTERT excision (3 tidpunkter från PD 62-152) och förevigade myoblaster (PD 75 och 200). (C) Framgångsrik hTERT infektion leder till en ökning av telomerasaktivitet. Telomeras-aktivitet bedömdes med ddTRAP (ddTRAP avläsning, höger; kvantifiering av analysen, vänster) ¹⁵ i celler före och efter HteRT-infektion. hTERT excision avskaffas telomerasaktivitet till den ursprungliga tröskel ses i myoblaster. Resultaten visas som totala telomeras produkter som genereras per cell motsvarande (bakgrundskorrigerad). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Klicka här för att se filmen.
Klicka här för att se filmen.

Video 1 och 2. myotuber alstrades från celler före och efter immortalisering processen. Celler odlades till konfluens i tillväxtmedier och bytte till differentieringsmedium för 10 dagar. I båda filmer, funktionella sammandragningar av en eller flera myotuber är detekterbara. Inspelning av den spontana ryckningargjordes med hjälp av en 20X lins. Inga skillnader observerades mellan odödliggjorda och icke-odödliga celler.

Discussion

Celler som en användbar resurs

Den isolering och odling av myogena cellpopulationer är mycket användbart när man fastsjukdoms fenotyper eller in vitro modeller av sjukdomen. Den myogenic cellisoleringsförfarande som beskrivs här medger isolering av myoblaster och fibroblaster från skelettmuskelprover, vilka därefter kan förökas, differentierade, eller omedelbart analyseras. Myoblast struktur och funktion kan bedömas genom mikroskopisk undersökning, utvärdering av cellöverlevnad, utvärdering av cellfusion, eller genom molekylära studier av RNA eller proteinuttryck. Dessutom kan myoblaster differentieras i myotuber som delar många funktioner i omogna myofibers, vilket gör den direkt bedömning av myoblast funktion i samband med muskelutveckling och återhämtning efter vävnadsskada. Även om alla dessa fenotyper tenderar att vara ganska reproducerbar i tidiga passager av myogena celler, beteende många primär myogenic cellinjer kan ändras under loppet av många passager. Som ett resultat är det ibland önskvärt att föreviga en given myogenic cellinje (såsom beskrivs här), som kan underlätta den enkla odlings etablering och generering av reproducerbara resultat under en längre tidsperiod.

Selektion av specifika cellpopulationer

Detta protokoll beskriver isolering av myogena celler från skelettmuskelvävnaden med FACS som ett reningsschema. Den föreslagna strategin för att markera celler inkluderar använder propidiumjodid (en indikator av döda celler) och CD56 (en markör för myogena celler) för att differentiera levande, myogena celler från döda celler, skräp, och icke-myogena celler. Celler som ingår i CD56 positiva befolkningen kommer att omfatta myogena gångare som kan bilda myotuber, medan CD56-negativ befolknings kommer att omfatta icke-myogena celler inklusive fibroblaster och eventuellt adipogena celler. Var och en av dessa fraktioner kanvara självständigt odlas för att producera cellkulturer av myoblaster eller fibroblaster, och möjligheterna att etablera parallella fibroblast cellkulturer kan vara användbart för fristående cell eller DNA bank övningar eller som ytterligare kontrollvillkor för analyser som utförts på de myogena cellkulturer. Det finns flera andra alternativ för val av specifika myoblastic och fibroblastiska cellkulturer från diger muskelvävnad, i de fall där FACS sortering är oönskad eller otillgänglig, vilket beskrivs på annat håll ^16,17. En alternativ metod för att separera myoblastic och fibroblastceller involverar användningen av differentiella vidhäftningsegenskaper mellan dessa två celltyper för att berika successiva passager av celler för en given celltyp. Som fibroblaster följa plast mycket lättare än myoblaster, vilket gör cellsuspensionema att ruva på plast för ca 1 timme vid upprättande eller passage cellerna och sedan plätering supernatanten på en annan maträtt kommer result i avlägsnandet av många fibroblaster från cellsuspensionen ^18.

Nyttan av fibroblaster vs. myoblaster

Muscle biopsier från patienter används vanligtvis för rening av primära muskelceller, men sjuka myoblasts får inte föröka effektivt och kan bara genomgå ett fåtal antal divisioner in vitro, vilket kräver cell immortalisering att nå det stora antalet divisioner nödvändiga. Med tanke på att både fibroblaster och myoblaster kan isoleras från muskelbiopsier, bör båda cellfraktioner räddas från patientprover, eftersom de kan både vara användbara och erbjuder mycket mångsidighet för tillämpningar efter. Till exempel kan fibroblaster användas för generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), som håller mycket löfte att generera obegränsat cellantal och potentialen att induceras att differentiera i flera cellinjer. Dessa funktioner är mycket önskvärt att celler erhållna från patients med sällsynta sjukdomar, vilket potentiellt kan rättas in vitro eller används i experimentella drog filmvisningar i sökandet efter terapeutiska föreningar. Immortaliserade myoblaster kan också användas i läkemedelsbaserad screening. Fibroblaster kan också effektivt omvandlas till en myogenic öde genom infektion med ett virus som uttrycker MyoD ^19-21. Denna metod har effektivt testats med fibroblaster extraherats från patienter med muskelsjukdomar och bekräftade att MyoD-uttryck fibroblaster effektivt kan bilda myotuber som uttrycker mogna muskelproteiner. Sålunda kan båda celltyperna effektivt användas i ett flertal nedströmstillämpningar och ge ovärderlig material för diagnostiska och terapeutiska studier.

Effekter av Immortalisering

Den immortalisering av normala diploida celler gör att man kan framställa en stabil human cellinje som helt kan karakteriseras och studeras av många olika laboratorier. Primära kulturer från oberoendeisoleringar kan variera och deras övergripande fortplantningsförmågan kan variera när skador införs i dissociation processen eller genom överdigere, vilket kan snedvrida kulturen beteende. Den immortalisering av celler genom att använda ett uttryck för den katalytiska subenheten av telomeras (hTERT) har fördelen att upprätthålla en stabil cellulär fenotyp och celler förblir diploida. Det har förekommit rapporter i möss som telomeras kan modulera Wnt väg ^22. Vi har inte observerat detta fenomen i humana celler. Men för att undvika en sådan potentiell komplikation har hTERT kassetten har flankerad med lox-ställen, så att den kan tas bort efter telomererna har långsträckt. Långa telomerer ger hundratals extra divisioner, vanligen tillräcklig för att utföra de flesta experiment.

Eftersom kontinuerlig expansion cell ger alltid en selektiv fördel för snabb tillväxt, kan den cellulära fenotypen ibland bli partisk på grund av överväxt av de snabbast divideraceller, snarare än de bästa differentierande cellerna. Även om detta ännu inte har visat sig vara ett betydande problem med användning av den beskrivna metoden, kan det avhjälpas genom upptining celler som har frysts tidigt i deras kultur historia eller genom klonal selektion för de celler som uppvisar den önskade fenotypen.

Slutligen, medan expansionen av myogena celler till nära obegränsat antal har fördelar för drogscreening och eventuell modellering sjukdom, de nuvarande teknikerna har också inneboende nackdelar som förhindrar användningen av dessa celler som terapeutiska fordon i cellbaserad terapi, eller som primära diagnostiska verktyg. Både den omfattande odling in vitro och immortalisering steg ändrar fenotypen av muskelceller jämfört med deras naturliga tillstånd. Viktigt är dessa celler expanderas i en miljö som är mycket annorlunda från den naturliga miljön av primär satellitceller inom sin nisch. Därför odödliga celler kräver intensiv säkerhetstester och eventuellt utveckpment av nya tekniker, om de skall återinföras i human patients muskel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010