Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

Protocol

HINWEIS: Protokolle für die Sammlung von menschlichem Gewebe muss überprüft und von der Institutional IRB Ausschuss genehmigt werden. Sammlung von verworfen, de-identifizierte menschliche Gewebe wurde von der Boston-Kinderklinik und Brigham and Womens Hospital IRB Ausschüsse zugelassen. Die nachfolgend beschriebenen Methoden zur Isolierung von myogenen Zellen aus deidentifiziert angewendet wurde, verworfen Gewebe. Die beschriebenen Verfahren sind für Gewebe von Patienten zugestimmt Material gesammelt.

1. Zellisolation

1. Die Dissoziation von Muskelbiopsie und Reinigung von myogenen Zellen
   1. Pre-wiegen 10 cm Gewebekulturplatte in einer Gewebekultur Biosicherheit Haube und dann erneut wiegen die Platte, die die Muskelbiopsie, die Menge an Gewebe zu berechnen, getrennt werden.
   2. Mit einer sterilen Skalpellen, Hackfleisch Muskelgewebe fein und fügen Sie ein paar Tropfen sterile 1x HBSS, um Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern.
   3. Jeweils Di 3,5 mlspase II und Collagenase D pro Gramm Muskelgewebe verdaut werden. Pipettieren des zerkleinerten Gewebes und Enzymlösung durch ein steriles 25 ml-Pipette ein paar mal. Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 15 min und zu verdauen Gewebe, bis die Aufschlämmung leicht wenn eine sterile 5 ml-Pipette durchläuft.
      HINWEIS: Gewebedissoziation wird üblicherweise durch enzymatische Verdauung innerhalb 45-90 min erreicht wird. Bitte lesen Sie den Abschnitt 'Repräsentative Ergebnisse "für weitere Informationen.
   4. Hinzufügen von 2 Volumina sterilem Wachstumsmedium dissoziierten Gewebe, filtriert über ein 100 & mgr; m Zellsieb über eine 50 ml konischen Röhrchen und Pellets Zellen für 10 min bei 329 × g (~ 1100 rpm) bei Raumtemperatur. Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für Medienzusammensetzung beziehen.
   5. Das Pellet in 1 Volumen sterilen Wachstumsmedium und fügen 7 Volumen der roten Blutkörperchen Lyselösung. Filtern der Lösung durch ein 40 & mgr; m Zellsieb dann pelle ter Zellen für 10 min bei 329 × g, Raumtemperatur.
   6. Zählen der Zellen in einem Hämozytometer und Resuspendieren der Zellen in HBSS 1x 0,5% BSA in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / 100 & mgr; l. Beiseite ~ 250.000 Zellen in einem einzigen Rohr, das als negative (ungefärbten) Steuerung verwendet wird. Beiseite zusätzliche einfarbigen gefärbt Kontrollröhrchen für Propidiumiodid und CD56, die für die ordnungsgemäße Anspritzung von CD56-positiven Zellen durch FACS-Sortierung erforderlich. Bitte beachten Sie die Sortierung Handbücher Zelle oder wenden Sie sich mit FACS-Sortierung Core Facility Experten zu entsprechenden Kontrollen zu gewährleisten enthalten sind.
   7. Färben sich die Zellen mit 5 & mgr; / 10 ⁶ Zellen von anti CD56 Antikörper sortiert werden. Alle Proben (einschließlich Kontrollen) auf Eis inkubieren für 30 Minuten.
   8. Waschproben in 10 ml 1x HBSS und Pellet-Zellen für 10 min bei 329 × g (~ 1100 rpm) in einer Kühlzentrifuge bei 4 ° C Temperatur.
   9. Hinzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml zu der Probe zu sein sorten für den Ausschluss von toten Zellen. Reinige myogenen CD56-positiven Zellen aus nicht-myogenen Zellen mit Hilfe der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer.
2. Die Dissoziation von Hautbiopsie
   HINWEIS: Die dermale Fibroblasten aus einer Hautstanze von Patienten isoliert werden, wenn Muskelbiopsien sind nicht verfügbar. Hautfibroblasten als Biomaterial für viele Studien, einschließlich der Transduktion mit MyoD zu myogenen Zellen zu erzeugen genutzt werden. Zusätzlich können dermale Fibroblasten verwendet, um iPS-Zellen, die in verschiedenen Zelltypen, für die weitere Untersuchung unterschieden werden können erzeugen.
   1. Transportieren Sie die Hautbiopsie an das Labor in Transportmedium. Sobald die Probe empfangen wird, führen die primäre Kultur so schnell wie möglich. Wenn die primäre Kultur nicht am selben Tag ermittelt werden, speichern die Probe bei Raumtemperatur über Nacht.
   2. Übertragen der Hautprobe auf eine sterile 35 mm Petrischale in der Sterilbank.
   3. Spülen Sie die Hautbiopsie in einer Petrischale mit steriler 1x PBS, Blut und Trümmer zu entfernen. Entfernen Sie das Fettgewebe mit einem sterilen Skalpell.
   4. 2 ml Kollagenase-Lösung und zerkleinern das Gewebe mit Skalpell, Inkubation bei 37 ° C für 45 min bis 1 h, je nach der Größe des Gewebes.
   5. Übertragen Sie die verdaute Gewebe zu einem 15 ml konischen Röhrchen, spülen Sie die Petrischale mit 2 ml Fibroblasten-Kulturmedium zweimal, und sammeln Sie das Medium in der gleichen Röhre.
   6. Pelle Zellen bei 200 g für 5 min bei Raumtemperatur.
   7. Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 3 ml Fibroblastenmedium, um die Kollagenase wieder zu entfernen, dann Pellet-Zellen. Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für Medienzusammensetzung beziehen.
   8. Wiederholen Sie den Schritt 1.2.7 noch einmal.
   9. Re-suspend das Pellet in 5 ml Medium Fibroblasten und Plattenzellen auf einen T25 sterile Gewebekulturflasche. Der Kolben wird bei 37 ° C mit 5% CO ₂ inkubiert.
   10. Bewerten Sie die Kultur für Fibroblasten-Anhaftung und das Wachstum in den nächsten 1-3 Tagen. <br /> Hinweis: Einige kleine Gewebestücke können auch auf den Teller legen und Fibroblasten Migration von diesen Gewebestücken.
   11. Aufrechterhaltung der Kultur unter den gleichen Bedingungen bis Fibroblasten auf etwa 80% Konfluenz gezüchtet.
   12. Sammeln Fibroblasten durch Trypsinisierung und Transfer auf frische Kulturflaschen für weitere Expansion. Führen Trypsinierung entfernt, indem die Kulturen 3-mal in 1x PBS frei von Ca ⁺⁺ und Mg ^++. Hinzufügen Trypsin-EDTA (siehe Materialien Table) zu den Zellen (2 ml / T25-Kolben) für 2 min bei 37 ° C.
   13. Split abgelösten Zellen in zusätzliche Kolben. Wenn einige Gewebestücke bleiben an der ursprünglichen T25-Kolben angebracht ist, mit 5 ml frischem Kulturmedium, um diesen Kolben und Fibroblasten erfolgt kontinuierlich zu migrieren.
       HINWEIS: Der expandierte Fibroblastenkultur setzt sich wie P1 eingefroren und in flüssigem Stickstoff für zukünftige Experimente gelagert werden.

2. Immortalisierung von myogenen Zellen

1. Futterzellen 30 min vor der Transfektion mit 5 ml frischem Medium mit 10 mM Koffein ergänzt.
2. Homogenisieren einer Mischung von 2 ug Plasmid-DNA aus einem Midi prep (CDK4 oder hTERT-Plasmid) und Polyjet und Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min, wie vom Hersteller empfohlen.
3. Fügen Sie das Plasmid / PolyJet Mischung auf die PE-Zellen über Nacht.
4. Feed-Zellen mit frischem Medium (DMEM und Medium 199 in einem Verhältnis von 4: 1, das mit 10% Kälberserum). Zwölf Stunden später sammeln das virushaltige Überstand und filtern sie durch ein 0,45 um Porengrße-Filter.
5. Verwenden von 1 ml Überstand gesammelt, über Nacht amphotropen Verpackungszelllinie PA317 ⁵ infizieren und zu einem stabilen Virus-produzierenden Zelllinie nach der Selektion mit entweder 0,5 mg / ml Neomycin (G418) für CDK4 oder 0,5 mg / ml Hygromycin hTERT.
6. Bereiten Sie Arbeits viralen Überständen durch Wachstum der stabilen Verpackungszellen in der Nähe der Konfluenz, dann die Ernte der Überstand jeden Morgen, Abend und Morgen für drei Ernten.
7. Filtern Sie die Virusüberständen und entweder direkt verwenden oder teilen sie in 1 ml Aliquots und bei -80 ° C für die spätere Verwendung. Beachten Sie, dass Virusüberstand verliert 50% Infektionseffizienz bei jedem Frost-Tau. Denken Sie daran, die Bleichmittel waschen vor dem Wegwerfen alles, was der Viruspartikel berührt hat.
   HINWEIS: Die stabile PA317 Virus-produzierende Zelllinie kann eingefroren und bei -150 ° C für die dauerhafte Speicherung beibehalten werden (Einfriermedium 10% DMSO, 90% Serum).
8. Platte FACS-gereinigte myogenen Zellen in einer Dichte von 5 x 10 ⁴ Zellen / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen mit 0,1% Gelatine beschichtet (in Schritten 1.1-1.9 beschrieben). Sicherzustellen, dass die Zellen an der Platte vor der Virusinfektion hend angebracht.
9. Fügen Sie 400 ul gefiltert, freshly produzierte Virusüberstand oder gefrorenen Aliquots zu jedem Sechs-Well-Platte über Nacht (halten 2 Brunnen als Kontrollen).
10. Ändern Medium durch Zuführen Zellen mit 2,5 ml / Vertiefung frisches Muskelmedien (4: 1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Medium 199 mit 15% fötalem Rinderserum, 0,02 M HEPES-Puffer, 1,4 mg / l Vitamin B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / l Dexamethason, 2,5 ug / l Hepatozytenwachstumsfaktor und 10 ug / l basic fibroblast growth factor). Entsorgen Sie die Medien und Pipetten, die die Viruspartikel in einem Bleichbehälter. Lassen Zellen im gleichen Medium für 3 Tage, um vor Infektionen zu erholen, dann behandeln Sie zur Auswahl entweder mit 400 ug / ml Neomycin (CDK4 Infektion) oder 300 ug / ml Hygromycin (hTERT-Infektion).
11. Pflegen Zellen unter Medikamentenauswahl, bis die Zellen in der Kontrollschale Matrize (1-2 Wochen).
12. Passage-Zellen bevor sie konfluent werden (60-80% Konfluenz, unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA), selbst während der selectinach Zeitraum. Ausstrich Zellen in mehreren 10cm Gerichte mit frischen Myoblasten-Medium (wie in 2.11 beschrieben) mit der Auswahl Medikament ergänzt. Pflegen immortalisierten ausgewählte Zellen als heterogene Population oder klonieren, um eine vollständig homogene genetischen Hintergrund (das gleiche Insertion des Transgens in jeder Zelle) zu erhalten.
13. Führen klonalen Selektion mit den folgenden Schritten:
    1. Samen der Zellen bei niedriger Dichte (zB 300 bis 500 Zellen in 10 cm-Schalen) und halten sie für etwa zwei Wochen, bis kleine Kolonien werden (10-20 Zellen) gebildet.
    2. Verringert sich die Medium an dieser Stelle, so dass nur eine dünne Folie, die Zellen nicht austrocknen.
    3. Legen Sie ein Klonen Ring (mit einem Ende eingetaucht in Silikonvakuumfett) über jeden gewünschten Klon und ein paar Tropfen von Trypsin / EDTA.
    4. Ernten Sie die Zellen, wenn sie geworden durch vorsichtiges Absaugen der Zellen unter Verwendung einer 1 ml Spitze oder eine Pasteur-Pipette und ihre Übertragung auf dem kleinsten verfügbaren Multiwell-pla abgerundette (96 oder 48, 24 oder 12-Well-Platten).
    5. Erweitern Klone wie notwendig, um lokale Konfluenz zu verhindern.

Representative Results

1 zeigt einige der Hauptschritte in der Primär Gewebedissoziation beteiligt: ​​die genaue Menge an Gewebe in einem sterilen Gewebekulturpetrischale eingewogen (1A, B). Das Gewebe wird dann fein zerkleinert unter Verwendung von sterilen Skalpellen, bis eine Gewebe Aufschlämmung erhalten (1C, D). Nach der Zugabe der Verdauungsenzyme, primäre Muskelgewebe Dissoziation wird üblicherweise durch enzymatische Verdauung innerhalb 45-90 min erreicht wird. Das Fortschreiten der Gewebe Verdauung wird in der Regel überwacht jede 15-20 Minuten zu overdigestion und Zelltod zu verhindern. Die enzymatische Verdauung sanft pipettiert werden und ein paar Mal gemischt alle 15-20 min. Am Ende der Verdauungsschritt werden die Zellen durch ein 100 um (1E, F) und einer 40 & mgr; m-Filter filtriert. Abhängig von der Menge an Ausgangs Muskelgewebe und ob die Probe von leicht oder schwer betroffenen Muskel des dissoziierten Primär cel erhaltenenls wird heterogen sein. 1G zeigt ein Beispiel von mononuklearen Zellen in Suspension unmittelbar im Anschluss an die Verdauung, während Figur 1H zeigt ein Beispiel dissoziiert primären Zellen 3-6 Stunden nach der Verdauung und Plattieren in Gewebekulturschalen. Myogenen Zellen werden üblicherweise mit Fibroblasten und adipogenen Zellen gemischt werden. Immunzellen können auch in Fällen, in denen eine Entzündung mit einer Erkrankung des Patienten assoziiert sind, vorhanden sein. Daher könnte angeh Trennung der verschiedenen Zelltypen wünschenswert sein. Für angeh Isolierung menschlicher myogenen Zellen, CD56 oder N-CAM wurde weithin als zuverlässiger Marker ^6-9 verwendet. Diese Reinigung kann kurz nach der Trennung zur Anreicherung myogene Vorläuferzellen und vor dem Zellimmortalisation Prozess von Vorteil sein. Alternativ kann die Immortalisierung von primären Zellen zuerst durchgeführt werden, können dann immortalisiert myogenen Zellen basierend auf der Expression von CD56 durch FACS ausgewählt werden. Eine schematische aufdie vor der FACS-Sortierung und ein Beispiel für eine FACS-Profil erforderlichen Schritte ist in Figur 2 veranschaulicht. Kurz gesagt, werden primäre Zellen gezählt und in hoher Konzentration, wie angegeben, dann wird der primäre Antikörper (dh anti CD56) zugegeben, um die Zellen und inkubiert resuspendiert für 30 Minuten auf Eis. Nach einem Waschen werden die Zellen durch einen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer analysiert und (Figur 2) .Das ungefähre Ausbeute von CD56 positiven Zellen variiert von Probe zu Probe, im Bereich von 40-70% der gesamten mononuklearen Zellen gereinigt. Die Ausbeute hängt von dem Alter des Individuums abhängig ist und ob myogenen Zellen aus nicht-betroffene oder erkrankte Muskel extrahiert. Nicht betroffene Muskel hat in der Regel hohen Anteil von myogenen Zellen, während dystrophischen Muskel hat oft niedriger Prozentsatz der CD56-positiven Zellen. Die gereinigten Zellen in myogenen komplette Wachstumsmedium (siehe Werkstoff-Tabelle). Zellen durch Trypsinisierung agiert werden, wenn sie Reach 60-70% Konfluenz. CD56 exprimierenden Zellen myogenen und zur Bildung Myotuben in vitro ^10,11 .Die Immortalisierung von myogenen Zellen erfordert die sequentielle Transfektion von zwei Genen ^12,13 (wie in Figur 3 schematisch dargestellt). Cyclin-abhängige Kinase 4 (CDK4) verwendet wird, um die Spannung der Gewebekultur zu überwinden aufgrund unzureichender Kulturbedingungen und menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT) verhindert Verkürzung der Telomere aufgrund der End-Replikation Phänomen ^12. Beide vorge virale Plasmide sind in der pBabe Rückgrat Vektor. Die Maus CDK4 cDNA Konstrukt enthält das Neomycin-Resistenzgen und hTERT cDNA Konstrukt das Hygromycinresistenzgen enthält. Letztere enthält auch eine Herpes Simplex Virus Thymidin-Kinase (TK) Kassette und loxP-Stellen in den beiden Enden des hTERT / TK-Kassette gegeben. Dies ermöglicht die Entfernung der gesamten Expressionseinheit durch die Cre-Rekombinase ¹⁴ und Gegenselektion mit Gancyclovir.

Neu immortalisierten Zellen können als eine Population in dem die Viren in unterschiedlichen Stellen integriert, geklont oder beibehalten werden, um eine vollständig homogene genetischen Hintergrund (single Einsetzen in das Zellgenom und ihre Nachkommen) zu erhalten. In den meisten Fällen, Isolieren von Klonen von einer Haupt Bevölkerung ergibt geringe Unterschiede zwischen den Klonen in Abhängigkeit vom Einsetzen der Kassette in das Zellgenom. Außerdem werden umfangreiche Gewebekultur Selektion von Zellen mit Wachstumsvorteil eher als diejenigen, die Differenzierung zu fördern. Ich(300 bis 500 Zellen in 10-cm-Schalen z) und Kultivieren für etwa zwei Wochen, bis kleine Kolonien werden (10-20 Zellen) gebildet solation einzelner Klone wird einfach durch Impfen Zellen bei geringer Dichte durchgeführt. Der größte Teil des Mediums wird dann entfernt, so dass nur eine dünne Folie, die Zellen nicht austrocknen. Klone werden mit Klonierungsringen Trypsin behandelt und dann nach Bedarf erweitert. Expanded immortalisierten Klone können zur Expression von gemeinsamen myogene Zellmarker, wie CD56 durch FACS, Desmin und MyoD Expression durch Immunfluoreszenz oder Myotuben Bildung bei Differenzierung getestet werden. Myotuben sind am deutlichsten, wenn konfluenten myogenen Zellen (90% Konfluenz) in Differenzierungsmedium (DMEM und Medium 199 in einem Verhältnis von 4: 1 mit 2% Pferdeserum) gegeben nach 3-5 Tagen (Abbildung 4). Es wurden keine Unterschiede in Myotuben Bildung und in Myotuben Kontraktionsfähigkeit zwischen nicht-immortalisierten Kontrollzellen und immortalisierten Zellen gesehen (Video 1 und 2).

(5) untersucht werden. Beispiele von Wachstumskurven sind in Figur 5A, wo die Verkürzung der Telomere wurde beobachtet, als Zellen wurden für erweiterte Anzahl von Passagen erweitert dargestellt. Umgekehrt wird erfolgreichen Immortalisierung mit erhöhter Telomeraseaktivität zugeordnet (Figur 5)

Abb. 1:. Die Abbildungen der wichtigsten Schritte für die Dissoziation von primären menschlichen Muskelgewebe (A) Mit einem Gewicht des leeren Kulturplatte, vor der Platzierung und Gewebe (B) nach der Platzierung des Gewebes (C) Sterile Skalpelle werden verwendet, um das Blatt vor den Mund Gewebe, bis (D), das Gewebe istSelbst zu einer Aufschlämmung reduziert. Collagenase und Dispase zugegeben und Gewebe wird für 45-90 min verdaut, dann der Verdauung wird durch ein Nylonmaschenfilter filtriert, um Fremdkörper (E, F). (G, H) Beispiele von frisch gewonnenen Zellen unmittelbar nach der Dissoziation plattiert (G verwerfen ) oder 3 Stunden nach der Dissoziation, wenn Primärzellen beginnen zu begleichen (H).

Abb. 2: Arbeitsablauf von Verfahren über Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer in der menschlichen Myoblasten Färbung vor der Reinigung beteiligt Die entscheidenden Schritte für die Färbung von menschlichen Zellen vor der FACS-Analyse werden hervorgehoben. Beispiele für FACS Stücke sind ebenfalls dargestellt. Die negative Kontrolle (linkes Feld) verwendet wird, um die Weiche zu schaffen. Im rechten Fenster werden positive Zellen, die CD56 gated und die Percentage positiver Zellen dargestellt. Diese Strategie kann verwendet werden, um myogenen Zellen entweder vor oder nach der Immortalisierung Immortalisierung Verfahren aufzureinigen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Virusproduktion für Myoblasten Immortalisierung. Workflow des Retrovirus Produktion verwendet werden, um die Myoblasten zu verewigen. Ein Plasmid Konstrukt, das entweder CDK4 oder die floxed hTERT-TK-Kassette in einer pBabe Backbone (links) in die Phoenix ecotrope transfiziert (PE) Verpackungszelllinie über Nacht (8-12 h) mit PolyJet. Der Überstand wird dann nach der Filtration auf die Phoenix amphotropen Verpackungszelllinie (PA317) übertragen. Der Überstand aus diesen Zellen kann entweder direkt verwendet werden oder die Zellen können entweder mit Neomycin oder Hygromycin selektiert werden, um eine stabile Zelllinie für die zukünftige Verwendung zu erzeugen. Aliquote der filtEred Überstand bei -80 ° C für eine spätere Verwendung (mit einem Verlust an Wirkungsgrad von 50%) gelagert werden. Bleichmittel wird verwendet, um jeden verbrauchbaren an allen Punkten des Verfahrens eingesetzt reinigen.

Abb. 4: Schematische Darstellung der reversiblen Immortalisierung Myoblasten-Workflow der Immortalisierung Verfahren (oben): Primäre Zellen zunächst mit CDK4 transfiziert. Nach Neomycin Auswahl werden die Myoblasten mit einem floxed hTERT Kassette, die zwei Selektionsmarker transfiziert; HSV-TK und Hygromycin. Wenn zu einem späteren Zeitpunkt gewünscht, kann der hTERT-Kassette "floxed" werden durch Cre-Rekombinase exprimieren und die Auswahl für die Exzision mit Gancyclovir. Dies ermöglicht die "Wieder mortalization" der Myoblasten und die Wiederaufnahme der Verkürzung der Telomere. Wenn die Telomere sind 20 kb lang, das noch erlaubt Hunderte von Verdoppelungen und vermeidet t er Komplikation der Überexpression von hTERT. Schließlich kann isogenen Klone aus der immortalisierten Population isoliert werden. Die myogenicity der neu immortalisierten Zellen können anhand spezifischer Marker der Muskelzellen wie Desmin (unten links Panel, Zellen in Wachstumsmedium mit anti-Desmin, Klon D33 gefärbt, grün) angezeigt. Dieser Klon ist so myogenen dass differenzierte Zellen zu sehen sind, auch wenn Zellen in Proliferationsbedingungen aufrechterhalten. Wenn die Zellen in Differenzierungsmedium (mit 2% Pferdeserum, mittlere und rechte Bilder) unterschieden Myotuben Bildung wird sehr umfangreich. Fast alle Zellen mit dem MF20 Antikörper an embryonalen Myosin schwere Kette (grün) und Myotuben befleckt haben mehrere Kerne mit DAPI-Färbung (blau, Alle Bilder). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 5: Überprüfung der Immortalisierung Verfahren. (A) Wachstumskurven von Isogene Klone aus primären Myoblasten, unsterblich Bevölkerung (Myoblasten hTERT-CDK4) und Re-Mortalized clone (Myoblast floxed hTERT-CDK4) sind nur beispielhaft. Keine Unterschiede in den Wachstumsraten nachweisbar waren, bevor die Zellen Seneszenz erreichen. Verkürzung der Telomere wurde als Funktion der Populationsverdopplungen und Telomerlänge durch TRF gemessen (B) TRF stellen Beispiele von frühen Zeitpunkten und späten Replikation in Myoblasten (5 Zeitpunkte von Pd 13 bis 75), Wieder Mortalized Myoblasten nachdem überwacht. hTERT Exzision (3 Zeitpunkten von PD 62-152) und verewigt Myoblasten (PD 75 und 200). (C) Erfolgreiche hTERT-Infektion führt zu einer Erhöhung der Telomerase-Aktivität. ¹⁵ in Zellen vor und nach Hte; Telomerase-Aktivität wurde durch ddTRAP (Quantifizierung des Assays linken ddTRAP Auslese, rechts) beurteiltRT-Infektion. hTERT Exzision abgeschafft Telomerase-Aktivität auf den ursprünglichen Schwellenwert in Myoblasten zu sehen. Die Ergebnisse werden als Gesamt Telomerase Produkte pro Zelle Äquivalent (Hintergrundkorrektur) erzeugten angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
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Videos 1 und 2. Myotuben wurden aus den Zellen vor und nach der Immortalisierung Prozesses erzeugt. Zellen wurden in Wachstumsmedium Konfluenz und geschaltet Differenzierungsmedium für 10 Tage. In beiden Videos, sind funktionelle Kontraktionen eines oder mehrerer Myotuben nachweisbar. Die Aufnahme der spontanen Zuckungenwurde mit einem 20-fach-Objektiv erfolgen. Zwischen immortalisiert und nicht-immortalisierte Zellen wurden keine Unterschiede beobachtet.

Discussion

Cells als Nützliche Ressource

Die Isolierung und Kultivierung von myogene Zellpopulationen ist äußerst nützlich bei der Festlegung Krankheitsphänotypen oder in vitro-Modelle von Erkrankungen. Die hier beschriebene myogenen Zellisolierungsverfahren erlaubt die Isolierung von Myoblasten und Fibroblasten aus der Skelettmuskulatur Proben, die dann weitergegeben werden können, unterschieden, oder sofort analysiert. Myoblasten Struktur und Funktion kann durch mikroskopische Untersuchung Auswertung des Zellüberlebens, Bewertung der Zellfusion oder durch molekularbiologische Untersuchungen von RNA oder Protein-Expression zu beurteilen. Zusätzlich kann Myoblasten Myotuben, die viele Merkmale von unreifen Muskelfasern, die die direkte Bewertung der Myoblasten-Funktion im Zusammenhang mit der Entwicklung der Muskulatur und Erholung nach Gewebeschäden ermöglicht teilen unterschieden werden. Während alle diese Phänotypen neigen in frühen Passagen von myogenen Zellen ziemlich reproduzierbar sein, das Verhalten vieler Primär mim Laufe von mehreren Stellen kann yogenic Zelllinien verändert werden. Infolgedessen ist es manchmal wünschenswert, eine gegebene myogene Zelllinie immortalisieren (wie hier beschrieben), was die Leichtigkeit der Kultur Einrichtung und die Erzeugung reproduzierbarer Ergebnisse über einen längeren Zeitraum zu erleichtern kann.

Die Auswahl der spezifischen Zellpopulationen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von myogenen Zellen von Skelettmuskelgewebe mit FACS als Reinigungsschemas. Die vorgeschlagene Strategie zur Auswahl von Zellen umfasst mit Propidiumiodid (als Indikator für tote Zellen) und CD56 (ein Marker von myogenen Zellen) zu leben, myogenen Zellen von toten Zellen, Debris und nicht-myogene Zellen zu differenzieren. Zellen im CD56 positiven Population enthaltenen gehören myogenen Vorläuferzellen zur Bildung von Myotuben, während die CD56-negative Population nicht-myogenen Zellen, einschließlich Fibroblasten und möglicherweise adipogene Zellen schließen. Jede dieser Fraktionen kannwerden unabhängig kultiviert, um Zellkulturen von Myoblasten und Fibroblasten, und das Potenzial zu produzieren, um parallel Fibroblasten-Zellkulturen zu etablieren kann für unabhängige Zelle oder DNA-Banking-Übungen oder als zusätzliche Kontrollbedingungen für Assays, die auf den myogenen Zellkulturen durchgeführt werden. Es gibt verschiedene andere Möglichkeiten für die Auswahl von spezifischen myoblastischer und fibroblastische Zellkulturen aus verdauter Muskelgewebe, in Fällen, in denen FACS-Sortierung ist nicht wünschenswert oder nicht verfügbar ist, die an anderer Stelle ^16,17 beschrieben sind. Eine alternative Methode zur myoblastischer und fibroblastischen Zellen abzutrennen beinhaltet die Verwendung von differentiellen Hafteigenschaften zwischen diesen zwei Zelltypen, um aufeinanderfolgende Passagen der Zellen für einen gegebenen Zelltyp zu bereichern. Fibroblasten haften Kunststoff viel leichter als Myoblasten, wodurch die Zellsuspensionen auf Kunststoff für etwa 1 h Inkubieren bei der Einführung oder Passagieren der Zellen und dann Überziehen des Überstands auf eine andere Schale wird result bei der Entfernung vieler Fibroblasten aus der Zellsuspension ^18.

Dienstprogramm von Fibroblasten vs. Myoblasten

Muskelbiopsien von Patienten werden üblicherweise zur Reinigung von Primär Muskelzellen verwendet, aber erkrankten Myoblasten nicht effektiv zu vermehren und kann nur eine geringe Anzahl von Unterteilungen in vitro unterzogen werden, und erfordern somit Zellimmortalisation um die hohe Anzahl von Teilungen notwendig erreichen. Da sowohl Fibroblasten und Myoblasten aus Muskelbiopsien isoliert werden, sollten beide Zellfraktionen aus Patientenproben gespeichert werden, da sie sowohl nützlich und bieten viel Flexibilität für Downstream-Anwendungen. Zum Beispiel können Fibroblasten für die Erzeugung von pluripotenten Stammzellen (iPS), die vielversprechend halten, um unbegrenzte Zellzahlen und das Potential zu erzeugen verwendet werden, dazu gebracht werden, in eine Vielzahl von Zelllinien zu differenzieren. Diese Eigenschaften sind für die Zellen von Patienten gewonnen höchst wünschenswerts mit seltenen Krankheiten, die möglicherweise in vitro korrigiert oder in experimentellen Drogenscreenings auf der Suche nach therapeutischen Verbindungen verwendet werden kann. Verewigt Myoblasten kann auch in Drogen-basierte Screening verwendet werden. Fibroblasten kann auch effektiv in Richtung einer myogenen Schicksal durch Infektion mit einem Virus, das MyoD ^19-21 umgewandelt werden. Diese Methode ist effektiv mit Fibroblasten aus Patienten mit Muskelerkrankungen extrahiert getestet und bestätigt, dass MyoD-exprimierenden Fibroblasten wirksam Myotuben, die reife Muskelproteine ​​exprimieren bilden. Somit können beide Zelltypen effektiv in mehrere untergeordnete Anwendungen verwendet werden und liefern wertvolle Material für diagnostische und therapeutische Studien.

Auswirkungen der Immortalisierung

Die Immortalisierung von normalen diploiden Zellen ermöglicht es, eine stabile menschliche Zelllinie, die vollständig charakterisiert werden können und studierte von vielen verschiedenen Labors vorzubereiten. Primärkulturen von unabhängigenIsolierungen kann variieren und ihre allgemeine proliferative Kapazität kann variabel sein, wenn ein Schaden in der Dissoziation oder durch overdigestion, die die Kultur Verhalten verzerren eingeführt. Die Immortalisierung von Zellen unter Verwendung der Expression der katalytischen Untereinheit der Telomerase (hTERT) hat den Vorteil, einen stabilen zellulären Phänotyp aufrechtzuerhalten, und die Zellen bleiben diploid. Es gibt Berichte, bei Mäusen, dass die Telomerase die Wnt-Signalweg ²² zu modulieren. Wir haben dieses Phänomen nicht in menschlichen Zellen beobachtet. Um jedoch eine solche potentielle Komplikation zu vermeiden, hat die hTERT Kassette mit lox-Stellen flankiert ist, so dass es entfernt werden kann, nachdem die Telomere wurden gedehnt. Lange Telomere verleihen Hunderte von zusätzlichen Abteilungen, in der Regel ausreichend für die Durchführung die meisten Experimente.

Da kontinuierliche Zellexpansion immer einen Selektionsvorteil für ein schnelles Wachstum kann der zelluläre Phänotyp gelegentlich Richtung vorgespannt wird durch übermäßiges Wachstum der meisten schnell teilZellen, und nicht die besten differenzierenden Zellen. Während dies ist noch nicht erwiesen, ein erhebliches Problem mit dem beschriebenen Verfahren, kann es durch Auftauen Zellen, die am Anfang ihrer Kulturgeschichte oder durch klonale Selektion für die Zellen, die den gewünschten Phänotyp eingefroren worden sind, behoben werden können.

Schließlich, während die Expansion der myogenen Zellen in der Nähe von unbegrenzter Zahl hat Vorteile für Wirkstoff-Screening und mögliche Krankheitsmodelle haben die gegenwärtigen Techniken auch intrinsische Nachteile, die die Verwendung dieser Zellen als therapeutische Fahrzeuge in zellbasierte Therapie oder als Primärdiagnosewerkzeuge zu verhindern. Sowohl die umfangreichen in-vitro-Kultur und Immortalisierung Schritte ändern Sie den Phänotyp der Muskelzellen im Vergleich zum nativen Zustand. Wichtig ist, dass diese Zellen in einer Umgebung, die sehr verschieden von dem natürlichen Milieu primäre Satellitenzellen innerhalb der Nische ist erweitert. Daher immortalisierten Zellen erfordern intensive Sicherheitsprüfung und möglicherweise development neuer Techniken, wenn sie zu Muskeln menschlichen Patienten wieder eingeführt werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010